Summary
Un protocollo di estrazione del genoma guidato dalla spettrometria di massa è stabilito e descritto qui. Si basa sulle informazioni sulla sequenza genomica e sull'analisi LC-MS/MS e mira a facilitare l'identificazione di molecole da complessi estratti microbici e vegetali.
Abstract
Lo spazio chimico coperto da prodotti naturali è immenso e ampiamente non riconosciuto. Pertanto, sono desiderate metodologie convenienti per eseguire una valutazione ad ampio raggio delle loro funzioni in natura e potenziali benefici umani (ad esempio, per applicazioni di scoperta di farmaci). Questo protocollo descrive la combinazione di estrazione del genoma (GM) e networking molecolare (MN), due approcci contemporanei che corrispondono alle annotazioni con codifica a cluster genico nel sequenziamento dell'intero genoma con le firme della struttura chimica da estratti metabolici grezzi. Questo è il primo passo verso la scoperta di nuove entità naturali. Questi concetti, se applicati insieme, sono qui definiti come estrazione genomica guidata da MS. In questo metodo, i componenti principali sono designati in precedenza (utilizzando MN) e i nuovi candidati strutturalmente correlati sono associati alle annotazioni della sequenza del genoma (utilizzando GM). La combinazione di GM e MN è una strategia redditizia per colpire nuove spinadorsali molecolari o raccogliere profili metabolici al fine di identificare analoghi da composti già noti.
Introduction
Le indagini sul metabolismo secondario spesso consistono nello screening di estratti grezzi per specifiche attività biologiche seguite da purificazione, identificazione e caratterizzazione dei costituenti appartenenti a frazioni attive. Questo processo si è dimostrato efficiente, promuovendo l'isolamento di diverse entità chimiche. Tuttavia, al giorno d'oggi questo è visto come irrealizzabile, principalmente a causa degli alti tassi di riscoperta. Come l'industria farmaceutica rivoluzionato senza conoscenza dei ruoli e le funzioni di metaboliti specializzati, la loro identificazione è stata effettuata in condizioni di laboratorio che non rappresentavano con precisione la natura1. Oggi, c'è una migliore comprensione delle influenze di segnalazione naturale, secrezione, e la presenza della maggior parte degli obiettivi a concentrazioni non rilevabili basse. Inoltre, la regolamentazione del processo aiuterà la comunità accademica e l'industria farmaceutica a trarre vantaggio da queste conoscenze. Ne beneficeranno anche la ricerca che coinvolgerà l'isolamento diretto dei metaboliti legati ai cluster genici biosintetici silenziosi (BCC)2.
In questo contesto, i progressi nel sequenziamento genomico hanno rinnovato l'interesse per i metaboliti dei microrganismi di screening. Questo perché l'analisi delle informazioni genomiche degli ammassi biosintetici scoperti può rivelare geni che codificano nuovi composti non osservati o prodotti in condizioni di laboratorio. Molti progetti o correnti d'aria microbici dell'intero genoma sono oggi disponibili, e il numero è in crescita ogni anno, fornendo enormi prospettive per scoprire nuove molecole bioattive attraverso l'estrazione del genoma3,4.
L'Atlante dei cluster di geni biosintetici è la più grande collezione di cluster genici estratti automaticamente come componente della piattaforma integrata dei genomi microbici del Joint Genome Institute (JGI IMG-ABC)2. Più recentemente, la Minimum Information for Biosynthetic Gene Clusters (MIBiG) Standardization Initiative ha promosso la riannotazione manuale dei BMC, fornendo un set di dati di riferimento altamente curato5. Al giorno d'oggi, sono disponibili molti strumenti per consentire l'estrazione computazionale dei dati genetici e la loro connessione ai metaboliti secondari noti. Sono state inoltre sviluppate diverse strategie per accedere a nuovi prodotti naturali bioattivi (ad esempio, espressione etetologa, cancellazione genica mirata, ricostituzione in vitro, sequenza genomica, screening guidato da isotopi [approccio genomitopico], manipolazione delle autorità di regolamentazione locali e globali, estrazione basata su target di resistenza, estrazione indipendente dalla cultura e, più recentemente, approccio al codiceMS 2,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15).
L'estrazione del genoma come strategia singolare richiede sforzi per annotare un singolo o un piccolo gruppo di molecole; pertanto, permangono lacune nel processo in cui i nuovi composti sono prioritari per l'isolamento e la chiarificazione della struttura. In linea di principio, questi approcci si rivolgono a un solo percorso biosintetico per esperimento, con conseguente rallentamento del tasso di scoperta. In questo senso, l'utilizzo di GM insieme a un approccio di rete molecolare rappresenta un importante progresso per la ricerca sui prodotti naturali14,15.
La versatilità, la precisione e l'elevata sensibilità della spettrometria cromatografica-massa liquida (LC-MS) lo rendono un buon metodo per l'identificazione composta. Attualmente, diverse piattaforme hanno investito algoritmi e suite software per metabolomica non mirata16,17,18,19,20.20 Il nucleo di questi programmi include il rilevamento delle funzionalità (picco di raccolta)21 e l'allineamento di picco, che consente la corrispondenza di funzionalità identiche in un batch di campioni e la ricerca di modelli. Gli algoritmi basati su modelli MS22,,23 confrontano i modelli di frammentazione caratteristici e corrispondono alle somiglianze ms2 generando famiglie molecolari che condividono caratteristiche strutturali. Queste caratteristiche possono quindi essere evidenziate e raggruppate, conferendo la capacità di scoprire rapidamente molecole note e sconosciute da un complesso estratto biologico in tandem MS2,24,25. Pertanto, la SM in tandem è un metodo versatile per ottenere informazioni strutturali su diversi chemiotipi contenuti contemporaneamente in una grande quantità di dati.
L'algoritmo Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS)26 utilizza l'intensità degli ioni di frammento normalizzati per costruire vettori multidimensionali, in cui le somiglianze vengono confrontate utilizzando una funzione coseno. La relazione tra i diversi ioni padre viene tracciata in una rappresentazione del diagramma, in cui ogni frammentazione viene visualizzata come nodo (cerchi) e la correlazione di ogni nodo è definita da uno spigolo (linee). La visualizzazione globale delle molecole provenienti da un'unica fonte è definita come una rete molecolare. Molecole strutturalmente divergenti che si frammentano in modo univoco formeranno il proprio ammasso o costellazione specifica, mentre le molecole correlate si raggruppano. I chemiotipi di clustering consentono l'ipotetica connessione di caratteristiche strutturali simili alle loro origini biosintetiche.
La combinazione di approcci chemiotipo-genotipo e genotipo è potente quando si creano collegamenti bioinformatici tra BCC e i loro piccoli prodotti molecolari27. Pertanto, l'estrazione del genoma guidata dalla MS è un metodo rapido e una strategia a basso consumo di materiali e aiuta a colmare gli ioni dei genitori e le vie biosintetiche rivelate dal WGS di uno o più ceppi in diverse condizioni metaboliche e ambientali.
Il flusso di lavoro di questo protocollo (Figura 1) consiste nell'inserire i dati WGS in una piattaforma di annotazione del cluster di geni biosintetici come antiSMASH28,29,30. Aiuta a stimare la varietà di composti e la classe di composti codificati dal genoma. Deve essere adottata una strategia per colpire un cluster di geni biosintetici che codifica un'entità chimica di interesse, e gli estratti di coltura da un ceppo di tipo selvaggio e/o ceppo eteboloso contenente il BGC possono essere analizzati per generare ioni raggruppati in base alle somiglianze utilizzando GNPS26,31. Di conseguenza, è possibile identificare nuove molecole che si associano al BGC mirato e non sono disponibili nel database (principalmente analoghi sconosciuti, a volte prodotti in elementi bassi). È importante considerare che gli utenti possono contribuire a queste piattaforme e che la disponibilità di bioinformatica e dati MS/MS sta aumentando rapidamente, spingendo a uno sviluppo costante e l'aggiornamento di strumenti e algoritmi computazionali efficaci per guidare connessioni efficienti di estratti complessi con molecole.
Figura 1: Panoramica dell'intero flusso di lavoro. È mostrato un'illustrazione delle fasi bioinformatiche, clonazione e networking molecolare coinvolte nell'approccio descritto nell'estrazione del genoma guidato dalla Ms per identificare nuovi metaboliti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Questo protocollo descrive un flusso di lavoro rapido ed efficiente per combinare l'estrazione del genoma e la rete molecolare come punto di partenza per la pipeline di scoperta naturale dei prodotti. Anche se molte applicazioni sono in grado di visualizzare la composizione e la relatedness delle molecole rilevabili dalla MS in una rete, diverse sono adottate qui per visualizzare molecole raggruppate strutturalmente simili. Utilizzando questa strategia, vengono identificati con successo nuovi prodotti ciclodepsipeptide osservati negli estratti metabolici di Streptomyces sp. CBMAI 2042. Guidato dall'estrazione del genoma, l'intera codifica del cluster genico biosintetico per le valiomiciche è riconosciuta e clonata nel ceppo produttore Streptomices coelicolor M1146. Infine, a seguito di una rete molecolare basata su modelli di SM, le molecole rilevate dalla SM sono correlate con i BMC responsabili della loro biogenesi32.
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Protocol
1. Estrazione del genoma per cluster genici biosintetici
- Eseguire il sequenziamento dell'intero genoma (WGS) come primo passo per eleggere un cluster genico biosintetico (BCG) per l'estrazione del genoma guidata dalla MS. L'intero genoma del ceppo di interesse (batteri) può essere ottenuto dalla tecnologia Illumina MiSeq utilizzando quanto segue con DNA genomico di alta qualità: fucile TruSeq PCR-Free library prep e Nextera Mate Pair Library Preparation Kit33.
NOTA: dopo la sequenza, è possibile assemblare la libreria del fucile Illumina e la libreria della coppia di accoppiamenti Illuminazione utilizzando Newbler v3.0 (Roche, 454) programma assembler (disponibile all'indirizzo - Per ottenere in silico informazioni sul metabolismo secondario cluster annotazioni da un genoma sequenziato completo, inviare il file di sequenza (formato GenBank/EMBL o FASTA) a una piattaforma antiSMASH (trovato a
- Selezionare il cluster genico di interesse dai dati di output (Figura 2) in base al cluster conosciuto più simile.
NOTA: In primo luogo, è di routine esplorare gene per gene e condurre ricerche individuali (blastp) per valutare quali funzioni sono associate ai gruppi genici biosintetici desiderati. Questa procedura può anche aiutare a determinare quale BGC è probabilmente associato con la produzione di un composto desiderato, anche se si tratta di una percentuale bassa. Una previsione antiSMASH considera tutti i geni all'interno di un cluster per fare una copertura percentuale, che può rappresentare una bassa percentuale globale di somiglianza per il BGC mirato. Tuttavia, quando si analizza gene per gene, è possibile ottenere informazioni più accurate utilizzando il cluster conosciuto più simile. In secondo luogo, antiSMASH ha due opzioni per affinare una ricerca: 1) rigore di rilevamento: il grado di rigore a cui il cluster genico biosintetico deve essere considerato un colpo. Per questa opzione, l'utente deve utilizzare i seguenti parametri: a) rigorosi: rileva cluster esclusivamente ben definiti contenenti tutte le regioni richieste, insuscettibile agli errori relativi alle informazioni genetiche; b) rilassato: rileva cluster parziali privi di una o più regioni funzionali, che funziona anche per rilevare la caratteristica rigorosa; o c) loose: rileva cluster e cluster mal definiti che probabilmente corrispondono ai metaboliti primari, il che può portare alla comparsa di falsi positivi o di BGC mal definiti. L'altra opzione è 2) caratteristiche extra: il tipo di informazioni che la piattaforma deve cercare e mostrare nell'output. In generale, queste due opzioni possono risparmiare tempo dopo la stima. Tuttavia, il lavoro antiSMASH richiede un periodo di tempo più lungo.
Figura 2: Output dalla piattaforma antiSMASH. Metabolismo secondario nell'analisi del silico dall'annotazione della sequenza dell'intero genoma. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Sulla base delle informazioni sulla sequenza del DNA del BGC, i primer di progettazione (20-25 nt) che fiancheggiano il cluster genico per lo screening della biblioteca ESAC (E. coli/Streptomyces Artificial Chromosome).
NOTA: diversi metodi35,36 possono essere utilizzati per catturare l'intero cluster genico biosintetico dal DNA. In questo caso, il metodo utilizzato è la costruzione di una biblioteca ESAC rappresentativa37,38 da Streptomyces sp. CBMAI 2042 contenente cloni con frammenti di dimensioni medie di 95 kb.
2. Espressione etetologa dell'intero cluster di geni biosintetici della biblioteca ESAC
- Spostare il vettore ESAC da E. coli DH10B a E. coli ET12567 con la coniugazione triparentale32.
- Inoclate A. coli ET12567 (CamR), TOPO10/pR9604 (CarbR), DH10B/ESAC4H (AprR) in 5 mL di Luria-Bertani (LB) mezzo contenente cloramramhenicol (25 g/mL), carbenicillina (100g/mL) e apramycina (50 g/mL).
- Incubare la coltura durante la notte a 37 e 250 giri/min.
- Inoculare 500 - L della coltura notturna in 10 mL di lB medio contenente una mezza concentrazione di antibiotici.
- Incubare la coltura a 37 e 250 giri/min fino a raggiungere un600 A di 0,4-0,6.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione a 2.200 x g per 5 min.
- Lavare le cellule due volte con 20 mL di lB medio.
- Risospendere le cellule in 500 , l di lB medio.
- Mescolare 20 l di ogni ceppo in un tubo di microcentrifuga e gocciolare in una piastra di agar con mezzi LB privi di antibiotici.
- Incubare le piastre a 37 gradi durante la notte.
- Streak le cellule coltivate su una piastra di agar LB fresca contenente antibiotici e incubare a 37 gradi centigradi durante la notte.
3. Streptomici/E. coli coniugazione
- Per ottenere l'organismo eterologia ricombinante, eseguire la coniugazione32 tra E. coli ET12567 contenente il vettore ESAC, il plasmid e l'aiutante pR9604 e streptomice coelique M1146 o un altro ceppo host selezionato39.
- Giorno 1: inoculare colonie isolate di S. coelicolor M1146 in 25 mL di mezzo TSBY in una fiaschetta Erlenmeyer da 250 ml dotata di una molla inossidabile a 30 e 200 rpm per 48 h.
- Giorno 2/3: Inoculare ET12567/ESAC/pR9604 in 5 mL di lB medio contenente cloramfenicolo (25 g/mL), carbenicillina (100g/mL) e apramicina (50 g/mL) durante la notte a 37 e 250 mL.
- Giorno 3/4: Inoculare 500 - L della coltura notturna in 10 mL di 2TY (in un tubo conico da 50 mL) contenente concentrazioni semi-lavoratrici di antibiotici. Incubare a 37 e 250 giri/min fino a raggiungere un600 A di 0,4-0,6.
- Centrifugare le colture (ET12567/ESAC/pR9604 e M1146) a 2200 x g per 10 min.
- Lavare i pellet 2x in 20 mL di mezzo 2TY e risospendere in 500 gradi l 2TY.
- Aliquota 200 L della s. coelicolor M1146 sospensione e diluire in 500 L di 2TY (sospensione A).
- Aliquota 200 - L di sospensione A e diluire in 500 -L di 2TY (sospensione B).
- Aliquota 200 - Dissoluta di sospensione B e diluita in 500 - L di 2TY (sospensione C).
- Aliquota 200 -L delle sospensioni ET12567/ESAC/pR9604 e mescolare con 200 - L di sospensione C.
- Piastra 150 -L della miscela di coniugazione su una piastra di agar SFM priva di antibiotici.
- Incubare a 30 gradi centigradi per 16 ore.
- Piastre di copertura con 1 mL di soluzione antibiotica (secondo la resistenza plasmide). Dopo l'essiccazione, incubare a 30 gradi centigradi per 4-7 giorni.
NOTA: Qui è stata preparata una soluzione contenente 1,0 mg/mL thiostrepton e 0,5 mg/mL di acido nalidixico. - Streak putative exconjugants su piastre di agar SFM contenenti thiostrepton (50 mg/mL) e acido nalidixic (25 mg/mL). Incubare a 30 gradi centigradi.
- Streak exjugants su un agar SFM contenente solo acido nalidixico.
- Eseguire l'analisi PCR con colonie isolate per confermare che l'intero cluster genico è stato trasferito all'ospite S. coelicolor M1146.
4. Coltivazione della deformazione
- Per ottenere il profilo metabolico, inoculare 1/100 della pre-coltura del ceppo in adeguati mezzi di fermentazione e nelle condizioni di coltura appropriate.
- Centrifuga colture a 2200 x g per 10 min.
- Eseguire l'estrazione in base alla classe del composto di interesse40.
5. Acquisizione di spettri di massa e preparazione per l'analisi GNPS
- Per acquisire i dati MS/MS, programmare i metodi HPLC e di spettrometria di massa adatti utilizzando il software di controllo. È possibile analizzare sia l'analisi della spettrometria di massa dipendente dai dati ad alta che a bassa risoluzione (DDA).
NOTA: Generalmente, una soluzione da 1 mg/mL di complessi campioni di estratti grezzi è l'ideale. Le diluizioni sono necessarie per estratti meno complessi. Va notato che la rete MS/MS è la rete molecolare rilevabile in base alle condizioni spettrometriche di massa specificate. - Convertire gli spettri di massa in formato .mzXML utilizzando MSConvert da Proteowizard (disponibile all'indirizzo
Figura 3: Utilizzo di MsConvert per convertire i file MS in mzXML estensione. Viene visualizzato il parametro corretto per l'analisi GNPS. Le istruzioni sono le seguenti: aggiungi tutti i file MS nella casella 1 e aggiungi il filtro Picco picking nella casella 2; per questo filtro, utilizzare il fornitore dell'algoritmo; premere start e seguiranno i processi di conversione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Caricare i file LC-MS/MS convertiti nel database GNPS. Sono disponibili due opzioni: utilizzando un protocollo di trasferimento file (FTP) o direttamente in un browser attraverso la piattaforma online.
NOTA: informazioni dettagliate su come installare e trasferire dati in GNPS sono disponibili all'indirizzo
6. Analisi dei GNPS
- Dopo aver creato un account in GNPS (disponibile all'indirizzo
- Opzioni di base: selezionare i file mzXML per eseguire la rete molecolare. Possono essere organizzati in un massimo di sei gruppi. Selezionare le librerie per la routine di dereplica (Figura 4).
NOTA: questi gruppi non interferiscono con la costruzione di reti molecolari. Queste informazioni verranno utilizzate solo per la rappresentazione grafica.
Figura 4: Utilizzo della piattaforma GNPS online per eseguire l'analisi della rete molecolare. La selezione dei file mzXML viene eseguita facendo clic nella casella 1. Nella finestra di dialogo Apri, i file possono essere selezionati dalla cartella personale (casella 2) o essere caricati nella seconda scheda utilizzando il caricatore di file drag-and-drop (meno di 20 MB). I file possono essere raggruppati in un massimo di sei gruppi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Selezionare la tolleranza di massa iosprecursore e la tolleranza di massa iosone a frammentazione rispettivamente di 0,02 Da e 0,05 Da.
NOTA: GNPS dispone di diversi tipi di rigore disponibili in base a 1) quanto siano accurati i dati MS/MS e 2) quanto deve essere accurata l'associazione. Opzioni di base: in questa cartella, è possibile impostare Precursor Ion Mass Tolerance e Fragment Ion Mass Tolerance. Questi parametri sono utilizzati come guida per determinare quanto deve essere preciso lo ione precursore e lo ione di frammentazione. Le tolleranze di massa selezionate dipendono dalla risoluzione e dall'accuratezza dello spettrometro di massa utilizzato. - Opzioni di rete avanzate: selezionare i parametri in base alla figura 5. Questi parametri influenzano direttamente le dimensioni e la forma del cluster di rete. Un altro parametro nella sezione schede rimanenti sono per gli utenti avanzati; pertanto, lasciare i valori predefiniti.
NOTA: i parametri avanzati possono essere letti nella documentazione di GNPS (disponibile all'indirizzo
Figura 5: Utilizzo di GNPS per eseguire l'analisi della rete molecolare (opzioni avanzate). Min Pair Cos influenzerà direttamente le dimensioni dei cluster, poiché valori elevati si tradurrà nella combinazione di composti strettamente correlati e valori bassi nella combinazione di composti distanti correlati. L'utilizzo di valori troppo bassi dovrebbe essere evitato. Gli ioni di frammento con partita minima rappresentano il numero di frammenti condivisi tra due spettri di frammentazione da collegare nella rete. Insieme, entrambi i parametri guidano il formato di rete; composti inferiori si raggruppano composti più distanti e viceversa. Utilizzando i valori appropriati aiuterà notevolmente il chiarimento composto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Scegliere un indirizzo di posta elettronica per ricevere un avviso al termine del lavoro e inviare il processo.
7. Analisi dei risultati del PNL
- Accedere a GNPS. Selezionare Processi > Processo pubblicato > Fine per aprire il processo. Verrà aperta una pagina Web, come illustrato nella figura 6. Verranno visualizzati tutti i risultati ottenuti dalla rete molecolare.
- Selezionare Visualizza famiglie spectrali (nel visualizzatore di rete del browser) per visualizzare tutti i cluster di rete (casella rossa, figura 6).
Figura 6: Utilizzo di GNPS per visualizzare i risultati della rete molecolare. Tutti i cluster composti correlati possono essere visualizzati nelle famiglie spettrali di visualizzazione (scatola rossa). Per visualizzare solo gli hit della libreria, è necessario selezionare "Visualizza tutti gli hit della libreria" (casella blu). Per una migliore rappresentazione grafica dei risultati della rete molecolare, è necessario scaricare "Direct Cytoscape Preview" (scatola gialla) e utilizzare l'ultima versione di Cytoscape. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Verrà visualizzato un elenco con tutti i cluster di reti molecolari generate. Se è stata selezionata una ricerca nella libreria per generare i risultati, l'identificazione provvisoria delle molecole verrà visualizzata in AllID. Selezionare Mostra per visualizzarli.
NOTA: Le analisi dei dati possono essere guidate per altri risultati (ad esempio, l'estrazione del genoma, i saggi biologici, le molecole di dereplicazione della biblioteca, ecc.). - Per analizzare il cluster di rete molecolare, selezionare Visualizza rete.
NOTA: Ogni cluster è composto da nodi (cerchi) e bordi, che rappresentano rispettivamente molecole e somiglianza molecolare. Le molecole dereplicate saranno evidenziate come un nodo blu nel visualizzatore di rete del browser online. - Nella casella etichette nodo selezionare la massa padre (casella rossa, figura 7).
- Nella casella Etichette spigolose, selezionare Cosine o DeltaM per osservare rispettivamente la somiglianza o la differenza di massa tra i nodi (casella gialla, Figura 7).
- Nel caso di analisi a più gruppi, fare clic su Disegna torte nella casella di colorazione del nodo per osservare la frequenza con cui ogni nodo viene visualizzato in ogni gruppo (casella blu, Figura 7).
NOTA: Sono possibili altre scelte, ma quelle suggerite in precedenza sono ottimali per annotare i nodi del cluster e svelare le proprie strutture.
Figura 7: Utilizzo di GNPS per visualizzare i risultati del cluster molecolare. Dopo aver aperto i cluster molecolari per una migliore visualizzazione dei dati, è necessario scegliere quanto segue: "Massa padre" come etichette dei nodi (casella rossa); Come etichette di bordo (casella gialla); e "Disegna torte" come colorazione del nodo (casella blu). Navigare attraverso il cluster molecolare e cercare di annotare tutti i nodi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Per visualizzare tutti gli hit della libreria, selezionare Visualizza tutti gli hit della libreria (casella blu, Figura 7).
NOTA: Inoltre, il MNW può essere scaricato in "Direct Cytoscape Preview/Download" (scatola gialla, Figura 7),e il file può essere aperto nella piattaforma Cytoscape (che si trova a - Sono necessarie la conferma manuale dei composti dereplicati e la chiarificazione della struttura dei composti correlati. Aprire gli spettri di frammentazione direttamente nella piattaforma GNPS o nei file raw originali.
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Representative Results
Il protocollo è stato esemplificato con successo utilizzando una combinazione di estrazione del genoma, espressione etetologa e approcci MS-guidato/codice per accedere a nuove molecole specializzate di analoghi di valinomicina. Il flusso di lavoro genoma-molecola per il bersaglio, la valiomicina (VLM), è rappresentato nella Figura 8. Il genoma del progetto CBMAI 2042 è stato analizzato in silico e il cluster genico VLM è stato quindi identificato e trasferito in un ospite etelogoo. I ceppi di tipo etetologo e selvatico sono stati coltivati in triplice copia utilizzando condizioni di fermentazione adeguate, partizionati con acetato etilico, e concentrati per generare l'estratto grezzo. Dal prodotto, i dati MS/MS sono stati acquisiti per generare un profilo di metabolita MS in tandem per la rete molecolare. La figura 9 rappresenta gli ioni raggruppati ottenuti dai dati MS/MS da Streptomyces sp. CBMAI 2042 Extract crude, in cui i modelli di frammentazione delle caratteristiche e le corrispondenti analogie MS suggeriscono il verificarsi di una famiglia molecolare che condivide le caratteristiche strutturali2. Seguendo note conoscenze biosintetiche di logica e bioinformatica, e supportate da spettri MS/MS basati su modelli, la struttura di quattro ciclodepsitidi originariamente segnalati è stata chiarita e le loro origini sono state correlate con gli stessi cluster genici biosintetici responsabili dell'assemblaggio VLM32.
I dati di rete molecolare (disponibili in
Figura 8: Flusso di lavoro da nell'analisi della sequenza del genoma in silico all'acquisizione di dati MS. (A) Una bozza del genoma di Streptomyces sp. CBMAI 2042 è ottenuta dal sequenziamento Illumina MiSeq. ((B) Identificazione e annotazione della BGC Valinomycin. (C) Dopo aver trasferito l'intero cluster genico ad un ospite appropriato, il ceppo viene coltivato. L'estratto di acetato etilico dalla coltura viene analizzato da LC per ottenere un profilo dei metaboliti secondari prodotti. Il croromatogramma mostra che la valinomicina, la montanastatina e cinque analoghi sono prodotti dall'espressione VLM BGC in un ospite etelogoo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Risultati della rete molecolare. (A) Rete molecolare da Streptomyces sp. Estratto CBMAI 2042. Gli ioni di rete molecolare corrispondenti alla valinomicina, un composto già noto con il corrispondente BGC annotato nel genoma di Streptomyces sp. CBMAI 2042, sono raggruppati con ioni correlati agli analoghi descritti principalmente per VLM BGC. (B) sono mostrati spettri MS e strutture chimiche per la valinomicina e gli analoghi correlati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il vantaggio più forte di questo protocollo è la sua capacità di dereplicare rapidamente i profili metabolici e le informazioni genomiche del ponte con i dati MS al fine di chiarire le strutture di nuove molecole, in particolare analoghi strutturali2. Sulla base di informazioni genomiche, è possibile studiare chemiotipi di prodotti naturali diversi, come i polionidi (PK), i peptidi non ribonsuici (NRP) e i prodotti naturali glicosillati (GNP), nonché gli screening metabolomici criptici. Così, un BGC può essere clonato per la produzione diretta di un nuovo composto o analoghi sconosciuti correlati ad un BGC già noto, facilitato da somiglianze scoperte dalla rete molecolare. Pertanto, questa procedura aiuta a distinguere i composti preziosi prodotti da fonti naturali e può essere utilizzata come guida per le future fasi di isolamento, che sono comuni nelle pipeline di prodotti naturali.
L'estrazione del genoma guidata dalla MOS è stata descritta per la prima volta nei campi della peptidogenomica41 e della glicogenomica42. Per stimare l'entità della diversità chimica dei prodotti naturali dei peptidi, Dorrestein e colleghi hanno sviluppato un metodo automatizzato utilizzando la SM e la genomica per visualizzare la connessione tra i prodotti naturali espressi (chemiotipo) e i loro cluster genici (genotipo). Il concetto di estrazione del genoma guidato dalla MS è stato poi descritto durante l'utilizzo di metaboliti specializzati di peptidi. Qui, un metodo per l'identificazione dei prodotti naturali glicosili microbici (GNP) utilizzando un approccio GM e la SM in tandem è stato applicato come strumento per collegare rapidamente i chemiotipi GNP (da metabolomi microbici) con i corrispondenti genotipi biosintetici che seguono le impronte di zucchero.
Il concetto di peptidogenomica è stato applicato per rivelare i cluster genici di stenothricina in Streptomyces roseosporus, fornendo le prime informazioni sull'ampia utilità del GNPS come piattaforma43. L'estrazione del genoma basato su modelli e la rete molecolare sono stati infine combinati con la piattaforma GNPS26 per facilitare la dereplicazione di nuovi composti, composti noti, rilevamento di nuovi analoghi e chiarimento della struttura di 35 ceppi di Salinispora. Questo ha portato all'isolamento e alla caratterizzazione della reticina A, un depsipeptide di tipo quinomycin44. Dopo l'introduzione del GNPS, la metabolomica integrata e gli approcci di estrazione del genoma sono diventati la via più versatile per collegare reti molecolari con capacità biosintetiche45,46,47,48,49,50.
Questo protocollo rafforza la fattibilità dell'utilizzo di analisi genomiche e metabolomiche per studiare la produzione di composti chimici analoghi noti e sconosciuti in pochi passaggi, consumando bassi livelli di materiali. Il modello qui presentato è correlato all'identificazione analogica della valomicina da estratti grezzi attraverso la dereplicazione delle reti molecolari. La struttura degli analoghi è dedotta dalla frammentazione MS/MS e segue la logica biosintetica dei BCC VLM clonati.
Sono disponibili diversi software per l'estrazione di cluster genici biosintetici di metaboliti secondari51 e per la chiarificazione dei metaboliti, ma le opzioni open source hanno i vantaggi a causa di aggiornamenti costanti e sono aperti alla comunità scientifica. In questo senso, antiSMASH e la piattaforma GNPS sono le scelte più popolari.
Questa procedura generale può essere modificata per altre metodologie di estrazione basate sulla fonte naturale esplorata. Più di un metodo di estrazione può anche essere combinato in base alle proprietà dei metaboliti (ad esempio, la polarità, l'idrofobicità, la capacità di formare micelle), e anche proprietà simili, diversi solventi o resina possono ottenere risultati migliori. Di solito, gli estratti vengono preparati dalla coltivazione dei mezzi liquidi, ma c'è una pletora di metodi di estrazione disponibili per isolare gli estratti arricchiti e vagliare qualsiasi campione biologico di interesse.
Quando si acquisiscono dati MS, è necessario utilizzare l'analisi dell'acquisizione dipendente dai dati (DDA). Questo problema è importante quando un numero maggiore di composti viene valutato in una singola iniezione. Durante l'esecuzione della DDA, il numero massimo di spettri MS/MS di ogni ione precursore e il numero massimo di ioni precursori diversi devono essere compensati. Quando si utilizzano apparecchiature con velocità di scansione veloce, questo può essere ottenuto con velocità di scansione più elevate (scanie MS/MS da 6 a 10 DOLLARI per ciclo). Tuttavia, nelle apparecchiature con velocità di scansione inferiore, le prestazioni MN possono essere aumentate solo con una migliore risoluzione cromatografica. Dovrebbero essere ottenuti i dati più completi per popolare la rete molecolare. Per l'acquisizione di dati MS, l'energia a collisione fissa è possibile, ma le energie della rampa sono adatte per produrre risultati migliori. Non ci sono condizioni ottimali che funzionano perfettamente per tutti i campioni. Il raggiungimento di un'analisi sufficiente degli Stati membri è fondamentale per i seguenti passaggi. D'ora in poi, i cluster di rete molecolare dovrebbero essere generati e dereplicati secondo la procedura.
Un errore di risoluzione dei problemi frequente manca intensità per le masse. Normalmente, questo può essere risolto introducendo una maggiore energia di collisione durante l'analisi. A volte, non si osservano correlazioni tra gli spettri e la libreria GNPS, che è molto rara. In questo caso, assicurarsi che la cartella si apra correttamente nel software MS previsualizzazione poiché a volte è possibile creare errori durante il passaggio di conversione in file .mzXML.
Per quanto riguarda l'estrazione del genoma, la produzione più precisa dalle piattaforme di annotazione dei cluster genici sarà fornita per il sequenziamento dell'intero genoma di qualità superiore per l'estrazione indipendente di entrambi, singolo ceppo o coltura. Il sequenziamento di alta qualità genererà informazioni bioinformatiche di alta qualità per la dereplicazione delle vie biosintetiche. Al contrario, anche se il software bioinformatica di previsione BGC si è sviluppato rapidamente, le previsioni esatte della funzione genica e dei prodotti putativi sono ancora difficili, soprattutto quando si studiano nuovi percorsi e caratteristiche biosintetiche che non possono essere previste in silico. Inoltre, alcuni macchinari biosintetici sono straordinariamente conservati, mentre l'enzymologia che è coinvolta nei sistemi ibridi, trans-ATKPI modulari, e NRPS sono riconosciuti come eccezioni della regola di colinearità. In questo senso, l'espressione eteologa e le raffinatezze nel software di uscita bioinformatica possono aiutare a chiarire le funzioni enzimatiche imprevedibili e la biochimica insolita52,53,54. L'arricchimento delle banche dati pubbliche porterà a previsioni più precise e alla scoperta di nuovi metaboliti specializzati, poiché il costo per il WGS non rappresenta l'handicap per l'estrazione del genoma.
Infine, i maggiori vantaggi degli approcci integrati di estrazione metabolomica e genomica sono correlati alla loro fattibilità per eseguire la dereplicazione del genotipo e del chemiotipo tramite analisi automatizzata e ad alta produttività che collega genomica, trascrittomica e dati metabolomici per collegare in modo efficiente i geni con le molecole.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il sostegno finanziario a questo studio è stato fornito dalla Fondazione ricerca di San Paolo - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 e 2014/50249-8 a L.G.O; 2013/12598-8 e 2015/01013-4 a R.S.; e 2019/08853-9 a C.F.F.A). B.S.P, C.F.F.A. e L.G.O. hanno ricevuto borse di studio dal Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico - CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4 e 313492/2017-4). L.G.O. è anche grato per il sostegno alla borsa di studio fornito dal programma For Women in Science (2008, edizione brasiliana). Tutti gli autori riconoscono CAPES (Coordinamento per il Miglioramento del Personale per l'Istruzione Superiore) per aver sostenuto i programmi post-laurea in Brasile.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | AA1120-048 | HPLC grade |
| Agar | Oxoid | LP0011 | NA |
| Apramycin | Sigma Aldrich | A2024 | NA |
| Carbenicillin | Sigma Aldrich | C9231 | NA |
| Centrifuge | Eppendorf | NA | 5804 |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C3175 | NA |
| Column C18 | Agilent Technologies | NA | ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm, 1200 bar pressure limit P/N 757700-902 |
| Kanamycin | Sigma Aldrich | K1377 | NA |
| Manitol P.A.- A.C.S. | Synth | NA | NA |
| Microcentrifuge | Eppendorf | NA | 5418 |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N4382 | NA |
| Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | F548S | NA |
| Q-TOF mass spectrometer | Agilent technologies | NA | 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS |
| Sacarose P.A.- A.C.S. | Synth | NA | NA |
| Shaker/Incubator | Marconi | MA420 | NA |
| Sodium Chloride | Synth | NA | P. A. - ACS |
| Soy extract | NA | NA | NA |
| Sucrose | Synth | NA | P. A. - ACS |
| Thermal Cycles | Eppendorf | NA | Mastercycler Nexus Gradient |
| Thiostrepton | Sigma Aldrich | T8902 | NA |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | NA |
| Tryptone Soy Broth | Oxoid | CM0129 | NA |
| UPLC | Agilent Technologies | NA | 1290 Infinity LC System |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | NA |
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