Summary

Montage und Charakterisierung von Polyelektrolyt-Komplexmizellen

Published: March 02, 2020
doi:

Summary

Wir liefern Protokolle und repräsentative Daten für die Gestaltung, Montage und Charakterisierung von Polyelektrolyt-Komplexen Mizellen, Kernschalen-Nanopartikeln aus Polyelektrolyten und hydrophilen geladenen Blockcopolymeren.

Abstract

Polyelektrolyt-Komplexmizellen (PCMs), Kernschalen-Nanopartikel, die durch Selbstmontage geladener Polymere in wässriger Lösung entstehen, bieten eine leistungsstarke Plattform für die Erforschung der Physik von Polyelektrolyt-Wechselwirkungen und bieten zudem eine vielversprechende Lösung für das drängende Problem der Bereitstellung von therapeutischen Oligonukleotiden in vivo. Die Entwicklung prädiktiver Struktur-Eigenschaft-Beziehungen für PCMs hat sich als schwierig erwiesen, zum Teil aufgrund des Vorhandenseins starker kinetischer Fallen während der Nanopartikel-Selbstmontage. Dieser Artikel behandelt Kriterien für die Auswahl von Polymeren für die PCM-Konstruktion und bietet Protokolle auf der Grundlage von Salzglühen, die die Montage von wiederholbaren, polydispersitätsarmen Nanopartikeln ermöglichen. Wir diskutieren auch die PCM-Charakterisierung mittels Lichtstreuung, Kleinwinkel-Röntgenstreuung und Elektronenmikroskopie.

Introduction

Wenn entgegengesetzt geladene Polyelektrolyte in wässriger Lösung gemischt werden, bewirkt der Entropiegewinn aus der Freisetzung ihrer Gegensätze eine Demischung der Lösung in eine polymerreiche kondensierte Phase und einen polymeren abbauten Überstand1,2,3,4,5, ein Phänomen, das als Polyelektrolytkomplexierung bekannt ist. Wenn ein neutraler hydrophiler Block mit einem oder beiden Polyelektrolyten konjugiert wird, erfolgt stattdessen eine nanoskalige Phasentrennung (Abbildung 1A). Die resultierenden selbstzusammengesetzten Kernschalen-Nanopartikel werden verschiedentlich als Polyelektrolyt-Komplexmizellen (PCMs), Polyionenkomplex-Mizellen, Blockionomerkomplexe oder Coacervat-Kern-Mizellen analog zur Tensid-Micellisierung bezeichnet, obwohl alle Komponenten des Systems hydrophil6,7sind. Die Fähigkeit eines PCM, hydrophile Moleküle wie Proteine und Nukleinsäuren zu verkapseln, sowie die umfangreiche Tunabilität, die die Blockcopolymerträgerarchitektur bietet, machen sie zu attraktiven Kandidaten für die Lieferung von therapeutischen Molekülen in vivo8,9,10,11,12,13.

Die Bereitstellung von therapeutischen Nukleinsäuren für zelluläre Targets ist eine besonders wichtige Herausforderung, für die PCMs mehrere Vorteile bieten. Therapeutische Nukleinsäuren (genetische DNA, mRNA und Oligonukleotide wie siRNA) haben ein immenses Potenzial zur Verbesserung der menschlichen Gesundheit, müssen aber zahlreiche biologische und physikalische Barrieren überwinden, um dieses Potenzial14,15,16zu erkennen. Nackte Nukleinsäuren werden durch Serum abgebaut und Zellkerne werden schnell aus dem Kreislauf entfernt, und ihre starke negative Ladung macht es ihnen schwer, Zellmembranen ohne Hilfe zu durchdringen. Zu den aktuellen Ansätzen zur Überwindung dieser Barrieren gehören kostspielige chemische Modifikationen, um Schäden durch Nukleasen und/oder Verkapselung in verschiedene Lipid-Nanopartikel zu verhindern, die über hydrophobe Wechselwirkungen15,17,18zusammengesetzt werden. Während sich diese Methoden für lokale Injektionen und Lebertargeting als wirksam erwiesen haben, stellt die systemische Anwendung erhebliche Einschränkungen der Toxizität, Immunogenität und begrenzten Bioverteilung16dar. Im Gegensatz dazu verwenden PCMs die negative Ladung von Nukleinsäuren, um sie innerhalb des phasengetrennten Kerns zu kondensieren, während die neutrale Korona eine serische Barriere gegen Abbau sowie eine Plattform für die Integration von Liganden zur Verbesserung des Targetings oder der Internalisierung11,19bietet. In-vitro- und Tierstudien haben gezeigt, dass PCMs effektiv verschiedene Nukleinsäuren-Nutzlasten liefern können20,21,22,23,24, aber Schwächen in unserer Fähigkeit, PCM-Eigenschaften wie Größe, Form und Stabilität aus den Eigenschaften der konstituierenden Polymere vorherzusagen, haben ihre breitere Akzeptanz behindert.

Jüngste Arbeiten unserer Gruppe und anderer auf diesem Gebiet haben begonnen, dieses Problem durch die Entwicklung von Struktur-Eigenschaft, und in einigen Fällen Struktur-Eigenschaft-Funktions-Beziehungen für PCMs aus Nukleinsäuren und verschiedenen kationisch-neutralen Polymeren7,25,26,27. Zwei konsistente Themen, die aus diesen Studien hervorgegangen sind, sind die Bedeutung der Entwicklung gut kontrollierter, wiederholbarer Protokolle für die PCM-Montage und der Vorteil der Verwendung mehrerer Techniken, um die resultierenden Nanopartikel zu charakterisieren. Polyelektrolyte, insbesondere solche mit hoher Ladungsdichte wie Nukleinsäuren, interagieren sehr stark miteinander und scheinen beim Mischen leicht kinetisch gefangen zu werden, was zu PCM-Präparaten führt, die sehr empfindlich auf kleine Verfahrensschwankungen reagieren und eine hohe Polydispersität und schlechte Wiederholbarkeit von Charge zu Charge aufweisen. PCMs haben auch gezeigt, dass eine breite Palette von Formen und Größen in Abhängigkeit von den atomaren Konfigurationen ihrer Komponenten zu übernehmen, und diese Vielfalt mit jeder individuellen Charakterisierungstechnik zu erfassen ist sehr schwierig, zumal einige gängige Techniken wie dynamische Lichtstreuung (DLS) Annahmen über die Partikelform für ihre Interpretation erfordern.

In diesem Artikel diskutieren wir Materialdesign und -auswahl für PCMs mit schwerpunkt auf Oligonukleotiden und kationisch-neutralen Diblock-Copolymeren. Wir beschreiben dann ein Salzglühprotokoll, das hohe Salzkonzentrationen verwendet, gefolgt von einer langsamen Dialyse, um kinetisches Fangen während der PCM-Montage zu vermeiden. Die Polyelektrolyte werden unter hohen Salzbedingungen gemischt, wo elektrostatische Attraktionen gesiebt werden, dann wird die Salzkonzentration langsam abgesenkt, damit sich die Polyelektrolyte in ihre energetisch günstigsten Konfigurationen einsiedeln können, analog zum langsamen Kühlprozess des thermischen Glühens. Mit diesem Protokoll sind wir regelmäßig in der Lage, eine außergewöhnlich geringe Polydispersität und eine hohe Wiederholbarkeit für Oligonukleotid-PCMs7,26zu erreichen. Schließlich beschreiben wir, wie vier separate Messtechniken verwendet werden können, um PCMs über einen sehr breiten Bereich von Längenskalen zu charakterisieren, von der externen Morphologie bis zur internen Struktur: DLS, Multi-Winkel-Lichtstreuung (MALS), Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Wir hoffen, dass diese Protokolle es mehr Forschern ermöglichen werden, die Fähigkeiten dieser interessanten Nanopartikel effektiv zu erforschen.

Polymerauswahl und -vorbereitung
Die PCM-Eigenschaften werden stark von den physikalischen und chemischen Eigenschaften der konstituierenden Polymere beeinflusst, was die Polymerauswahl zu einem entscheidenden Schritt im Designprozess macht. Die am besten charakterisierten Blockcopolymere für Nukleinsäure-PCMs sind lineare Diblöcke wie Poly(Lysin)-Poly(Ethylenglykol) (pLys-PEG), aber PCMs können zwischen Polyelektrolyten und einer Vielzahl hydrophiler neutral geladener Polymere gebildet werden, die in hoher Durchsatzweise erzeugt werden können28. Die Wahl der geladenen Gruppe wirkt sich stark auf die Stabilität der Ionenpaarung und Form der Mizellen26, und PCM-Größe hat gezeigt, dass mit der Länge des geladenen Blocks5,7,26 ( Abbildung2) zu erhöhen, so dass PCM-Eigenschaften auf die Anforderungen einer gewünschten Anwendung abgestimmt werden. Bei linearen Diblocks haben wir festgestellt, dass der geladene Block mindestens 10 Ladungen haben und beim gewünschten pH-Wert stark aufgeladen sein sollte. Länger geladene Blöcke können die PCM-Bildung mit Oligonukleotiden wie siRNA fördern, die mit kürzeren Blöcken schwer zu komplex sind21. Wir haben erfolgreich PCM-Bildung mit Blocklängen bis zu 200 beobachtet, und die Literatur beschreibt längere Polymere. Bei der Wahl der neutralen Blöcke24ist mehr Flexibilität möglich, aber die Erfahrung hat gezeigt, dass sehr kurze neutrale Blöcke eher zur Aggregation als zur Nanopartikelbildung führen und dass die minimale neutrale Länge mit geladener Blocklänge zunimmt. Für pLys-PEG wird eine PEG MW von mindestens 3.000–5.000 für PLys-Längen unter 50 € benötigt, und längere Längen sind erforderlich, da der geladene Block weiter erhöht wird. Erhöhte neutrale Blocklänge führt zu einer erhöhten PCM-Größe, insbesondere schalendicke, aufgrund der serischen Verdrängung der neutralen Polymere.

Dieses Manuskript enthält ein Protokoll zur Herstellung von PCMs aus lyophilisierten Hochreinheits-PLys-PEG und Oligonukleotiden bekannter Menge, sollte aber auch leicht an andere Systeme angepasst werden können. Wir haben es erfolgreich mit mehreren geladenen Polypeptiden getestet, einschließlich Polyarginin und Polyglutaminsäure, sowie mehreren synthetischen Polyelektrolyten, wie Polyacrylsäure und Poly (Vinylbenzyltrimethylammonium). Wir beschreiben auch die Vorbereitung von PCMs mit einem stoichiometrischen Verhältnis von Polyelektrolytladungen, aber dies kann leicht geändert werden. Wir finden es am einfachsten, in Ladekonzentrationseinheiten (c.c.) zu arbeiten, die natürlich auch Polymere aufnehmen, die nicht vollständig geladen sind. Wenn eines der Polymere nicht gut charakterisiert ist, ist darauf zu achten, dass die Polymerlängen/-massen genau bestimmt werden und dass überschüssiges Salz nicht über das hinaus vorhanden ist, was beispielsweise für die Ladungsneutralisation durch Dialyse erforderlich ist. Bei der Berechnung der Konzentrationen sollte auch das Vorhandensein von zurückgehaltenem Wasser berücksichtigt werden. Die Nukleinsäurekonzentration kann durch Absorption bei 260 nm bequem quantifiziert werden, und das Vorhandensein oder Fehlen von terminalen Phosphaten sollte bei der Berechnung der c.c. berücksichtigt werden.

Bei der Verwendung von Oligonukleotiden als Polyanionen helfen der Hybridisierungszustand und die chemische Struktur, die Neigung zur Selbstmontage und die Eigenschaften des resultierenden PCM5,7,26zu bestimmen. Die Optimierung dieser, innerhalb der Anforderungen an die biologische Wirksamkeit, wenn PCMs für die Lieferung verwendet werden, erhöht die Wahrscheinlichkeit, die gewünschten Strukturen zu bilden. Hilfreiche Werkzeuge zur Analyse der Hybridisierung sind MATLAB-Funktionen für Nukleinsäuren, NUPACK29und IDT OligoAnalyzer. Wir empfehlen, eine Kandidatensequenz zu analysieren, um die Stärke der Bindung an 1) selbst in einer Haarnadelbildung zu verstehen; 2) eine weitere Kopie derselben Sequenz (Selbstanzeige); und 3) an andere oligonukleotide, die im System vorhanden sind. DNA- und RNA-Schmelztemperaturen für eine bestimmte Sequenz können auch mit der Nächsten-Nachbar-Methode30,31berechnet werden. Thermisches Glühen von Nukleinsäuren (Schritt 2.3) denaturiert jede restliche Sekundärstruktur in den einzelnen Nukleotiden und fördert die Gleichgewichtsfaltung.

PCM-Charakterisierung und -analyse
Für die Charakterisierung von Nanopartikeln stehen eine breite Palette von Techniken zur Verfügung, einschließlich statischer und dynamischer Lichtstreuung, kleinwinkeliger Streuung von Elektronen oder Neutronen und Elektronenmikroskopie. In diesem Artikel stellen wir Protokolle für zwei Lichtstreuungstechniken, kleine Winkel-Röntgenstreuung und zwei Elektronenmikroskopietechniken bereit.

DLS misst die Autokorrelation zeitlicher Schwankungen der Streuintensität in einem Winkel von der Brownschen Bewegung der Probe. Das Anpassen dieser Daten kann hydrodynamischen Radius und Polydispersität für kugelförmige Mizellen liefern (Abbildung 3). Die Mehrfachwinkellichtstreuung (MALS) misst die statische Streuintensität in vielen Winkeln. Diese Winkelabhängigkeit beschreibt die Form des Nanopartikels, ist aber für sichtbares Licht auf Längenskalen von mehr als 50 nm begrenzt, was seine Wirksamkeit für kleinere Nanopartikel einschränkt. Beide Techniken basieren auf refraktiven Index-Inzimcierungen und beschreiben in erster Linie die äußeren Dimensionen des Nanopartikels.

Die Röntgenstreuung mit kleinen Winkeln (SAXS) verwendet Röntgenstrahlen als Streusonde, und ihre kürzere Wellenlänge ermöglicht Messungen über einen Bereich von 0,1 bis 100 nm. Die Anpassung der beobachteten Streuintensität vs. Winkel (konventionell ausgedrückt als Impulsübertragung q) liefert Informationen über die PCM-Morphologie (d.h. Größe und Form) und auch die interne Struktur. Wenn eine absolute Intensitätskalibrierung verfügbar ist und die Streuintensität auf Nullwinkel extrapoliert werden kann, können PCM-Masse und Aggregationsnummer ebenfallsauf 32geschätzt werden, was SAXS zu einer äußerst vielseitigen und wertvollen Methode macht. Die Kleinwinkel-Neutronenstreuung (SANS) ist über einen ähnlichen Bereich von Längenskalen empfindlich, ist aber nur in spezialisierten Einrichtungen verfügbar und wird in diesem Artikel33,34,35nicht explizit behandelt.

In den letzten Jahren kam es zu SAXS-Instrumenten, aber wir stellen fest, dass Synchrotronquellen besser für die PCM-Charakterisierung geeignet sind, da ihre höhere Intensität es ermöglicht, Daten für diese kontrastreichen Samples viel schneller zu sammeln. Wir bieten ein kurzes Protokoll zum Erfassen von PCM SAXS-Daten bei Beamline 12-ID-B am Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) aus Anwendersicht. Dieses Protokoll sollte für die meisten Synchrotronquellen gelten, aber die Konsultation der lokalen Mitarbeiter vor dem Vorschlag eines Experiments wird dringend empfohlen. Wir bieten auch ein Datenreduktions- und Analyseprotokoll mit Irena36, einem kostenlosen Satz von Makros, die für Igor Pro geschrieben wurden. Irena enthält einen vielseitigen Satz von Formfaktoren für die Modellierung von SAXS-Daten und ermöglicht die Erstellung von Mehrkomponentenmodellen, die in der Lage sind, das komplexe Streuprofil von PCMs zu beschreiben (siehe Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 4). Irena hat auch umfassende Dokumentation und Tutorials online zur Verfügung. Bevor Wir die folgenden Verfahren versuchen, empfehlen wir, sich mit diesen vertraut zu machen, insbesondere dem Tutorial “Modellierung von SAXS-Daten mit zwei Hauptstreuerpopulationen”.

Strahlenschäden sind ein Problem für die Röntgenstreuung, aber es können mehrere Maßnahmen ergriffen werden, um sie zu minimieren. Insbesondere empfehlen wir die Verwendung eines Durchflusszellenaufbaus mit spritzenpumpe und PCM-Probe, die während der Datenerfassung fließt, anstatt einer versiegelten Kapillare. Dies vereinfacht auch die Hintergrundsubtraktion erheblich. Wir schlagen auch vor, mehrere Expositionen der fließenden Probe anstelle einer längeren zu nehmen, um den Fluss fluss, den jedes einzelne Volumen der Probe sieht, zu begrenzen und einen Vergleich der Expositionsdaten zu ermöglichen, um Schäden zu identifizieren.

Im Gegensatz zu den Streutechniken, die in der Regel eine Interpretation erfordern, liefert die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ein reales Raumbild der Nanopartikel, indem sie einen Elektronenstrahl durch die Probe passieren und ein Bild auf einen Szintillationsbildschirm projizieren (Abbildung 5). In diesem Artikel stellen wir Protokolle für zwei TEM-Techniken vor. Cryo TEM friert Micelle-Proben in eine dünne Schicht aus Glaseis ein und bewahrt die strukturelle Konformation mit minimalen Fremdstoffen, optimal für Mizellen im Radius von 10-100 nm. Negativer Fleck TEM verwendet ein Schwermetallsalz (z. B. Uran), um die Probe zu umgeben, nachdem sie auf der Oberfläche eines Gitters getrocknet wurde. Der dichte Fleck wird mehr Elektronen als die Probe streuen, Kontrast hinzufügen und ein negatives Bild der Probe erzeugen. Cryo TEM wird für hochwertige Bilder empfohlen. Es ist jedoch kostspieliger, zeitaufwändiger und bietet möglicherweise keinen ausreichenden Kontrast. Wenn dies ein Problem ist, sollten negative gebeizte Proben verwendet werden. Die beispiele sind in Abbildung 5dargestellt.

Jede dieser Techniken berichtet über leicht unterschiedliche Aspekte der Nanopartikel mit unterschiedlichen Stärken und Einschränkungen. Die Lichtstreuung ist leicht verfügbar und ist oft der schnellste Ansatz, hat jedoch erhebliche Größen- und Formeinschränkungen. SAXS kann Informationen über eine große Anzahl von Längenskalen bei einem relativ hohen Durchsatz bereitstellen, erfordert jedoch spezielle Geräte, um die Daten zu erfassen, sowie die Modellierung, um sie zu interpretieren. TEM-Bilder sind einfach zu interpretieren, können aber im Kontrast begrenzt sein und haben von Natur aus einen niedrigen Durchsatz. Unsere Erfahrung hat gezeigt, dass die Verwendung mehrerer Techniken für die Charakterisierung die Informationen, die über PCM-Eigenschaften erhalten werden können, erheblich erhöht und die Interpretation von Datensätzen vereinfacht, die von jedem einzelnen allein erhalten wurden. So untersuchen SAXS und TEM in erster Linie den dichten Kern eines PCM, während Lichtstreuung über die Gesamtabmessungen des Nanopartikels berichtet. So ermöglicht die Kombination von ihnen die Messung sowohl der Kern- als auch der Koronagröße. Die Fähigkeit von TEM, reale Raumbilder zu erfassen, kann Bodenwahrheitsdaten liefern, um die Auswahl geeigneter Formfaktoren für die Modellierung von SAXS-Daten zu ermöglichen, die andernfalls mehrdeutig sein könnten. In diesem Artikel werden Protokolle für alle vier Techniken beschrieben, und ein Beispielprozess für die Verwendung dieser Methoden zum Charakterisieren eines unbekannten Beispiels ist im Abschnitt Diskussion aufgeführt.

Protocol

1. Herstellung von Materialien Wiegen Sie lyophilisiertes Diblockpolymer aus und fügen Sie Wasser bis zu fast dem Volumen hinzu, das für eine Lagerlösung von 10 mg/ml Endkonzentration erforderlich ist. Wirbel mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min. Beschallen für 5 min. Sehr lange Diblocks können zusätzliche Beschallung erfordern. Die Lagerlösung sollte völlig transparent und homogen erscheinen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH oder HCl nach Bedarf auf 7,4 ein. Fügen Sie dem endig…

Representative Results

Um die oben beschriebenen Charakterisierungsmethoden zu veranschaulichen, zeigen wir typische Ergebnisse für PCMs, die aus Oligonukleotiden und Blockcopolymeren unterschiedlicher Länge und Chemie zusammengesetzt sind (Abbildung 1). Abbildung 2 zeigt ein Beispiel dafür, wie die PCM-Kerngröße (wie aus SAXS und TEM ermittelt, Abbildung 4 und Abbildung 5)mit der geladenen Blocklänge variiert e.V. <str…

Discussion

Wie oben erwähnt, werden die hier vorgestellten Protokolle mit einem Schwerpunkt auf Oligonukleotiden als Polyanionskomponente und pLys-PEG als kationisch-neutrales Blockcopolymer geschrieben, aber wir haben sie mit einer Vielzahl von Polymeren getestet, wie Poly(Acrylsäure), Polyglutamat und PEG-Poly (Vinylbenzyltrimethylammonium), und glauben, dass sie allgemein für die meisten Polyelektrolytenpaare anwendbar sein werden. Ein Parameter, der möglicherweise optimiert werden muss, ist die Salzkonzentration, die zum Gl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Phil Griffin und Tera Lavoie von der Soft Matter Characterization Facility bzw. Advanced Electron Microscopy Facility an der University of Chicago. Wir danken auch Xiaobing Zuo und Soenke Seifert von der Advanced Photon Source am Argonne National Laboratory und NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) für die Unterstützung. Wir danken Jeff Ting und Michael Lueckheide für ihre Beiträge zu dieser Arbeit.

Materials

70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k – PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

References

  1. Spruijt, E., Westphal, A. H., Borst, J. W., Cohen Stuart, M. A., van der Gucht, J. Binodal compositions of polyelectrolyte complexes. Macromolecules. 43 (15), 6476-6484 (2010).
  2. van der Gucht, J., Spruijt, E., Lemmers, M., Cohen Stuart, M. A. Polyelectrolyte complexes: bulk phases and colloidal systems. Journal of Colloid and Interface Science. 361 (2), 407-422 (2011).
  3. Priftis, D., Laugel, N., Tirrell, M. Thermodynamic characterization of polypeptide complex coacervation. Langmuir. 28 (45), 15947-15957 (2012).
  4. Fu, J., Schlenoff, J. B. Driving Forces for Oppositely Charged Polyion Association in Aqueous Solutions: Enthalpic, Entropic, but Not Electrostatic. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 980-990 (2016).
  5. Vieregg, J. R., et al. Oligonucleotide-Peptide Complexes: Phase Control by Hybridization. Journal of the American Chemical Society. 140 (5), 1632-1638 (2018).
  6. Voets, I. K., de Keizer, A., Cohen Stuart, M. A. Complex coacervate core micelles. Advances in Colloid and Interface Science. 147-148, 300-318 (2009).
  7. Lueckheide, M., Vieregg, J. R., Bologna, A. J., Leon, L., Tirrell, M. V. Structure-Property Relationships of Oligonucleotide Polyelectrolyte Complex Micelles. Nano Letters. 18 (11), 7111-7117 (2018).
  8. De Kruif, C. G., Weinbreck, F., de Vries, R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 9 (5), 340-349 (2004).
  9. Vieregg, J. R., Tang, T. Y. D. Polynucleotides in cellular mimics: Coacervates and lipid vesicles. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 26, 50-57 (2016).
  10. Marciel, A. B., Chung, E. J., Brettmann, B. K., Leon, L. Bulk and nanoscale polypeptide based polyelectrolyte complexes. Advances in Colloid and Interface Science. 239, 187-198 (2017).
  11. Cabral, H., Miyata, K., Osada, K., Kataoka, K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications. Chemical Reviews. 118 (14), 6844-6892 (2018).
  12. Tan, Z., et al. Block Polymer Micelles Enable CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery: Physicochemical Properties Affect Packaging Mechanisms and Gene Editing Efficiency. Macromolecules. 52 (21), 8197-8206 (2019).
  13. Horn, J. M., Kapelner, R. A., Obermeyer, A. C. Macro- and Microphase Separated Protein-Polyelectrolyte Complexes: Design Parameters and Current Progress. Polymers. 11 (4), 578 (2019).
  14. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  15. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  16. Lorenzer, C., Dirin, M., Winkler, A. M., Baumann, V., Winkler, J. Going beyond the liver: progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release. 203, 1-15 (2015).
  17. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
  18. Li, W., Szoka, F. C. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharmaceutical Research. 24 (3), 438-449 (2007).
  19. Miyata, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2562-2574 (2012).
  20. Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile ss-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. Journal of the American Chemical Society. 127 (6), 1624-1625 (2005).
  21. Christie, R. J., et al. Targeted polymeric micelles for siRNA treatment of experimental cancer by intravenous injection. ACS Nano. 6 (6), 5174-5189 (2012).
  22. Kuo, C. H., et al. Inhibition of atherosclerosis-promoting microRNAs via targeted polyelectrolyte complex micelles. Journal of Materials Chemistry B. 2 (46), 8142-8153 (2014).
  23. Ge, Z., et al. Targeted gene delivery by polyplex micelles with crowded PEG palisade and cRGD moiety for systemic treatment of pancreatic tumors. Biomaterials. 35 (10), 3416-3426 (2014).
  24. Van Bruggen, C., Hexum, J. K., Tan, Z., Dalai, R. J., Reineke, T. M. Nonviral Gene Delivery with Cationic Glycopolymers. Accounts of Chemical Research. 52 (5), 1347-1358 (2019).
  25. Hayashi, K., et al. Influence of RNA Strand Rigidity on Polyion Complex Formation with Block Catiomers. Macromolecular Rapid Communications. 37 (6), 486-493 (2016).
  26. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Polyelectrolyte Complexation of Oligonucleotides by Charged Hydrophobic-Neutral Hydrophilic Block Copolymers. Polymers. 11 (1), 83 (2019).
  27. Phillips, H. R., et al. Glycopolycation-DNA Polyplex Formulation N/P Ratio Affects Stability, Hemocompatibility, and in Vivo Biodistribution. Biomacromolecules. 20 (4), 1530-1544 (2019).
  28. Ting, J. M., Wu, H., Herzog-Arbeitman, A., Srivastava, S., Tirrell, M. V. Synthesis and Assembly of Designer Styrenic Diblock Polyelectrolytes. ACS Macro Letters. 7 (6), 726-733 (2018).
  29. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  30. Santa Lucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1460-1465 (1998).
  31. Xia, T., et al. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs. Biochemistry. 37 (42), 14719-14735 (1998).
  32. Orthaber, D., Bergmann, A., Glatter, O. SAXS experiments on absolute scale with Kratky systems using water as a secondary standard. Journal of Applied Crystallography. 33 (2), 218-225 (2000).
  33. Srivastava, S., et al. Gel phase formation in dilute triblock copolyelectrolyte complexes. Nature Communications. 8, 14131 (2017).
  34. Lindhoud, S., et al. Salt-induced disintegration of lysozyme-containing polyelectrolyte complex micelles. Langmuir. 25 (19), 11425-11430 (2009).
  35. Lindhoud, S., de Vries, R., Schweins, R., Stuart, M. A. C., Norde, W. Salt-induced release of lipase from polyelectrolyte complex micelles. Soft Matter. 5 (1), 242-250 (2009).
  36. Ilavsky, J., Jemian, P. R. Irena: tool suite for modeling and analysis of small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 347-353 (2009).
  37. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (1989).
  38. Jakeš, J. Regularized positive exponential sum (REPES) program-A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. Collection of Czechoslovak Chemical Communications. 60 (11), 1781-1797 (1995).
  39. Schillen, K., Brown, W., Johnsen, R. M. Micellar Sphere-to-Rod Transition in an Aqueous Triblock Copolymer System – a Dynamic Light-Scattering Study of Translational and Rotational Diffusion. Macromolecules. 27 (17), 4825-4832 (1994).
  40. Provencher, S. W. Contin – a General-Purpose Constrained Regularization Program for Inverting Noisy Linear Algebraic and Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 229-242 (1982).
  41. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method for Inverting Data Represented by Linear Algebraic or Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 213-227 (1982).
  42. Sarachan, K. L., Curtis, J. E., Krueger, S. Small-angle scattering contrast calculator for protein and nucleic acid complexes in solution. Journal of Applied Crystallography. 46 (6), 1889-1893 (2013).
  43. Beaucage, G. Approximations leading to a unified exponential power-law approach to small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 717-728 (1995).
  44. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. . Materials Data Facility. , (2018).
  45. Modena, M. M., Rühle, B., Burg, T. P., Wuttke, S. Nanoparticle Characterization: What to Measure. Advanced Materials. , (2019).
  46. Mourdikoudis, S., Pallares, R. M., Thanh, N. T. K. Characterization techniques for nanoparticles: comparison and complementarity upon studying nanoparticle properties. Nanoscale. 10 (27), 12871-12934 (2018).

Play Video

Cite This Article
Marras, A. E., Vieregg, J. R., Tirrell, M. V. Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles. J. Vis. Exp. (157), e60894, doi:10.3791/60894 (2020).

View Video