Summary

Assemblaggio e caratterizzazione di Micelle complesse di polielettroliti

Published: March 02, 2020
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Summary

Forniamo protocolli e dati rappresentativi per la progettazione, l’assemblaggio e la caratterizzazione di micelle complesse di polielettroliti, nanoparticelle core-shell formate da polielettroliti e copolimeri a blocchi caricati caricati idrofili.

Abstract

Le micelle complesse di polielettroti , nanoparticelle core-shell formate dall’auto-assemblaggio di polimeri caricati in una soluzione acquosa, forniscono una potente piattaforma per esplorare la fisica delle interazioni polielettrolitiche e offrono anche una soluzione promettente per il problema pressante di fornire oligonucleotidi terapeutici in vivo. Lo sviluppo di relazioni struttura-proprietà predittiva per i PCM si è rivelato difficile, in parte a causa della presenza di forti trappole cinetiche durante l’auto-assemblaggio delle nanoparticelle. Questo articolo illustra i criteri per la scelta dei polimeri per la costruzione PCM e fornisce protocolli basati sull’annealing del sale che consentono l’assemblaggio di nanoparticelle ripetibili e a bassa polidisità. Discutiamo anche della caratterizzazione pcM utilizzando la dispersione della luce, la dispersione a raggi X a piccolo angolo e la microscopia elettronica.

Introduction

Quando i polielettroliti caricati in modo opposto vengono mescolati in una soluzione acquosa, il guadagno entropia derivante dal rilascio delle loro contropartite provoca la demixazione della soluzione in una fase condensata ricca di polimeri e un supernatale impoverito di polimeri1,2,3,4, 5, un fenomeno noto come complessità polielettrolitale. Se un blocco idrofilo neutro viene coniugato a uno o a entrambi i polielettroliti, si verifica invece la separazione di fase su nanoscala (Figura 1A). Le nanoparticelle di nucleo-guscio autoassemblate risultanti sono variamente indicate come micelle complesse di polielettroliti (PCM), micelle complesse di poliione, complessi ionomerici a blocchi o micelle coacervate-core per analogia alla micellizzazione surrogata, anche se tutti i componenti del sistema sono idrofili6,7. La capacità di un PCM di incapsulare molecole idrofile come proteine e acidi nucleici, così come l’ampia sintonizzabilità offerta dall’architettura portante del copolimero a blocchi li rende interessanti candidati per la fornitura di molecole terapeutiche in vivo8,9,10,11,12,13.

Fornire acidi nucleici terapeutici a bersagli cellulari è una sfida particolarmente importante, per la quale i PCM offrono diversi vantaggi. Gli acidi nucleici terapeutici (DNA genetico, mRNA e oligonucleotidi come il siRNA) hanno un immenso potenziale per migliorare la salute umana, ma devono superare numerose barriere biologiche e fisiche per rendersi conto che il potenziale14,15,16. Gli acidi nucleici nudi nudi cisierizzano sono degradati da nucleasi cellulari e di siero, vengono rapidamente eliminati dalla circolazione e la loro forte carica negativa rende difficile per loro penetrare le membrane cellulari senza assistenza. Gli attuali approcci per il superamento di queste barriere includono costose modifiche chimiche per prevenire danni da nucleasi e/o incapsulamento in varie nanoparticelle di lipidi assemblate tramite interazioni idrofobiche15,17,18. Mentre questi metodi si sono dimostrati efficaci per iniezioni locali e targeting del fegato, uso sistemico presenta limitazioni significative di tossicità, immunogenicità, e biodistribuzione limitata16. Al contrario, i PCM utilizzano la carica negativa degli acidi nucleici per condensarli all’interno del nucleo separato da fase, mentre la corona neutra fornisce una barriera sterica contro la degradazione e una piattaforma per incorporare ligandi per migliorare il targeting o l’internalizzazione11,19. Studi in vitro e sugli animali hanno dimostrato che i PCM possono fornire efficacemente vari carichi utili di acido nucleico20,21,22,23,24, ma debolezze nella nostra capacità di prevedere le proprietà PCM come dimensioni, forma e stabilità dalle proprietà dei polimeri costituenti hanno ostacolato la loro più ampia adozione.

Il recente lavoro del nostro gruppo e di altri nel campo ha iniziato ad affrontare questo problema sviluppando la proprietà-struttura, e in alcuni casi le relazioni struttura-proprietà-funzione per PCM formate da acidi nucleici e vari polimeri cationici-neutri7,25,26,27. Due temi coerenti che sono emersi da questi studi sono l’importanza di sviluppare protocolli ben controllati e ripetibili per l’assemblaggio di PCM e il vantaggio di utilizzare più tecniche per caratterizzare le nanoparticelle risultanti. I polielettroliti, in particolare quelli ad alta densità di carica come gli acidi nucleici, interagiscono tra loro molto fortemente e sembrano facilmente rimanere cineticamente intrappolati durante la miscelazione, dando luogo a preparazioni PCM che sono altamente sensibili alle piccole variazioni nella procedura e mostrano un’elevata polidispersità e scarsa ripetibilità da lotto a lotto. I PCM hanno anche dimostrato di adottare una vasta gamma di forme e dimensioni a seconda delle configurazioni a livello atomico dei loro componenti, e catturare questa diversità con qualsiasi tecnica di caratterizzazione individuale è molto difficile, soprattutto perché alcune tecniche comuni come la dispersione dinamica della luce (DLS) richiedono ipotesi sulla forma delle particelle per la loro interpretazione.

In questo articolo, discutiamo di progettazione e selezione dei materiali per i PCM, con particolare attenzione agli oligonucleotidi e agli copolimeri di disblocco cationici-neutri. Descriviamo quindi un protocollo di annessione del sale che utilizza alte concentrazioni di sale seguite da dialisi lenta per evitare l’intrappolamento cinetico durante l’assemblaggio del PCM. I polielettroliti vengono mescolati in condizioni di sale elevato in cui vengono schermate le attrazioni elettrostatiche, quindi la concentrazione di sale viene lentamente abbassata per consentire ai polielettroliti di stabilirsi nelle loro configurazioni più favorevoli dal punto di vista energetico, analogamente al lento processo di raffreddamento dell’annealing termico. Utilizzando questo protocollo, siamo regolarmente in grado di ottenere polidispersità eccezionalmente bassa e alta ripetibilità per oligonucleotide PCMs7,26. Infine, descriviamo come quattro tecniche di misurazione separate possono essere utilizzate per caratterizzare i PCM su un’ampia gamma di scale di lunghezza, dalla morfologia esterna alla struttura interna: DLS, dispersione della luce multi-angolo (MALS), dispersione a raggi X a piccolo angolo (SAXS) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Speriamo che questi protocolli consentano a più ricercatori di esplorare efficacemente le capacità di queste interessanti nanoparticelle.

Selezione e preparazione del polimero
Le proprietà PCM sono fortemente influenzate dalle caratteristiche fisiche e chimiche dei polimeri costituenti, rendendo la selezione dei polimeri una fase critica nel processo di progettazione. I copolimeri a blocchi più caratterizzati per i PCM acidi nucleici sono blocchi lineari come poly(lysine)-poly(ethylene glycol) (pLys-PEG), ma i PCM possono essere formati tra polielettroti e una varietà di polimeri idrofili a carica neutra, che possono essere generati in modo ad alta velocità28. La scelta del gruppo carico influisce fortemente sulla stabilità dell’abbinamento ionista e sulla forma delle micelle26,e la dimensione del PCM è stata dimostrata aumentare con la lunghezza del blocco caricato5,7,26 (Figura 2), consentendo così di tessere le proprietà PCM per i requisiti di un’applicazione desiderata. Per gli sblocchi lineari, abbiamo scoperto che il blocco caricato dovrebbe avere almeno 10 cariche ed essere fortemente caricato al pH desiderato. Blocchi caricati più lunghi possono promuovere la formazione di PCM con oligonucleotidi come il siRNA, che sono difficili da complesso con blocchi più brevi21. Abbiamo osservato con successo la formazione di PCM con lunghezze di blocco fino a 200, e la letteratura descrive polimeri più lunghi. Più flessibilità è disponibile nella scelta dei blocchi neutri24, ma l’esperienza ha dimostrato che blocchi neutri molto brevi portano all’aggregazione piuttosto che alla formazione di nanoparticelle, e che la lunghezza minima neutra aumenta con la lunghezza del blocco caricato. Per pLys-PEG, è necessario un PEG MW di almeno 3.000-5.000 per lunghezze di pLys inferiori a 50 dollari e sono necessarie lunghezze più lunghe man mano che il blocco caricato aumenta ulteriormente. L’aumento della lunghezza del blocco neutro comporta un aumento delle dimensioni del PCM, in particolare lo spessore del guscio, a causa dell’affollamento sterico dei polimeri neutri.

Questo manoscritto presenta un protocollo per la preparazione di PCM da pLys-PEG e oligonucleotidi di quantità nota lyophilizzata, ma dovrebbe essere facilmente adattabile anche ad altri sistemi. L’abbiamo testato con successo con diversi polipeptidi caricati, tra cui la poliargina e l’acido poliglutamico, così come diversi polielettroliti sintetici, come l’acido poliacrilico e il polietilene(vinylbenzyl trimethylammonium). Descriviamo anche la preparazione di PCM con un rapporto stoichiometrico di cariche di poligliti, ma questo è facilmente modificabile. Troviamo più facile lavorare in unità di concentrazione di carica (c.c.), che ospita anche naturalmente polimeri che non sono completamente caricati. Se uno dei polimeri non è ben caratterizzato, occorre prestare attenzione a determinare con precisione le lunghezze/masse di polimeri e garantire che il sale in eccesso non sia presente oltre quello necessario per la neutralizzazione della carica mediante dialisi, ad esempio. La presenza di acqua trattenuta deve essere contabilizzato anche quando vengono calcolate le concentrazioni. La concentrazione di acido nucleico può essere convenientemente quantificata mediante assorbimento a 260 nm e la presenza o l’assenza di fosfati terminali deve essere considerata nel calcolo del c.c.

Quando si utilizzano oligonucleotidi come polianioni, lo stato di ibridazione e la struttura chimica aiutano a determinare la propensione per l’auto-assemblaggio e le caratteristiche del PCM risultante5,7,26. L’ottimizzazione di questi, entro i requisiti di efficacia biologica se si utilizzano PCM per la consegna, aumenterà la probabilità di formare le strutture desiderate. Strumenti utili per l’analisi dell’ibridazione includono le funzioni MATLAB per gli acidi nucleici, NUPACK29e IDT OligoAnalyzer. Si consiglia di analizzare una sequenza candidata per comprendere la forza di legame a 1) se stesso in una formazione forcina; 2) un’altra copia della stessa sequenza (auto-dimero); e 3) ad altri oligonucleotidi presenti nel sistema. Le temperature di fusione del DNA e dell’RNA per una sequenza specifica possono anche essere calcolate utilizzando il metodo più vicino30,31. L’annessione termico degli acidi nucleici (passaggio 2.3) denatura qualsiasi struttura secondaria residua nei singoli nucleotidi e favorisce il ripiegamento dell’equilibrio.

Caratterizzazione e analisi PCM
È disponibile un’ampia gamma di tecniche per caratterizzare le nanoparticelle, tra cui la dispersione statica e dinamica della luce, la dispersione di piccoli angoli di elettroni o neutroni e la microscopia elettronica. In questo articolo, forniamo protocolli per due tecniche di diffusione della luce, la dispersione a raggi X a piccolo angolo e due tecniche di microscopia elettronica.

DLS misura l’autocorrelazione delle fluttuazioni temporali nell’intensità di dispersione ad un angolo dal moto browniano del campione. L’installazione di questi dati può fornire raggio idrodinamico e polidispersione per le micelle sferiche (Figura 3). La dispersione della luce a più angoli (MALS) misura l’intensità di dispersione statica a molti angoli. Questa dipendenza angolare descrive la forma della nanoparticella, ma è limitata a scale di lunghezza più lunghe di 50 nm per la luce visibile, che ne limita l’efficacia per le nanoparticelle più piccole. Entrambe le tecniche si basano sulla mancata corrispondenza dell’indice di rifrazione e descrivono principalmente le dimensioni esterne della nanoparticella.

La dispersione a raggi X ad angolo ridotto (SAXS) utilizza i raggi X come sonda di dispersione e la loro lunghezza d’onda più corta consente misurazioni su un intervallo di 0,1–100 nm. L’adattamento dell’intensità di dispersione osservata rispetto all’angolo (convenzionalmente espresso come trasferimento di momentum q) fornisce informazioni sulla morfologia PCM (ad esempio, dimensioni e forma) e anche sulla struttura interna. Se è disponibile una calibrazione di intensità assoluta, e se l’intensità di dispersione può essere estrapolata ad angolo zero, la massa PCM e il numero di aggregazione possono anche essere stimati32, rendendo SAXS un metodo estremamente versatile e prezioso. La SANS (Small angle neutron scattering) è sensibile su una gamma simile di scale di lunghezza, ma è disponibile solo presso strutture specializzate e non sarà discussa esplicitamente in questo articolo33,34,35.

Negli ultimi anni abbiamo visto l’avvento degli strumenti SAXS da banco, ma scopriamo che le sorgenti di sincrotrone sono più adatte per la caratterizzazione PCM, poiché la loro maggiore intensità consente di raccogliere i dati molto più velocemente per questi campioni a basso contrasto. Forniamo un breve protocollo per l’acquisizione di dati PCM SAXS presso Beamline 12-ID-B presso l’Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) dal punto di vista dell’utente. Questo protocollo dovrebbe essere applicabile alla maggior parte delle fonti di sincrotrone, ma è altamente consigliabile consultare il personale locale prima di proporre un esperimento. Forniamo anche un protocollo di riduzione e analisi dei dati utilizzando Irena36, un insieme gratuito di macro scritte per Igor Pro. Irena include un insieme versatile di fattori di forma per la modellazione dei dati SAXS e consente la costruzione di modelli multicomponente in grado di descrivere il profilo di dispersione complesso dei PCM (vedere Risultati rappresentativi, Figura 4). Irena ha anche una documentazione completa e tutorial disponibili online. Prima di tentare le procedure riportate di seguito, si consiglia di familiarizzare con questi, in particolare il tutorial “Modellazione dei dati SAXS con due principali popolazioni di scatterer”.

Il danno da radiazioni è una preoccupazione per la dispersione dei raggi X, ma possono essere impiegate diverse misure per ridurlo al minimo. In particolare, si consiglia di utilizzare una configurazione di celle di flusso con una pompa di siringa e un campione PCM che scorre durante l’acquisizione dei dati, piuttosto che un capillare sigillato. Questo semplifica notevolmente anche la sottrazione in background. Suggeriamo inoltre di assumere esposizioni multiple del campione che scorre piuttosto che una più lunga per limitare il flusso che ogni singolo volume di campione vede e per consentire il confronto dei dati di esposizione per identificare eventuali danni.

A differenza delle tecniche di dispersione, che generalmente richiedono il montaggio per interpretare, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) fornisce un’immagine visiva dello spazio reale delle nanoparticelle passando un fascio di elettroni attraverso il campione e proiettando un’immagine su uno schermo di scintillazione (Figura 5). In questo articolo presentiamo protocolli per due tecniche TEM. Cryo TEM congela i campioni di micelle in un sottile strato di ghiaccio vitreo, preservando la conformazione strutturale con sostanze estranee minime, ottimale per le micelle a 10-100 nm nel raggio. Il TEM con macchie negative utilizza un sale metallico pesante (ad esempio, l’uranio) per circondare il campione dopo che è stato essiccato sulla superficie di una griglia. La macchia densa disperderà più elettroni del campione, aggiungendo contrasto e producendo un’immagine negativa del campione. Cryo TEM è consigliato per immagini di alta qualità. Tuttavia, è più costoso, richiede tempo e potrebbe non fornire un contrasto sufficiente. Quando questo è un problema, campioni macchiati negativi dovrebbero essere utilizzati. Esempi di ciascuno sono mostrati figura 5.

Ognuna di queste tecniche riporta aspetti leggermente diversi delle nanoparticelle, con diversi punti di forza e limitazioni. La dispersione della luce è prontamente disponibile ed è spesso l’approccio più veloce, ma presenta notevoli limitazioni in termini di dimensioni e risoluzione della forma. SAXS può fornire informazioni su un’ampia gamma di scale di lunghezza a velocità effettiva ragionevolmente elevata, ma richiede apparecchiature specializzate per acquisire i dati, nonché la modellazione per interpretarli. Le immagini TEM sono semplici da interpretare, ma possono essere limitate al contrario e sono intrinsecamente basse. La nostra esperienza ha dimostrato che l’utilizzo di più tecniche per la caratterizzazione aumenta notevolmente le informazioni che possono essere ottenute sulle proprietà PCM e semplifica l’interpretazione dei set di dati ottenuti da ciascuno solo di essi. Ad esempio, SAXS e TEM esaminano principalmente il nucleo denso di un PCM, mentre la dispersione della luce riferisce sulle dimensioni complessive della nanoparticella. Così, combinandoli permette la misurazione della dimensione del nucleo e della corona. La capacità di TEM di acquisire immagini di spazi reali può fornire dati sulla verità del terreno per consentire la selezione di fattori di forma appropriati per la modellazione di dati SAXS che potrebbero altrimenti essere ambigui. In questo articolo vengono descritti i protocolli per tutte e quattro le tecniche e nella sezione Discussione viene fornito un processo di esempio per il loro utilizzo per caratterizzarne un esempio sconosciuto.

Protocol

1. Preparazione dei materiali Pesare il polimero del diblock lofilfato e aggiungere acqua fino a quasi il volume necessario per una soluzione di riserva di 10 mg/mL di concentrazione finale. Vortice alla massima velocità per 2 min. Sonicato per 5 min. Gli sblocchi molto lunghi possono richiedere una sonicazione aggiuntiva. La soluzione stock dovrebbe apparire completamente trasparente e omogenea. Regolare pH a 7.4 utilizzando NaOH o HCl in base alle esigenze. Aggiungere acqua al volume fina…

Representative Results

Per illustrare i metodi di caratterizzazione descritti in precedenza, mostriamo risultati tipici per i PCM assemblati da oligonucleotidi e copolimeri a blocchi di varie lunghezze e sostanze chimiche (Figura 1). Figura 2 fornisce un esempio di come le dimensioni del nucleo PCM (come determinato da SAXS e TEM, Figura 4 e Figura 5) variava con lunghezza del blocco caricato. La figura 3…

Discussion

Come accennato in precedenza, i protocolli qui presentati sono scritti con un focus sugli oligonucleotidi come componente di polianione e pLys-PEG come copolisimero di blocchi cationici-neutri-neutri, ma li abbiamo testati con una varietà di polimeri, come polimero (acido acrilico), poliglutamate e PEG-poly (vinybenzl’altro trimethylammonium), e crediamo che saranno generalmente applicabili per la maggior parte delle coppie polielettroli. Un parametro che potrebbe essere necessario ottimizzare è la concentrazione di sa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Phil Griffin e Tera Lavoie del Soft Matter Characterization Facility e Advanced Electron Microscopy Facility, rispettivamente, presso l’Università di Chicago. Ringraziamo anche xiao bing Eo e Soenke Seifert dell’Advanced Photon Source presso l’Argonne National Laboratory e il NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) per il supporto. Ringraziamo Jeff Ting e Michael Lueckheide per il loro contributo a questo lavoro.

Materials

70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k – PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

References

  1. Spruijt, E., Westphal, A. H., Borst, J. W., Cohen Stuart, M. A., van der Gucht, J. Binodal compositions of polyelectrolyte complexes. Macromolecules. 43 (15), 6476-6484 (2010).
  2. van der Gucht, J., Spruijt, E., Lemmers, M., Cohen Stuart, M. A. Polyelectrolyte complexes: bulk phases and colloidal systems. Journal of Colloid and Interface Science. 361 (2), 407-422 (2011).
  3. Priftis, D., Laugel, N., Tirrell, M. Thermodynamic characterization of polypeptide complex coacervation. Langmuir. 28 (45), 15947-15957 (2012).
  4. Fu, J., Schlenoff, J. B. Driving Forces for Oppositely Charged Polyion Association in Aqueous Solutions: Enthalpic, Entropic, but Not Electrostatic. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 980-990 (2016).
  5. Vieregg, J. R., et al. Oligonucleotide-Peptide Complexes: Phase Control by Hybridization. Journal of the American Chemical Society. 140 (5), 1632-1638 (2018).
  6. Voets, I. K., de Keizer, A., Cohen Stuart, M. A. Complex coacervate core micelles. Advances in Colloid and Interface Science. 147-148, 300-318 (2009).
  7. Lueckheide, M., Vieregg, J. R., Bologna, A. J., Leon, L., Tirrell, M. V. Structure-Property Relationships of Oligonucleotide Polyelectrolyte Complex Micelles. Nano Letters. 18 (11), 7111-7117 (2018).
  8. De Kruif, C. G., Weinbreck, F., de Vries, R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 9 (5), 340-349 (2004).
  9. Vieregg, J. R., Tang, T. Y. D. Polynucleotides in cellular mimics: Coacervates and lipid vesicles. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 26, 50-57 (2016).
  10. Marciel, A. B., Chung, E. J., Brettmann, B. K., Leon, L. Bulk and nanoscale polypeptide based polyelectrolyte complexes. Advances in Colloid and Interface Science. 239, 187-198 (2017).
  11. Cabral, H., Miyata, K., Osada, K., Kataoka, K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications. Chemical Reviews. 118 (14), 6844-6892 (2018).
  12. Tan, Z., et al. Block Polymer Micelles Enable CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery: Physicochemical Properties Affect Packaging Mechanisms and Gene Editing Efficiency. Macromolecules. 52 (21), 8197-8206 (2019).
  13. Horn, J. M., Kapelner, R. A., Obermeyer, A. C. Macro- and Microphase Separated Protein-Polyelectrolyte Complexes: Design Parameters and Current Progress. Polymers. 11 (4), 578 (2019).
  14. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  15. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  16. Lorenzer, C., Dirin, M., Winkler, A. M., Baumann, V., Winkler, J. Going beyond the liver: progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release. 203, 1-15 (2015).
  17. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
  18. Li, W., Szoka, F. C. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharmaceutical Research. 24 (3), 438-449 (2007).
  19. Miyata, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2562-2574 (2012).
  20. Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile ss-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. Journal of the American Chemical Society. 127 (6), 1624-1625 (2005).
  21. Christie, R. J., et al. Targeted polymeric micelles for siRNA treatment of experimental cancer by intravenous injection. ACS Nano. 6 (6), 5174-5189 (2012).
  22. Kuo, C. H., et al. Inhibition of atherosclerosis-promoting microRNAs via targeted polyelectrolyte complex micelles. Journal of Materials Chemistry B. 2 (46), 8142-8153 (2014).
  23. Ge, Z., et al. Targeted gene delivery by polyplex micelles with crowded PEG palisade and cRGD moiety for systemic treatment of pancreatic tumors. Biomaterials. 35 (10), 3416-3426 (2014).
  24. Van Bruggen, C., Hexum, J. K., Tan, Z., Dalai, R. J., Reineke, T. M. Nonviral Gene Delivery with Cationic Glycopolymers. Accounts of Chemical Research. 52 (5), 1347-1358 (2019).
  25. Hayashi, K., et al. Influence of RNA Strand Rigidity on Polyion Complex Formation with Block Catiomers. Macromolecular Rapid Communications. 37 (6), 486-493 (2016).
  26. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Polyelectrolyte Complexation of Oligonucleotides by Charged Hydrophobic-Neutral Hydrophilic Block Copolymers. Polymers. 11 (1), 83 (2019).
  27. Phillips, H. R., et al. Glycopolycation-DNA Polyplex Formulation N/P Ratio Affects Stability, Hemocompatibility, and in Vivo Biodistribution. Biomacromolecules. 20 (4), 1530-1544 (2019).
  28. Ting, J. M., Wu, H., Herzog-Arbeitman, A., Srivastava, S., Tirrell, M. V. Synthesis and Assembly of Designer Styrenic Diblock Polyelectrolytes. ACS Macro Letters. 7 (6), 726-733 (2018).
  29. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  30. Santa Lucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1460-1465 (1998).
  31. Xia, T., et al. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs. Biochemistry. 37 (42), 14719-14735 (1998).
  32. Orthaber, D., Bergmann, A., Glatter, O. SAXS experiments on absolute scale with Kratky systems using water as a secondary standard. Journal of Applied Crystallography. 33 (2), 218-225 (2000).
  33. Srivastava, S., et al. Gel phase formation in dilute triblock copolyelectrolyte complexes. Nature Communications. 8, 14131 (2017).
  34. Lindhoud, S., et al. Salt-induced disintegration of lysozyme-containing polyelectrolyte complex micelles. Langmuir. 25 (19), 11425-11430 (2009).
  35. Lindhoud, S., de Vries, R., Schweins, R., Stuart, M. A. C., Norde, W. Salt-induced release of lipase from polyelectrolyte complex micelles. Soft Matter. 5 (1), 242-250 (2009).
  36. Ilavsky, J., Jemian, P. R. Irena: tool suite for modeling and analysis of small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 347-353 (2009).
  37. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (1989).
  38. Jakeš, J. Regularized positive exponential sum (REPES) program-A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. Collection of Czechoslovak Chemical Communications. 60 (11), 1781-1797 (1995).
  39. Schillen, K., Brown, W., Johnsen, R. M. Micellar Sphere-to-Rod Transition in an Aqueous Triblock Copolymer System – a Dynamic Light-Scattering Study of Translational and Rotational Diffusion. Macromolecules. 27 (17), 4825-4832 (1994).
  40. Provencher, S. W. Contin – a General-Purpose Constrained Regularization Program for Inverting Noisy Linear Algebraic and Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 229-242 (1982).
  41. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method for Inverting Data Represented by Linear Algebraic or Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 213-227 (1982).
  42. Sarachan, K. L., Curtis, J. E., Krueger, S. Small-angle scattering contrast calculator for protein and nucleic acid complexes in solution. Journal of Applied Crystallography. 46 (6), 1889-1893 (2013).
  43. Beaucage, G. Approximations leading to a unified exponential power-law approach to small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 717-728 (1995).
  44. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. . Materials Data Facility. , (2018).
  45. Modena, M. M., Rühle, B., Burg, T. P., Wuttke, S. Nanoparticle Characterization: What to Measure. Advanced Materials. , (2019).
  46. Mourdikoudis, S., Pallares, R. M., Thanh, N. T. K. Characterization techniques for nanoparticles: comparison and complementarity upon studying nanoparticle properties. Nanoscale. 10 (27), 12871-12934 (2018).

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Cite This Article
Marras, A. E., Vieregg, J. R., Tirrell, M. V. Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles. J. Vis. Exp. (157), e60894, doi:10.3791/60894 (2020).

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