Montering og karakterisering av polyelektrolyttkompleks micelles

Summary

Vi tilbyr protokoller og representative data for utforming, montering og karakterisering av polyelektrolyte komplekse micelles, kjerneskall nanopartikler dannet av polyelektrolytter og hydrofile ladede blokkkopolymerer.

Abstract

Polyelektrolyte komplekse micelles (PCMer), kjerneskall nanopartikler dannet av selvmontering av ladede polymerer i vandig løsning, gir en kraftig plattform for å utforske fysikken til polyelektrolyttinteraksjoner og tilbyr også en lovende løsning for å det presserende problemet med å levere terapeutiske oligonucleotides in vivo. Å utvikle prediktive struktur-eiendomsforhold for PCMer har vist seg vanskelig, delvis på grunn av tilstedeværelsen av sterke kinetiske feller under nanopartikkel selvmontering. Denne artikkelen diskuterer kriterier for valg av polymerer for PCM-konstruksjon og gir protokoller basert på saltannealing som muliggjør montering av repeterbare nanopartikler med lav polydispersitet. Vi diskuterer også PCM-karakterisering ved hjelp av lysspredning, småvinkelrøntgenspredning og elektronmikroskopi.

Introduction

Når motsatt ladede polyelektrolytter blandes i vandig løsning, entropi gevinst fra frigjøring av sine motsmoter forårsaker demixing av løsningen i en polymer-rik kondensert fase og en polymer-utarmet supernatant^1,2,3,4,5, et fenomen kjent som polyelektrolytt kompleksasjon. Hvis en nøytral hydrofil blokk konjugerert til en eller begge polyelektrolytter, oppstår nanoskalafaseseparasjon i stedet (figur 1A). De resulterende selvmonterte kjerneskall nanopartikler er forskjellig referert til som polyelektrolyte komplekse micelles (PCMs), polyion kompleks micelles, blokk ionomer komplekser, eller koacervat-core micelles av analogi til overflateaktivt micellization, selv om alle komponenter i systemet er hydrofile^6,7. En PCMs evne til å innkapsle hydrofile molekyler som proteiner og nukleinsyrer, samt den omfattende tunabiliteten som tilbys av blokkkopolymerbærerarkitekturen, gjør dem attraktive kandidater for å levere terapeutiske molekyler in vivo^8,9,10^,11,12,13.

Å levere terapeutiske nukleinsyrer til cellulære mål er en spesielt viktig utfordring, og en som PCMs tilbyr flere fordeler. Terapeutiske nukleinsyrer (genetisk DNA, mRNA og oligonucleotides som siRNA) har enormt potensial for å forbedre menneskers helse, men må overvinne mange biologiske og fysiske barrierer for å innse at^{potensialet 14,15,16}. Bare nukleinsyrer er degradert av serum og cellulære kjerner, blir raskt ryddet fra sirkulasjon, og deres sterke negative ladning gjør det vanskelig for dem å trenge inn i cellemembraner uten hjelp. Nåværende tilnærminger for å overvinne disse barrierene inkluderer kostbare kjemiske modifikasjoner for å forhindre skade fra kjerner og / eller innkapsling i ulike lipidnanopartikler montert via hydrofobe interaksjoner^15,17,18. Mens disse metodene har vist seg effektive for lokale injeksjoner og levermålretting, gir systemisk bruk betydelige begrensninger for toksisitet, immunogenisitet og begrenset biodistribusjon¹⁶. Til sammenligning bruker PCM-er den negative ladningen av nukleinsyrer til å kondensere dem innenfor den faseseparerte kjernen, mens den nøytrale koronaen gir en steric barriere mot nedbrytning samt en plattform for å innlemme ligander for å forbedre målretting eller internalisering^11,19. In vitro og dyrestudier har vist at PCM kan effektivt levere ulike nukleinsyre nyttelaster^{20,21,22,23,24}, men svakheter i vår evne til å forutsi PCM egenskaper som størrelse, form, og stabilitet fra egenskapene til bestanddeler polymerer har hindret deres bredere adopsjon.

Nylig arbeid av vår gruppe og andre i feltet har begynt å løse dette problemet ved å utvikle struktur-eiendom, og i noen tilfeller struktur-eiendom-funksjon relasjoner for PCMer dannet fra nukleinsyrer og ulike kationsyrenøytrale polymerer^7,25,26,27. To konsekvente temaer som har dukket opp fra disse studiene er viktigheten av å utvikle velkontrollerte, repeterbare protokoller for PCM-montering og fordelen av å bruke flere teknikker for å karakterisere de resulterende nanopartiklene. Polyelektrolytter, spesielt de med høy ladningtetthet som nukleinsyrer, samhandler veldig sterkt med hverandre, og ser ut til å lett bli kinetisk fanget ved blanding, noe som resulterer i PCM-preparater som er svært følsomme for små variasjoner i prosedyren og viser høy polydispersitet og dårlig gjentagbarhet fra batch til batch. PCMs har også vist seg å vedta et bredt spekter av former og størrelser avhengig av atomnivåkonfigurasjonene til komponentene sine, og fange dette mangfoldet med individuell karakteriseringsteknikk er svært vanskelig, spesielt siden noen vanlige teknikker som dynamisk lysspredning (DLS) krever antagelser om partikkelform for tolkningen.

I denne artikkelen diskuterer vi materialdesign og valg for PCMer, med fokus på oligonucleotides og kationiske nøytrale diblock kopolymerer. Vi beskriver deretter en salt annealing protokoll som bruker høye saltkonsentrasjoner etterfulgt av langsom dialyse for å unngå kinetisk fangst under PCM montering. Polyelektrolytter blandes i høye saltforhold hvor elektrostatiske attraksjoner screenes, så saltkonsentrasjonen senkes sakte for å tillate polyelektrolytter å bosette seg i sine mest energisk gunstige konfigurasjoner, analogt med den langsomme kjøleprosessen av termisk annealing. Ved hjelp av denne protokollen, vi er regelmessig i stand til å oppnå eksepsjonelt lav polydispersity og høy repeterbarhet for oligonucleotide PCMs^7,26. Til slutt beskriver vi hvordan fire separate måleteknikker kan brukes til å karakterisere PCMer over et svært bredt spekter av lengdeskalaer, fra ekstern morfologi til intern struktur: DLS, flervinslysspredning (MALS), liten vinkel røntgenspredning (SAXS), og transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Vi håper at disse protokollene vil gjøre det mulig for flere forskere å effektivt utforske egenskapene til disse interessante nanopartiklene.

Polymer valg og forberedelse
PCM egenskaper er sterkt påvirket av de fysiske og kjemiske egenskapene til bestanddelene polymerer, noe som gjør polymervalg et kritisk skritt i designprosessen. De mest velkarakteriserte blokkkopolymerer for nukleinsyre-PCMer er lineære diblocks som poly(lysin)-poly(etylenglykol) (pLys-PEG), men PCM-er kan dannes mellom polyelektrolytter og en rekke hydrofile nøytrale ladede polymerer, som kan genereres på en høy^{gjennomstrømningsmåte 28}. Valget av ladet gruppe påvirker stabiliteten til ionparing og form av micelles²⁶, og PCM-størrelse har vist seg å øke med lengden på den ladede blokken^5,7,26 ( Figur2), og dermed tillate PCM egenskaper som skal justeres for kravene til en ønsket applikasjon. For lineære diblocks har vi funnet ut at den siktede blokken skal ha minst 10 kostnader og bli sterkt belastet ved ønsket pH. Lengre ladede blokker kan fremme PCM-dannelse med oligonucleotides som siRNA, som er vanskelig å komplekse med kortere blokker²¹. Vi har observert PCM-dannelse med blokklengder opp til 200, og litteraturen beskriver lengre polymerer. Mer fleksibilitet er tilgjengelig i valg av nøytrale blokker²⁴, men erfaring har vist at svært korte nøytrale blokker fører til aggregering i stedet for nanopartikkeldannelse, og at den minste nøytrale lengden øker med ladet blokklengde. For pLys-PEG kreves en PEG MW på minst 3000–5000 for pLys lengder under ~ 50, og lengre lengder kreves som den ladede blokken økes ytterligere. Økt nøytral blokklengde resulterer i økt PCM-størrelse, spesielt skalltykkelse, på grunn av steric trengsel av nøytrale polymerer.

Dette manuskriptet presenterer en protokoll for å forberede PCMer fra lyofiliserte høyrenhet pLys-PEG og oligonucleotides av kjent mengde, men bør være lett tilpasningsdyktig til andre systemer også. Vi har testet det med hell med flere ladede polypeptider, inkludert polyarginin og polyglutaminsyre, samt flere syntetiske polyelektrolytter, som polyakrylsyre og poly(vinylbenzyltrimetylammonium). Vi beskriver også å forberede PCMs med et stoichiometrisk forhold mellom polyelektrolyttladninger, men dette er lett å endre. Vi finner det enklest å arbeide i ladekonsentrasjonenheter (c.c.), som også naturlig rommer polymerer som ikke er fulladet. Hvis enten polymer ikke er godt karakterisert, bør det tas hensyn til nøyaktig å bestemme polymerlengdene/massene og sikre at overflødig salt ikke er til stede utover det som trengs for ladenøytralisering ved dialyse, for eksempel. Tilstedeværelsen av eventuelt beholdt vann bør også redegjøres for når konsentrasjoner beregnes. Nukleinsyrekonsentrasjon kan enkelt kvantifiseres ved absorbans ved 260 nm, og tilstedeværelse eller fravær av terminalfosfater bør vurderes ved beregning av c.c.

Når du bruker oligonucleotides som polyanioner, hybridisering tilstand og kjemisk struktur bidra til å bestemme tilbøyelighet til selvmontering og egenskapene til den resulterende PCM^5,7,26. Optimalisering av disse, innenfor kravene til biologisk effekt hvis du bruker PCMer for levering, vil øke sannsynligheten for å danne de ønskede strukturene. Nyttige verktøy for å analysere hybridisering inkluderer MATLAB-funksjoner for nukleinsyrer, NUPACK²⁹og IDT OligoAnalyzer. Vi anbefaler å analysere en kandidatsekvens for å forstå styrken av binding til 1) seg selv i en hårnålformasjon; 2) en annen kopi av samme sekvens (selv-dimer); og 3) til andre oligonucleotides tilstede i systemet. DNA og RNA smeltetemperaturer for en bestemt sekvens kan også beregnes ved hjelp av nærmeste nabo metode^30,31. Termisk annealing av nukleinsyrer (trinn 2.3) denatures noen gjenværende sekundær struktur i de enkelte nukleotider og fremmer likevekt folding.

PCM karakterisering og analyse
Et bredt spekter av teknikker er tilgjengelig for karakterisering av nanopartikler, inkludert statisk og dynamisk lysspredning, liten vinkelspredning av elektroner eller nøytroner og elektronmikroskopi. I denne artikkelen gir vi protokoller for to lysspredningsteknikker, liten vinkel røntgenspredning og to elektronmikroskopiteknikker.

DLS måler autokorrelasjonen av temporale svingninger i spredningsintensitet i en vinkel fra Brownian-bevegelsen til prøven. Montering av disse dataene kan gi hydrodynamisk radius og polydispersitet for sfæriske micelles (figur 3). Flere vinkellysspredning (MALS) måler den statiske spredningsintensiteten i mange vinkler. Denne kantete avhengigheten beskriver formen på nanopartikkelen, men er begrenset til lengdeskalaer som er lengre enn ~ 50 nm for synlig lys, noe som begrenser effektiviteten for mindre nanopartikler. Begge teknikkene er basert på brytningsindekskonflikt og beskriver først og fremst de ytre dimensjonene til nanopartikkelen.

Liten vinkel Røntgenspredning (SAXS) bruker røntgenstråler som spredningssonden, og deres kortere bølgelengde tillater målinger over en rekkevidde på ~ 0,1-100 nm. Montering av observert spredningsintensitet vs. vinkel (konvensjonelt uttrykt som momentumoverføring q)gir informasjon om PCM morfologi (dvs. størrelse og form) og også intern struktur. Hvis en absolutt intensitetskalibrering er tilgjengelig, og hvis spredningsintensiteten kan ekstrapoleres til null vinkel, kan PCM-masse- og aggregeringsnummer også anslås³², noe som gjør SAXS til en ekstremt allsidig og verdifull metode. Små vinkel nøytron spredning (SANS) er følsom over et lignende utvalg av lengde skalaer, men er bare tilgjengelig på spesialiserte fasiliteter og vil ikke bli eksplisitt diskutert i denne artikkelen^33,34,35.

De siste årene har sett bruk av benkeplate SAXS instrumenter, men vi finner at synchrotron kilder er bedre egnet for PCM karakterisering, som deres høyere intensitet gjør at data kan samles mye raskere for disse lavkontrast prøver. Vi tilbyr en kort protokoll for å anskaffe PCM SAXS-data på Beamline 12-ID-B ved Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) fra et brukerperspektiv. Denne protokollen bør gjelde for de fleste synchrotron kilder, men rådgivning med lokale ansatte før du foreslår et eksperiment er sterkt anbefalt. Vi tilbyr også en datareduksjons- og analyseprotokoll ved hjelp av Irena³⁶, et gratis sett med makroer skrevet for Igor Pro. Irena inkluderer et allsidig sett med formfaktorer for modellering av SAXS-data og muliggjør bygging av flerkomponentmodeller som er i stand til å beskrive den komplekse spredningsprofilen til PCMer (se Representative resultater, figur 4). Irena har også omfattende dokumentasjon og tutorials tilgjengelig på nettet. Før du prøver prosedyrene nedenfor, anbefaler vi å gjøre seg kjent med disse, spesielt opplæringen “Modellering av SAXS-data med to hovedscatterpopulasjoner”.

Strålingsskader er en bekymring for røntgenspredning, men flere tiltak kan brukes for å minimere den. Spesielt anbefaler vi at du bruker et strømningscelleoppsett med en sprøytepumpe og PCM-prøve som flyter under datainnsamling, i stedet for en forseglet kapillær. Dette forenkler også i stor grad bakgrunnssubtraksjon. Vi foreslår også å ta flere eksponeringer av den flytende prøven i stedet for en lengre for å begrense strømmen som et enkelt utvalgsvolum ser og for å tillate sammenligning av eksponeringsdataene for å identifisere eventuelle skader.

I motsetning til spredningsteknikkene, som vanligvis krever montering for å tolke, gir transmisjonselektronmikroskopi (TEM) et ekte romvisuelt bilde av nanopartiklene ved å sende en elektronstråle gjennom prøven og projisere et bilde på en scintillation-skjerm (Figur 5). Vi presenterer protokoller for to TEM-teknikker i denne artikkelen. Cryo TEM fryser micelleprøver i et tynt lag med glassglassis, og bevarer strukturell konformasjon med minimale fremmede stoffer, optimalt for micelles ≤~10-100 nm i radius. Negativ flekk TEM bruker et tungmetallsalt (f.eks. uran) til å omgi prøven etter at den er tørket på overflaten av et rutenett. Den tette flekken vil spre flere elektroner enn prøven, legge til kontrast og produsere et negativt bilde av prøven. Cryo TEM anbefales for bilder av høy kvalitet. Det er imidlertid dyrere, tidkrevende, og kan ikke gi tilstrekkelig kontrast. Når dette er en bekymring, bør negative fargede prøver brukes. Eksempler på hver av dem vises i figur 5.

Hver av disse teknikkene rapporterer om litt forskjellige aspekter av nanopartiklene, med forskjellige styrker og begrensninger. Lysspredning er lett tilgjengelig, og er ofte den raskeste tilnærmingen, men har betydelige begrensninger i størrelse og formoppløsning. SAXS kan gi informasjon over et stort spekter av lengdeskalaer med rimelig høy gjennomstrømning, men krever spesialisert utstyr for å skaffe dataene, samt modellering for å tolke dem. TEM-bilder er enkle å tolke, men kan begrenses i kontrast og er iboende lav gjennomstrømning. Vår erfaring har vist at bruk av flere teknikker for karakterisering øker informasjonen som kan fås om PCM-egenskaper og forenkler tolkning en datasett hentet fra hver enkelt alene. For eksempel undersøker SAXS og TEM primært en PCMs tette kjerne, mens lysspredning rapporterer om de totale dimensjonene til nanopartikkelen. Dermed, kombinere dem tillater måling av både kjerne og corona størrelse. TEMs evne til å skaffe ekte rombilder kan gi bakkesannhetsdata for å muliggjøre valg av passende formfaktorer for modellering av SAXS-data som ellers kan være tvetydige. Denne artikkelen beskriver protokoller for alle fire teknikker, og en eksempelprosess for å bruke dem til å karakterisere et ukjent utvalg er gitt i Diskusjon-delen.

Protocol

1. Utarbeidelse av materialer Vei ut lyofilisert diblock polymer og tilsett vann opp til nesten volumet som kreves for en lagerløsning på 10 mg / ml endelig konsentrasjon. Vortex med maksimal hastighet i 2 min. Sonicate i 5 min. Svært lange diblocks kan kreve ekstra sonikering. Lagerløsningen skal virke helt gjennomsiktig og homogen. Juster pH til 7,4 med NaOH eller HCl etter behov. Tilsett vann i det endelige volumet. pLys-PEG-løsningene er ganske stabile, men bør kjøles ned for lang…

Representative Results

For å illustrere karakteriseringsmetodene som er beskrevet ovenfor, viser vi typiske resultater for PCMer montert fra oligonucleotides og blokkerer kopolymerer av ulike lengder og kjemi (Figur 1). Figur 2 gir et eksempel på hvordan PCM-kjernestørrelse (som bestemt fra SAXS og TEM, figur 4 og figur 5)varierte med ladet blokklengde. Figur 3 viser DLS-data og tilpasningsres…

Discussion

Som nevnt ovenfor er protokollene som presenteres her skrevet med fokus på oligonucleotides som polyanionkomponenten og pLys-PEG som kationisk nøytral blokkkopolymer, men vi har testet dem med en rekke polymerer, for eksempel poly(akrylsyre), polyglutamat og PEG-poly(vinylbenzyltritylammonium), og tror de generelt vil gjelde for de fleste polyelektrolytepar. En parameter som kanskje må optimaliseres er saltkonsentrasjonen som brukes til annealing, fordi den skal være høy nok til at PCM-er ikke dannes i begynnelsen a…

Materials

70 mm circle filter paper	Whatman	1001-070	Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid	Electron Microscopy Sciences	CF200-Cu	TEM grid
DAWN	Wyatt Technology	DAWN	MALS instrument
DNA oligonucleotide	Integrated DNA Nanotechnologies Inc		Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid	Electron Microscopy Sciences	LC200-Cu	TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k – PLKC50	Alamanda Polymers Inc	mPEG5K-b-PLKC50	Example block copolymer
Milli-Q	Millipore Sigma		Ultrapure water
NanoDrop	Thermo Scientific		For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers	Dumont	N7	Tweezers for grid preparation
Parafilm "M"	Bemis Company Inc	PM996	Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid	Electron Microscopy Sciences	Q210CR1.3	TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System	Brookhaven Instruments	BI-200SM	DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL	Thermo Scientific Pierce Protein Biology	87723	Dialysis cartridge
small volume cuvette	Brookhaven Instruments	BI-SVC	Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System	Gatan	Solarus 950	Plasma system for TEM grids
Talos TEM	FEI	Talos	TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM	FEI	Spirit	TEM used for dry samples
Uranyl Formate	SPI-Chem	16984-59-1	For negative staining samples for TEM
Vitrobot	FEI	Vitrobot	Vitrification robot for cryo grid preparation