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Chemistry

पॉलीइलेक्ट्रोलाइट कॉम्प्लेक्स मिसेल की असेंबली और लक्षण वर्णन

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60894
Automatic Translation
1, 1, 1
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

Summary

हम पॉलीइलेक्ट्रोलाइट कॉम्प्लेक्स मिसेल, पॉलीइलेक्ट्रोलाइट्स और हाइड्रोफिलिक चार्ज-अनचार्ज्ड ब्लॉक कोपॉलिमर द्वारा गठित पॉलीइलेक्ट्रोलाइट कॉम्प्लेक्स मिसेल, कोर-शेल नैनोकणों को डिजाइन करने, कोडांतरण और विशेषता के लिए प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि डेटा प्रदान करते हैं।

Abstract

पॉलीइलेक्ट्रोलाइट कॉम्प्लेक्स मिसेल (पीसीएम), जलीय समाधान में आवेशित बहुलकों की स्व-असेंबली द्वारा गठित कोर-शेल नैनोकण, पॉलीइलेक्ट्रोलाइट इंटरैक्शन की भौतिकी की खोज के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करते हैं और एक आशाजनक समाधान भी प्रदान करते हैं वीवो में चिकित्सीय ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स देने की दबाने की समस्या। पीसीएम के लिए भविष्य कहनेवाला संरचना-संपत्ति संबंधों का विकास करना मुश्किल साबित हुआ है, नैनोपार्टिकल सेल्फ असेंबली के दौरान मजबूत गतिज जाल की उपस्थिति के कारण भाग में। यह लेख पीसीएम निर्माण के लिए पॉलिमर चुनने के मानदंडों पर चर्चा करता है और नमक एनीलिंग के आधार पर प्रोटोकॉल प्रदान करता है जो दोहराने योग्य, कम बहुलता नैनोकणों की असेंबली को सक्षम करता है। हम प्रकाश बिखरने, छोटे कोण एक्स-रे बिखरने और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पीसीएम लक्षण वर्णन पर भी चर्चा करते हैं।

Introduction

जब विपरीत आवेशित पॉलीइलेक्ट्रोलाइट्स को जलीय समाधान में मिलाया जाता है, तो उनके प्रतिकारों की रिहाई से एंट्रोपी लाभ समाधान को बहुलक-समृद्ध संघनित चरण में डीमिक्स करने का कारण बनता है और एक बहुलक-समाप्त अधिनेत1,2,3,4,5,पॉलीइलेक्ट्रोलाइट जटिलके रूप में जानी जाने वाली घटना होती है। यदि एक तटस्थ हाइड्रोफिलिक ब्लॉक पॉलीइलेक्ट्रोलाइट्स के एक या दोनों के लिए संयुग्मित है, नैनोस्केल चरण जुदाई के बजाय होता है(चित्रा 1ए)। परिणामस्वरूप स्व-इकट्ठे कोर-शेल नैनोकणों को विभिन्न रूप से पॉलीइलेक्ट्रोलाइट कॉम्प्लेक्स मिसेल (पीसीएम), पॉलीऑन कॉम्प्लेक्स मिसेल, ब्लॉक आयनोमर कॉम्प्लेक्स, या कोसेरवेट-कोर मिसेल को सादृश्य द्वारा सर्फेक्टेंट मिसेलाइजेशन के रूप में जाना जाता है, भले ही सिस्टम के सभी घटक हाइड्रोफिलिक6,7हैं। प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड जैसे हाइड्रोफिलिक अणुओं को समझाने की पीसीएम की क्षमता, साथ ही ब्लॉक कोपॉलीमर वाहक वास्तुकला द्वारा पेश की जाने वाली व्यापक ट्यूनेबिलिटी उन्हें वीवो8,9,10,11,12,13में चिकित्सीय अणुओं को वितरित करने के लिए आकर्षक उम्मीदवार बनाती है।

सेलुलर लक्ष्यों को चिकित्सीय न्यूक्लिक एसिड पहुंचाना एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण चुनौती है, और एक जिसके लिए पीसीएमएस कई फायदे प्रदान करते हैं। चिकित्सकीय न्यूक्लिक एसिड (आनुवंशिक डीएनए, एमआरएनए, और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स जैसे सिआरएनए) में मानव स्वास्थ्य में सुधार की अपार संभावनाएं हैं, लेकिन संभावित14,15,16को महसूस करने के लिए कई जैविक और शारीरिक बाधाओं को दूर करना चाहिए। नंगे न्यूक्लिक एसिड सीरम और सेलुलर न्यूक्लीज द्वारा अपमानित किए जाते हैं, जल्दी से परिसंचरण से साफ हो जाते हैं, और उनके मजबूत नकारात्मक आवेश से उनके लिए सहायता के बिना कोशिका झिल्ली में प्रवेश करना मुश्किल हो जाता है। इन बाधाओं पर काबू पाने के लिए वर्तमान दृष्टिकोणों में15, 17,18हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन के माध्यम से इकट्ठे हुए विभिन्न लिपिड नैनोकणों में न्यूकलीज और/या एनकैप्सुलेशन से होने वाले नुकसान को रोकने के लिए महंगा रासायनिक संशोधन शामिल हैं । हालांकि इन तरीकों स्थानीय इंजेक्शन और जिगर लक्ष्यीकरण के लिए प्रभावी साबित कर दिया है, प्रणालीगत उपयोग विषाक्तता, इम्यूनोजेनिसिटी, और सीमित जैव वितरण16की महत्वपूर्ण सीमाएं प्रस्तुत करता है । इसके विपरीत, पीसीएमएस न्यूक्लिक एसिड के नकारात्मक आरोप का उपयोग चरण-अलग कोर के भीतर उन्हें गाढ़ा करने के लिए करते हैं, जबकि तटस्थ कोरोना गिरावट के खिलाफ एक स्मेरिक बाधा प्रदान करता है और साथ ही लक्ष्यीकरण या आंतरिककरण11,19को बढ़ाने के लिए लिगांड को शामिल करने के लिए एक मंच प्रदान करता है। इन विट्रो और पशु अध्ययनों से पता चला है कि पीसीएमएस प्रभावी रूप से विभिन्न न्यूक्लिक एसिड पेलोड20,21,22,23,24वितरित कर सकते हैं, लेकिन घटक बहुलकों के गुणों से आकार, आकार और स्थिरता जैसे पीसीएम गुणों की भविष्यवाणी करने की हमारी क्षमता में कमजोरियों ने उनके व्यापक गोद लेने में रुकावट पैदा की है।

हमारे समूह और क्षेत्र के अन्य लोगों द्वारा हाल ही में काम संरचना-संपत्ति विकसित करके इस समस्या का समाधान करना शुरू कर दिया है, और कुछ मामलों में न्यूक्लिक एसिड और विभिन्न सीनिक-तटस्थ बहुलक7,25,26,27से गठित पीसीएमएस के लिए संरचना-संपत्ति-कार्य संबंध। इन अध्ययनों से उभरे दो सुसंगत विषयों में पीसीएम असेंबली के लिए अच्छी तरह से नियंत्रित, दोहराने योग्य प्रोटोकॉल विकसित करने और परिणामस्वरूप नैनोकणों की विशेषता के लिए कई तकनीकों का उपयोग करने का लाभ विकसित करने का महत्व है। पॉलीइलेक्ट्रोलाइट्स, विशेष रूप से न्यूक्लिक एसिड जैसे उच्च आवेश घनत्व वाले, एक दूसरे के साथ बहुत दृढ़ता से बातचीत करते हैं, और मिश्रण पर आसानी से फंस जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप पीसीएम तैयारी होती है जो प्रक्रिया में छोटी विविधताओं के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होती है और बैच से बैच तक उच्च पॉलीहाइविटी और खराब दोहराव प्रदर्शित करती है। PCMs को भी अपने घटकों के परमाणु स्तर के विन्यास के आधार पर आकार और आकार की एक विस्तृत श्रृंखला अपनाने के लिए दिखाया गया है, और किसी भी व्यक्ति लक्षण वर्णन तकनीक के साथ इस विविधता पर कब्जा बहुत मुश्किल है, विशेष रूप से गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) के रूप में कुछ आम तकनीकों के बाद से उनकी व्याख्या के लिए कण आकार के बारे में मांयताओं की आवश्यकता है ।

इस लेख में, हम ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स और सीनिक-न्यूट्रल डिब्लॉक कोपॉलिमर पर ध्यान केंद्रित करने के साथ पीसीएम के लिए सामग्री डिजाइन और चयन पर चर्चा करते हैं। हम तो एक नमक annealing प्रोटोकॉल है कि उच्च नमक सांद्रता का उपयोग करता है धीमी गति से डायलिसिस के बाद पीसीएम विधानसभा के दौरान गतिज फँसाने से बचने का वर्णन । पॉलीइलेक्ट्रोलाइट्स उच्च नमक की स्थिति में मिश्रित होते हैं जहां इलेक्ट्रोस्टैटिक आकर्षणों की जांच की जाती है, फिर नमक एकाग्रता को धीरे-धीरे पॉलीइलेक्ट्रोलाइट्स को अपने सबसे ऊर्जावान अनुकूल विन्यास ों में बसने की अनुमति देने के लिए कम किया जाता है, जो थर्मल एनिंगकी धीमी शीतलन प्रक्रिया के अनुरूप होता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम नियमित रूप से ओलिगोन्यूक्लियोटाइड पीसीएमएस7,26के लिए असाधारण रूप से कम पॉलीडिस्टिहाइव और उच्च दोहराव प्राप्त करने में सक्षम हैं। अंत में, हम वर्णन करते हैं कि बाहरी आकृति विज्ञान से आंतरिक संरचना तक लंबाई तराजू की एक बहुत विस्तृत श्रृंखला पर पीसीएम की विशेषता के लिए चार अलग-अलग माप तकनीकों का उपयोग कैसे किया जा सकता है: डीएलएस, मल्टी-एंगल लाइट बिखरने (माल्स), छोटे कोण एक्स-रे बिखरने (SAXS), और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM)। हमें उम्मीद है कि ये प्रोटोकॉल अधिक शोधकर्ताओं को इन दिलचस्प नैनोकणों की क्षमताओं का प्रभावी ढंग से पता लगाने में सक्षम बनाएंगे ।

बहुलक चयन और तैयारी
पीसीएम गुण घटक बहुलक की भौतिक और रासायनिक विशेषताओं से दृढ़ता से प्रभावित होते हैं, जिससे पॉलीमर चयन डिजाइन प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम हो जाता है। न्यूक्लिक एसिड पीसीएम के लिए सबसे अच्छी तरह से विशेषता वाले ब्लॉक कोपॉलिमर पॉली (लाइसिन) -पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) (प्लिस-खूंटी) जैसे रैखिक डाइब्लॉक हैं, लेकिन पीसीएमएस पॉलीइलेक्ट्रोलाइट्स और विभिन्न प्रकार के हाइड्रोफिलिक न्यूट्रल-चार्ज ्डपॉलीमर के बीच बनाए जा सकते हैं, जिन्हें उच्च थ्रूपुट तरीकेसेउत्पन्न किया जा सकता है। चार्ज किए गए समूह का चुनाव आयन बांधना और मिसेल26के आकार की स्थिरता को दृढ़ता से प्रभावित करता है, और पीसीएम आकार को चार्ज किए गए ब्लॉक5,7,26 (चित्रा 2)की लंबाई के साथ बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, इस प्रकार पीसीएम गुणों को वांछित आवेदन की आवश्यकताओं के लिए देखते होने की अनुमति देता है। रैखिक डिब्लॉकके के लिए हमने पाया है कि आरोपित ब्लॉक में कम से कम 10 आरोप होने चाहिए और वांछित पीएच पर पुरजोर आरोप लगाए जाने चाहिए । लंबे समय तक चार्ज किए गए ब्लॉक सिना जैसे ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ पीसीएम गठन को बढ़ावा दे सकते हैं, जो छोटे ब्लॉक21के साथ जटिल होना मुश्किल है। हमने 200 तक ब्लॉक लंबाई के साथ पीसीएम गठन को सफलतापूर्वक देखा है, और साहित्य लंबे समय तक पॉलीमर का वर्णन करता है। तटस्थ ब्लॉक24की पसंद में अधिक लचीलापन उपलब्ध है, लेकिन अनुभव से पता चला है कि बहुत कम तटस्थ ब्लॉक नैनोपार्टिकल गठन के बजाय एकत्रीकरण का कारण बनते हैं, और चार्ज ब्लॉक लंबाई के साथ न्यूनतम तटस्थ लंबाई बढ़ जाती है। PLys-खूंटी के लिए, ~ 50 से नीचे pLys लंबाई के लिए कम से कम 3,000-5,000 की खूंटी मेगावाट की आवश्यकता होती है, और चार्ज किए गए ब्लॉक को और बढ़ाने के लिए लंबी लंबाई की आवश्यकता होती है। तटस्थ ब्लॉक लंबाई में वृद्धि के परिणामस्वरूप तटस्थ बहुलक ों की स्नैरिक भीड़ के कारण पीसीएम आकार, विशेष रूप से खोल मोटाई में वृद्धि होती है।

यह पांडुलिपि लिओफिलेइज्ड उच्च शुद्धता pLys-खूंटी और ज्ञात मात्रा के ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स से पीसीएम तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है, लेकिन अन्य प्रणालियों के लिए भी आसानी से अनुकूलनीय होना चाहिए। हमने पॉलीआर्गिनाइन और पॉलीग्लूग्मी एसिड, साथ ही पॉलीएक्रेलिक एसिड और पॉली (विनाइलबेंजाइल ट्रिमेथिलमोनियम) जैसे कई सिंथेटिक पॉलीइलेक्ट्रोलाइट्स सहित कई आवेशित पॉलीपेप्टाइड्स के साथ इसका सफलतापूर्वक परीक्षण किया है। हम पॉलीइलेक्ट्रोलाइट शुल्क के स्टोइचियोमेट्रिक अनुपात के साथ पीसीएम तैयार करने का भी वर्णन करते हैं, लेकिन यह आसानी से संशोधित किया जाता है। हमें प्रभारी एकाग्रता इकाइयों (सी.सी.) में काम करना सबसे आसान लगता है, जो स्वाभाविक रूप से बहुलक ों को भी समायोजित करता है जो पूरी तरह से चार्ज नहीं होते हैं। यदि या तो बहुलक अच्छी तरह से विशेषता नहीं है, देखभाल के लिए सही बहुलक लंबाई/जनता का निर्धारण और सुनिश्चित करें कि अतिरिक्त नमक डायलिसिस द्वारा चार्ज बेअसर के लिए आवश्यक से परे मौजूद नहीं है, उदाहरण के लिए लिया जाना चाहिए । जब सांद्रता की गणना की जाती है तो किसी भी बनाए गए पानी की उपस्थिति का भी हिसाब होना चाहिए। न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता को 260 एनएम पर अवशोषित करके आसानी से निर्धारित किया जा सकता है, और सी.सी. की गणना करते समय टर्मिनल फॉस्फेट की उपस्थिति या अनुपस्थिति पर विचार किया जाना चाहिए।

पॉलीएनियन के रूप में ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करते समय, संकरण राज्य और रासायनिक संरचना आत्म-असेंबली के लिए प्रवृत्ति और परिणामस्वरूप पीसीएम5,7,26की विशेषताओं को निर्धारित करने में मदद करती है। यदि डिलीवरी के लिए पीसीएमएस का उपयोग करते हैं, तो जैविक प्रभावकारिता की आवश्यकताओं के भीतर इन्हें अनुकूलित करना वांछित संरचनाओं को बनाने की संभावना में वृद्धि करेगा। संकरण का विश्लेषण करने के लिए सहायक उपकरणों में न्यूक्लिक एसिड, एनयूपैक29और आईडीटी ओलिगोएनालाइजर के लिए मैटलैब कार्य शामिल हैं। हम हेयरपिन गठन में खुद को 1 बाध्यकारी की ताकत को समझने के लिए उम्मीदवार अनुक्रम का विश्लेषण करने की सलाह देते हैं; 2) एक ही अनुक्रम की एक और प्रतिलिपि (आत्म-डिमर); और 3) सिस्टम में मौजूद अन्य ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए। डीएनए और आरएनए एक विशिष्ट अनुक्रम के लिए तापमान पिघलने भी निकटतम पड़ोसी विधि30,31का उपयोग कर गणना की जा सकती है . न्यूक्लिक एसिड (चरण 2.3) की थर्मल एनीलिंग व्यक्तिगत न्यूक्लियोटाइड्स में किसी भी अवशिष्ट माध्यमिक संरचना को विकृत करती है और संतुलन तह को बढ़ावा देती है।

पीसीएम लक्षण वर्णन और विश्लेषण
नैनोकणों की विशेषता के लिए तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध है, जिसमें स्थिर और गतिशील प्रकाश बिखरने, इलेक्ट्रॉनों या न्यूट्रॉन के छोटे कोण बिखरने और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी शामिल हैं। इस लेख में, हम दो प्रकाश बिखरने की तकनीक, छोटे कोण एक्स-रे बिखरने, और दो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीकों के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

डीएलएस नमूने की ब्राउनियन गति से एक कोण पर बिखरने की तीव्रता में लौकिक उतार-चढ़ाव के ऑटोसहिक को मापता है। फिटिंग इस डेटा गोलाकार micelles(चित्रा 3)के लिए हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या और पॉलीहाइविटी प्रदान कर सकते हैं । मल्टीपल एंगल लाइट स्कैटरिंग (माल्स) कई कोणों पर स्थिर बिखरने की तीव्रता को मापता है। यह कोणीय निर्भरता नैनोपार्टिकल के आकार का वर्णन करती है लेकिन दृश्यप्रकाश के लिए ~ 50 एनएम से अधिक लंबाई के तराजू तक सीमित है, जो छोटे नैनोकणों के लिए इसकी प्रभावशीलता को सीमित करती है। दोनों तकनीकें अपवर्तक सूचकांक बेमेल पर आधारित हैं और मुख्य रूप से नैनोपार्टिकल के बाहरी आयामों का वर्णन करती हैं।

छोटे कोण एक्स-रे बिखरने (SAXS) बिखरने की जांच के रूप में एक्स-रे का उपयोग करता है, और उनकी छोटी तरंगदैर्ध्य ~ 0.1-100 एनएम की एक श्रृंखला पर माप की अनुमति देता है। देखा बिखरने तीव्रता बनाम कोण फिटिंग (पारंपरिक गति हस्तांतरण क्यूके रूप में व्यक्त) पीसीएम आकृति विज्ञान (यानी, आकार और आकार) और भी आंतरिक संरचना के बारे में जानकारी प्रदान करता है । यदि एक पूर्ण तीव्रता अंशांकन उपलब्ध है, और यदि बिखरने की तीव्रता को शून्य कोण तक बहिष्कृत किया जा सकता है, तो पीसीएम द्रव्यमान और एकत्रीकरण संख्या का भीअनुमानलगाया जा सकता है, जिससे SAXS एक अत्यंत बहुमुखी और मूल्यवान विधि बन जाती है। छोटे कोण न्यूट्रॉन बिखरने (संस) लंबाई तराजू की एक समान श्रृंखला पर संवेदनशील है, लेकिन केवल विशेष सुविधाओं पर उपलब्ध है और इस अनुच्छेद33,34,35में स्पष्ट रूप से चर्चा नहीं की जाएगी।

हाल के वर्षों में बेंचटॉप SAXS उपकरणों का आगमन देखा है, लेकिन हम पाते है कि सिंक्रोट्रॉन स्रोतों बेहतर पीसीएम लक्षण वर्णन के लिए अनुकूल हैं, के रूप में उनकी उच्च तीव्रता डेटा इन कम विपरीत नमूनों के लिए बहुत तेजी से एकत्र करने की अनुमति देता है । हम उपयोगकर्ता के नजरिए से उन्नत फोटॉन स्रोत (Argonne राष्ट्रीय प्रयोगशाला, यूएसए) में बीमलाइन 12-आईडी-बी में पीसीएम SAXS डेटा प्राप्त करने के लिए एक संक्षिप्त प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल अधिकांश सिंक्रोट्रॉन स्रोतों पर लागू होना चाहिए, लेकिन प्रयोग का प्रस्ताव करने से पहले स्थानीय कर्मचारियों के साथ परामर्श अत्यधिक अनुशंसित है। हम इगोर प्रो के लिए लिखे गए मैक्रो का एक मुफ्त सेट इरेना36का उपयोग करके डेटा कटौती और विश्लेषण प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं। Irena SAXS डेटा मॉडलिंग के लिए फार्म कारकों का एक बहुमुखी सेट भी शामिल है और बहुघटक मॉडल है कि PCMs के जटिल बिखरने प्रोफ़ाइल का वर्णन करने में सक्षम है के निर्माण के लिए अनुमति देता है (प्रतिनिधि परिणामदेखें, चित्रा 4)। Irena भी व्यापक प्रलेखन और ट्यूटोरियल ऑनलाइन उपलब्ध है। नीचे दी गई प्रक्रियाओं का प्रयास करने से पहले, हम इनके साथ परिचित होने की सलाह देते हैं, विशेष रूप से ट्यूटोरियल "दो मुख्य स्कैटरर आबादी के साथ SAXS डेटा का मॉडलिंग"।

रेडिएशन से होने वाली क्षति एक्स-रे बिखरने की चिंता है, लेकिन इसे कम करने के लिए कई उपायों को नियोजित किया जा सकता है। विशेष रूप से, हम एक सील बंद केशिका के बजाय डेटा अधिग्रहण के दौरान बहने वाले सिरिंज पंप और पीसीएम नमूने के साथ फ्लो सेल सेटअप का उपयोग करने की सलाह देते हैं। यह पृष्ठभूमि घटाव को भी बहुत सरल बनाता है। हम यह भी सुझाव देते हैं कि प्रवाह को एक लंबे समय तक सीमित करने के लिए बहने वाले नमूने के कई एक्सपोजर लेने का सुझाव दें ताकि नमूने की किसी भी एक मात्रा को देखा जा सके और किसी भी नुकसान की पहचान करने के लिए एक्सपोजर डेटा की तुलना करने की अनुमति दी जा सके।

बिखरने की तकनीकों के विपरीत, जिसे आम तौर पर व्याख्या करने के लिए फिटिंग की आवश्यकता होती है, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) नमूने के माध्यम से एक इलेक्ट्रॉन बीम पारित करके नैनोकणों की एक वास्तविक अंतरिक्ष दृश्य छवि प्रदान करता है और प्रस्फुटन स्क्रीन(चित्रा 5)पर एक छवि पेश करता है। हम इस लेख में दो TEM तकनीकों के लिए प्रोटोकॉल पेश करते हैं। क्रायो टेम मिसेल नमूनों को विट्रियस बर्फ की एक पतली परत में जमा करता है, न्यूनतम विदेशी पदार्थों के साथ संरचनात्मक संरचना को संरक्षित करता है, त्रिज्या में मिसेल के लिए इष्टतम ‧~ 10-100 एनएम। नकारात्मक दाग TEM एक ग्रिड की सतह पर सूख जाने के बाद नमूने को घेरने के लिए एक भारी धातु नमक (जैसे, यूरेनियम) का उपयोग करता है। घने दाग नमूना की तुलना में अधिक इलेक्ट्रॉनों तितर बितर, इसके विपरीत जोड़ने और नमूने की एक नकारात्मक छवि का उत्पादन होगा । उच्च गुणवत्ता वाली छवियों के लिए क्रायो टेम की सिफारिश की जाती है। हालांकि, यह अधिक महंगा है, समय लेने वाली है, और पर्याप्त विपरीत प्रदान नहीं कर सकता है। जब यह चिंता का विषय है, नकारात्मक दाग नमूनों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । प्रत्येक के उदाहरण चित्र 5में दिखाए गए हैं ।

इन तकनीकों में से प्रत्येक नैनोकणों के थोड़ा अलग पहलुओं पर रिपोर्ट, अलग ताकत और सीमाओं के साथ । प्रकाश बिखरने आसानी से उपलब्ध है, और अक्सर सबसे तेजी से दृष्टिकोण है, लेकिन आकार और आकार संकल्प में पर्याप्त सीमाएं हैं। SAXS काफी उच्च थ्रूपुट पर लंबाई तराजू की एक बड़ी श्रृंखला पर जानकारी प्रदान कर सकता है, लेकिन डेटा प्राप्त करने के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, साथ ही इसकी व्याख्या करने के लिए मॉडलिंग भी होती है। TEM छवियों की व्याख्या करने के लिए सरल हैं, लेकिन इसके विपरीत सीमित किया जा सकता है और स्वाभाविक रूप से कम थ्रूपुट हैं। हमारे अनुभव से पता चला है कि लक्षण वर्णन के लिए कई तकनीकों का उपयोग करने से पीसीएम गुणों के बारे में प्राप्त की जा सकने वाली जानकारी बढ़ जाती है और अकेले प्रत्येक से प्राप्त डेटा सेट की व्याख्या को सरल बनाया जाता है। उदाहरण के लिए, SAXS और TEM मुख्य रूप से एक पीसीएम के घने कोर की जांच करते हैं, जबकि नैनोपार्टिकल के समग्र आयामों पर प्रकाश बिखरने की रिपोर्ट। इस प्रकार, उन्हें मिलाने से कोर और कोरोना आकार दोनों की माप की अनुमति होती है। वास्तविक अंतरिक्ष छवियों को प्राप्त करने की TEM की क्षमता SAXS डेटा मॉडलिंग के लिए उपयुक्त रूप कारकों का चयन करने के लिए जमीनी सत्य डेटा प्रदान कर सकती है जो अन्यथा अस्पष्ट हो सकती है। यह लेख सभी चार तकनीकों के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, और एक अज्ञात नमूने की विशेषता के लिए उनका उपयोग करने के लिए एक उदाहरण प्रक्रिया चर्चा अनुभाग में दी गई है।

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Protocol

1. सामग्री की तैयारी

  1. lyophilized डाइब्लॉक बहुलक बाहर वजन और लगभग 10 मिलीग्राम/mL अंतिम एकाग्रता के एक शेयर समाधान के लिए आवश्यक मात्रा तक पानी जोड़ें । 2 मिन के लिए अधिकतम गति पर भंवर।
  2. 5 मिन के लिए सोनीकेट बहुत लंबे डिब्लॉक ्स को अतिरिक्त सोनिकेशन की आवश्यकता हो सकती है। स्टॉक समाधान पूरी तरह से पारदर्शी और सजातीय दिखाई देना चाहिए।
  3. जरूरत के अनुसार नाओएच या एचसीएल का उपयोग करके पीएच को 7.4 में समायोजित करें। अंतिम मात्रा में पानी जोड़ें। PLys-खूंटी समाधान काफी स्थिर हैं, लेकिन लंबी अवधि के भंडारण के लिए प्रशीतित किया जाना चाहिए और पीएच उपयोग से पहले जांच की जानी चाहिए । लिओफिलाइजेशन ठंड के लिए बेहतर है।
  4. वांछित स्टॉक एकाग्रता पर लिओफिलेइज्ड ओलिगोन्यूक्लियोटाइड (एस) को फिर से निलंबित करें, आमतौर पर 50 एनटी या उससे नीचे की लंबाई के लिए 2-5 मीटर आणविक एकाग्रता। पूरी तरह से विघटन सुनिश्चित करने के लिए भंवर अच्छी तरह से।
  5. परिचय में वर्णित आणविक वजन या लंबाई का उपयोग करके मोलर सांद्रता की गणना करें।
  6. मोलर चार्ज सांद्रता (सी.सी.) की गणना करें, जहां

Equation 1

पॉलीइलेक्ट्रोलाइट चार्ज चार्ज मोनोमर की संख्या है, जबकि न्यूक्लिक एसिड चार्ज कोई फॉस्फोरिलेशन नहीं मानते हुए, शून्य से 1 कुर्सियां की संख्या है। ध्यान रखें कि डबल फंसे डीएनए में एकल फंसे डीएनए की तुलना में प्रति अणु दो बार कई शुल्क होंगे ।

  1. प्रत्येक बहुलक के लिए 20 एमएम सी पर पतला स्टॉक बनाएं।

2. न्यूक्लिक एसिड पॉलीइलेक्ट्रोलाइट मिसेल तैयारी

  1. 1.5 मिलीआर माइक्रोसेन्ट्राइज ट्यूब में, निम्नलिखित को 280 माइक्रोन की कुल मात्रा में मिलाएं:
    1. न्यूकैप्ड-मुक्त पानी का 200 माइक्रोन (नभिक एसिड युक्त पीसीएमएस के लिए अल्ट्राप्योर पानी)।
    2. 10x फॉस्फेट-बफर्ड लवइन (पीबीएस, 137 एमएम सोडियम क्लोराइड, 10 एमएम फॉस्फेट, पीएच 7.4 जब 1x पतला होता है) या अन्य उपयुक्त बफर37का 40 माइक्रोन।
    3. 20 एमएम सी ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के 40 माइक्रोन। डबल फंसे ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए, 20 एमएम सी पर प्रत्येक कतरा के 20 μL जोड़ें
  2. 5 मिन के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड समाधान 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यदि ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए गणना का पिघलने का तापमान अधिक है, तो तापमान तदनुसार बढ़ाया जाना चाहिए। ध्यान दें कि आरएनए ऊंचा तापमान पर नीचा होगा, इसलिए यह कदम अधिक समय तक नहीं होना चाहिए यदि यह या अन्य संवेदनशील घटक मौजूद हैं।
  3. 15 min के लिए शांत करें। 20 एमएम सी डिब्लॉक के 40 माइक्रोन जोड़ें, फिर अधिकतम गति से 20 एस के लिए तुरंत भंवर करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 न्यूनतम इनक्यूबेट।
  4. नमक एनील करें।
    1. 1 एम नैल की अंतिम एकाग्रता और 400 माइक्रोन की अंतिम मात्रा के लिए 5 एम सोडियम क्लोराइड के 80 माइक्रोन जोड़ें। अधिकतम गति से 10 एस के लिए भंवर।
    2. कमरे के तापमान पर 10 ग्राम के लिए इनक्यूबेट, तो डायलिसिस कारतूस में लोड। ध्यान दें कि सूचीबद्ध आणविक वजन कटऑफ गोलाकार प्रोटीन के लिए निर्धारित किए जाते हैं और रैखिक बहुलक के लिए सटीक नहीं होंगे। हम पाते हैं कि एक 2k MWCO कारतूस नमूना नुकसान से बचा जाता है और आयनिक ताकत में क्रमिक परिवर्तन के लिए भी प्रदान करता है।
    3. डायलिसिस स्नान तैयार करें।
      1. डायलिसिस स्नान की मात्रा की गणना करें:
        Equation 2
      2. 1x पीबीएस और 0.5 M NaCl के अंतिम समाधान के लिए 10x पीबीएस (या अन्य वांछित बफर), 5 एम NaCl, और अल्ट्राप्ली पानी मिलाएं, साथ ही 1x पीबीएस के दो समाधान।
    4. लोड डायलिसिस कारतूस।
      1. स्थायी मार्कर के साथ लेबल कारतूस। झिल्ली को हाइड्रेट करने के लिए कम से कम 2 मिन के लिए बफर में कारतूस भिगोएं।
      2. पलटवार घुमा कर टोपी निकालें। जेल लोडिंग पिपेट टिप का उपयोग करके नमूना लोड करें। धीरे-धीरे झिल्ली निचोड़कर अतिरिक्त हवा निकालें। कैप बदलें।
      3. 1x पीबीएस, 0.5 मीटर सोडियम क्लोराइड डायलिसिस बाथ में कारतूस रखो। कारतूस तैरना चाहिए, दोनों झिल्ली स्नान के संपर्क में के साथ । जरूरत पड़ने पर फोम फ्लोट्स का इस्तेमाल किया जा सकता है।
    5. डायलिसिस
      1. 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट एक चुंबकीय हलचल बार के साथ धीरे-धीरे सरगर्मी।
      2. कारतूस को 1x पीबीएस या अन्य वांछित काम करने वाले बफर के नए स्नान में ले जाएं। 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट, एक चुंबकीय हलचल बार के साथ धीरे-धीरे सरगर्मी। इस कदम को दोहराएं।
    6. सैंपल ठीक कर दो।
      1. स्नान से कारतूस निकालें। कैप निकालें और एक जेल लोडिंग पिपेट टिप का उपयोग कर नमूना ठीक करें। ध्यान दें कि बरामद मात्रा झिल्ली सूजन के कारण प्रारंभिक 400 माइक्रोन से अधिक हो सकती है। यदि मामूली कमजोर पड़ने की चिंता है तो रिकॉर्ड बरामद मात्रा ।
      2. नमूने को एक साफ 1.5 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में रखें। इस तरह से तैयार पीसीएमएस कई महीनों के लिए स्थिर होना चाहिए जब प्रशीतित, बशर्ते कि nuclease संदूषण से बचा गया है ।

3. डायनेमिक लाइट बिखरने

  1. धूल मुक्त स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए, बफ़र्स को ध्यान से फ़िल्टर किया जाना चाहिए (0.22 माइक्रोन सिरिंज या वैक्यूम फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर 3x) और कांच के बर्तन ों के बीच अच्छी तरह से साफ किए गए। यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि माप का संचालन करने से पहले नमूना थर्मल संतुलन तक पहुंच गया है।
  2. वांछित काम बफर के साथ 0.2 एमएम सी (10x यदि ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर) के लिए पीसीएम नमूना पतला करें और एक उपयुक्त क्यूवेट में लोड करें। हम एक छोटे वॉल्यूम क्यूवेट का उपयोग करते हैं, जिसके लिए कमजोर पड़ने के बाद ~ 200 माइक्रोन सैंपल की आवश्यकता होती है।
  3. 90 डिग्री के लिए डीएलएस डिटेक्टर स्थिति सेट करें।
  4. लेजर पावर और/या क्षीणक को समायोजित करें ताकि यदि संभव हो तो गिनती दर 100,000-200,000 प्रति सेकंड (सीपीएस) मायने रखती है । 10 केपीएस के रूप में कम के रूप में गिनती दरों का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन माप समय के लिए अच्छे आंकड़े प्राप्त करने की आवश्यकता हो सकती है (कदम ४.१) । उच्च गिनती दरों से बचा जाना चाहिए, के रूप में कई बिखरने माप चकित हो जाएगा ।
  5. 1 मिन के लिए डेटा प्राप्त करें। गिनती दर पूरे अधिग्रहण समय में स्थिर होना चाहिए; यदि नहीं, तो यह इंगित करता है कि नमूना या साधन के कुछ घटक अभी तक समान नहीं है ।
  6. ऑटोसेंक डेटा की जांच करें। लंबे समय तक बेसलाइन बहुत सपाट होनी चाहिए, और ऑटोसहसंबंध वक्र चिकनी होना चाहिए, न्यूनतम बिखराव के साथ, जैसा कि चित्रा 3एमें दिखाया गया है। बेसलाइन बहाव संतुलन की कमी को इंगित करता है, और अधिक डेटा प्राप्त करके डेटा में शोर में सुधार किया जा सकता है।
  7. फिट ऑटोसहसंबंध समारोह।
    1. विश्राम समय और एक प्रसार गुणांक, डीका वितरण देने के लिए नियमित विलोम लाप्लेस परिवर्तन करने के लिए REPES38,39 का उपयोग करें। इस विधि तो हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या, आरएचकी गणना करता है, स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण का उपयोग कर:
      Equation 3
      चित्रा 1बी आरएच और चित्रा 3बी का प्रतिनिधित्व दिखाता है REPES का परिणाम दिखाता है ।
    2. वैकल्पिक रूप से, CONTIN40,41 (एक वैकल्पिक नियमितीकरण एल्गोरिदम), या गैर-नकारात्मक कम-वर्ग फिटिंग (NNLS) सहित अन्य तरीकों का उपयोग करें। कई फिटिंग विधियों से लगातार परिणाम उच्च गुणवत्ता वाले डेटा के हस्ताक्षर हैं। ध्यान दें कि संचयी विश्लेषण (कई उपकरणों पर मानक) बहुआयामी आकार/लंबाई वितरण के लिए गैर भौतिक मूल्य देता है ।

4. मल्टी एंगल लाइट बिखरने

नोट: प्रकाश बिखरने तीव्रता बनाम कोण उपकरणों की एक किस्म पर मापा जा सकता है । हमने बैच मोड में चलने वाले गोनियोमीटर आधारित उपकरणों और मल्टीपल-डिटेक्टर उपकरणों दोनों का उपयोग करके अच्छे परिणाम प्राप्त किए हैं।

  1. किसी भी डिटेक्टर को संतृप्त किए बिना सभी कोणों पर बफर-केवल नमूना बनाम पर्याप्त संकेत/शोर प्रदान करने के लिए पीसीएम एकाग्रता और रोशनी तीव्रता को समायोजित करें। बाद में विभिन्न कमजोर पड़ने वाले कारकों पर नमूने तैयार करके और तीव्रता बनाम एकाग्रता (पीसीएम के बीच न्यूनतम बातचीत को संभालने) की लाइनारिटी की जांच करके परीक्षण किया जा सकता है।
  2. 1 मिन प्रति कोण के लिए 15 डिग्री से 135 डिग्री तक प्रकाश बिखरने की दर रिकॉर्ड करें। यदि नमूना और साधन को ठीक से समान कर दिया जाता है, तो माप समय के साथ बिखरने की दर स्थिर होगी।
  3. सामान्यीकृत बिखरने की दर को प्लॉट करें, मैंपाप करता हूं () बनाम क्यू,जहां मैं बिखरने की दर है। क्यू बिखरने वाले वेक्टर (फोटॉन मोमेंटम ट्रांसफर) के रूप में परिभाषित है

Equation 4

जहां = सॉल्वेंट अपवर्तक सूचकांक, माप कोण = और प्रकाश स्रोत की तरंगदैर्ध्य = = चित्रा 4 माल्स बिखरने की तीव्रता का एक भूखंड दिखाता है।

5. छोटे कोण एक्स-रे बिखरने

  1. डेटा अधिग्रहण
    1. पृष्ठभूमि के ऊपर पर्याप्त बिखरने के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड पीसीएम के लिए 2 एमएम चार्ज एकाग्रता के ऊपर वर्णित पीसीएम नमूने तैयार करें। पीसीएमएस के लिए भारी परमाणुओं (जैसे, न्यूक्लिक एसिड में फास्फोरस) की कमी के लिए, उच्च सांद्रता की आवश्यकता हो सकती है। स्सी42जैसे कैलकुलेटर का उपयोग करके लंबाई घनत्व बिखरने का अनुमान लगाया जा सकता है।
    2. मुक्त कणों की सफाई करके विकिरण क्षति को कम करने के लिए, एक केंद्रित (जैसे, 50%) से ग्लाइसेरोल जोड़ें स्टॉक सॉल्यूशन ताकि मिसेल सॉल्यूशन में 1% (v/v) ग्लाइसेरोल हो। ध्यान दें कि साफ ग्लाइसेरोल अत्यधिक चिपचिपा है और सही मापने के लिए मुश्किल है। पानी या बफर के साथ पतला करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।
    3. पृष्ठभूमि मॉनिटर के रूप में उपयोग के लिए 1% ग्लाइसेरोल के साथ काम करने वाले बफर की एक बड़ी मात्रा तैयार करें।
    4. बीमलाइन विशिष्ट प्रवाह सेल उपकरण और कैलिब्रेट डिटेक्टर तैयार करें। प्रोटोकॉल एक छोटे व्यास के साथ एक कंप्यूटर नियंत्रित सिरिंज पंप से जुड़े एक 3 मिमी व्यास क्वार्ट्ज केशिका का उपयोग करता है, और न्यूनतम लंबाई पॉलीथीन ट्यूबिंग । इस सेटअप के साथ प्रति नमूना ~ 140 माइक्रोन की न्यूनतम मात्रा की आवश्यकता है।
    5. नमूना एक्सपोजर मापदंडों का निर्धारण करें। इष्टतम जोखिम बीम तीव्रता, डिटेक्टर संवेदनशीलता, और एकाग्रता, बिखरने की ताकत, और नमूने की संवेदनशीलता को नुकसान के आधार पर भिन्न होगा, लेकिन लक्ष्य ब्याज की क्यू रेंज पर पर्याप्त बिखरने तीव्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक न्यूनतम प्रवाह के लिए नमूना का पर्दाफाश करना है।
    6. ओलिगोन्यूक्लियोटाइड/pLys-PEG PCMs के लिए, एक 1 हर्ट्ज पुनरावृत्ति दर पर 30x ०.२ एस जोखिम थोड़ा प्रत्यक्ष क्षति के साथ अच्छी डेटा गुणवत्ता का उत्पादन । नए नमूनों के लिए, निम्नलिखित प्रक्रिया सहायक हो सकती है:
      1. सांद्रता की एक श्रृंखला पर पीसीएम नमूने तैयार करें (उदाहरण के लिए, 10-10,000 μM c.c.) ।
      2. एक मध्यवर्ती एकाग्रता, वैकल्पिक पीसीएम और बफर-केवल नमूने अलग-अलग एक्सपोजर समय के साथ शुरू करना। डेटा अधिग्रहण और कमी प्रक्रिया के लिए नीचे देखें । नमूना संकेत अच्छे आंकड़े (छोटे सांख्यिकीय त्रुटि, या क्यूभर में चिकनी भिन्नता) होना चाहिए । अगर आंकड़े खराब हैं तो एक्सपोजर टाइम बढ़ सकता है।
      3. नमूना संकेत भी ब्याज की क्यू रेंज पर पृष्ठभूमि से स्पष्ट रूप से अलग होना चाहिए। सिग्नल/बैकग्राउंड रेशियो निर्धारित करने के लिए (सिग्नल-बैकग्राउंड)/बैकग्राउंड रेशियो बनाम क्यू की गणना करें और प्लॉट करें । यदि सिग्नल/पृष्ठभूमि अनुपात कम है, तो नमूना एकाग्रता बढ़ाई जानी चाहिए।
      4. सत्यापित करें कि बिखरने की तीव्रता (एकाग्रता के लिए सामान्यीकृत) उच्च और कम सांद्रता पर डेटा प्राप्त करके नमूना एकाग्रता से स्वतंत्र है, यदि आवश्यक हो तो एक्सपोजर समय स्केलिंग। इंटरपार्टिकल इंटरैक्शन (एकाग्रता निर्भरता का सबसे संभावित कारण) कम क्यू रेंज में सबसे स्पष्ट होगा।
    7. पीसीएम नमूनों और पृष्ठभूमि के लिए डेटा प्राप्त (यानी, ग्लाइसेरोल के साथ बफर)।
      1. केशिका के माध्यम से नमूना स्थानांतरित करने के लिए सिरिंज पंप ट्रिगर। या तो द्विदिशात्मक या एक बार के माध्यम से गति स्वीकार्य है, लेकिन देखभाल के लिए प्रत्येक नमूने को अलग करने के लिए लिया जाना चाहिए (जैसे, नमूनों के बीच एक हवा बुलबुला डालने से) । नमूने बरामद किया जा सकता है और अगर कोई विकिरण क्षति देखा जाता है फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      2. एक बार प्रवाह शुरू हो जाने के बाद, ऊपर वर्णित एक्स-रे एक्सपोजर और डेटा अधिग्रहण कार्यक्रम को ट्रिगर करें। ध्यान रखा जाना चाहिए कि तरल पदार्थ प्रवाह से पहले बीम एक्सपोजर समाप्त होता है।
    8. प्रत्येक नमूने के बाद, एक साथ 1डी प्रोफाइल (यानी, तीव्रता बनाम क्यू)को औसत करके प्रदर्शन करें और साजिश करें। वे सांख्यिकीय त्रुटि के भीतर समान होना चाहिए । समय के साथ सिग्नल बदलने से विकिरण क्षति का संकेत मिल सकता है।
      1. अलग-थलग असंगत प्रोफाइल माइक्रोबबल्स की उपस्थिति का संकेत दे सकते हैं। यदि बुलबुले अक्सर देखे जाते हैं, तो प्रवाह दर को कम करने में मदद मिल सकती है।
    9. औसत 1D बिखरने प्रोफाइल।
    10. बफर-केवल नमूनों के लिए डेटा प्राप्त अक्सर (हर 4-5 पीसीएम नमूनों के प्रति एक बार) और समय के साथ इनकी तुलना करें। बफर-केवल नमूनों से बढ़ा हुआ संकेत इंगित करता है कि केशिका विकिरण से क्षतिग्रस्त नमूने से दूषित हो सकता है।
      1. जब संदूषण देखा जाता है, तो ब्लीच के साथ केशिका धोएं, और यदि संभव हो तो एक्सपोजर समय को कम करने पर विचार करें।
  2. इरेना का उपयोग करके डेटा में कमी और विश्लेषण
    1. मिसेल और बैकग्राउंड एएससीआईआई डेटा सेट(एसएएस/डेटा इम्पोर्ट एंड एक्सपोर्ट/इम्पोर्ट एएसएएस डेटा)आयात करें ।
    2. नमूना डेटा से पृष्ठभूमि बिखरने घटाना। आमतौर पर, उच्चतम क्यू मान (जैसे क्यू एंड जीटी; 0.5) संकेत पर हावी सॉल्वेंट से असंगत बिखरने को दिखाते हैं। इस क्यू रेंज पर नमूना डेटा से मेल खाने के लिए पृष्ठभूमि डेटा स्केलिंग बीम तीव्रता भिन्नता और नमूना एकाग्रता के कारण किसी भी भिन्नता को हटा देता है।
      1. लॉग-लॉग स्केल पर नमूना और पृष्ठभूमि को एक साथ प्लॉट करें। उच्च क्यू (SAS/डेटा हेरफेर/डेटा हेरफेर I)पर सपाट तीव्रता सत्यापित करें । नमूना/पृष्ठभूमि अनुपात(Data1/Data 2),रैखिक-लॉग स्केल पर प्लॉट की गणना करें, और उच्चक्यू asymptote सत्यापित करें ।
      2. इस क्यू रेंज पर औसत (नमूना/पृष्ठभूमि) अनुपात की गणना करें (डेटा ब्राउज़र से स्प्रेडशीट में कस्टम मैक्रो या कॉपी/पेस्ट का उपयोग करें) ।
      3. डेटा हेरफेर मैक्रो का उपयोग करना, ऊपर गणना किए गए अनुपात का उपयोग करके पृष्ठभूमि (उदाहरण के लिए, संशोधित डेटा 2)को स्केल करें और पृष्ठभूमि बनाम पृष्ठभूमि के लिए पृष्ठभूमि-घटाए गए संकेत के अनुपात को प्लॉट करें बनाम क्यू ([Data1-Data2]/Data2),यह सत्यापित करता है कि यह अब उच्च क्यूपर शून्य तक पहुंच गया है। इस अनुपात को रिकॉर्ड करें; यह प्रत्येक नमूने के लिए 1.0 से 1-2% दूर होना चाहिए।
      4. बैकग्राउंड-घटाया संकेत(Data1-Data2)बनाम क्यू प्लॉट करें और डेटा को एक नए नाम के साथ सहेजें। मूल डेटा को ओवरराइट न करें।
      5. यदिउच्च-क्यू डेटा उपलब्ध नहीं है, तो पृष्ठभूमि घटाव के लिए 1 के स्केलिंग कारक का उपयोग करें, लेकिन ध्यान रखें कि अशुद्धियों को क्यू पर्वतमाला में पेश किया जा सकता है जहां सिग्नल/पृष्ठभूमि अनुपात छोटा है ।
    3. मॉडलिंग मैक्रो खोलें,(SAS/मॉडलिंग),तो लोड और पृष्ठभूमि घटाया डेटा(डेटा cntrls/डेटा जोड़ें)लोड और साजिश । इस मैक्रो में स्केल न करें।
    4. सबसे पहले, पीसीएम की बाहरी सतह के लिए एक अनुमानित मॉडल खोजें (मिसेल आकार/आकार):
      1. डेटा सीएनटीआरएलमें, कम से मध्यम क्यू रेंज (जैसे, ~ 0.003Å-1 < q < ~ 0.1Å-1)का चयन करें। यदि दोलन दिखाई दे रहे हैं, तो उन्हें शामिल करें।
      2. डेटा के लिए उपयुक्त फॉर्म फैक्टर चुनें। कम क्यू पर ढलान नैनोपार्टिकल शेप का संकेत है, जिसे टीएम और/या माल्स के माध्यम से भी सत्यापित किया जा सकता है । Schulz-Zimm स्फेरॉइड(क्यू0),सिलेंडर(क्यू-1),या लचीला सिलेंडर(क्यू-2)मॉडल का उपयोग करें। Irena फिटिंग बिजली कानूनों के लिए उपकरण प्रदान करता है(SAS/भूखंडों और तालिकाओं के लिए समर्थन उपकरण)।
      3. मॉडल सीएनटीएलएसमें, पहले बिखरने वाली आबादी(1P)का चयन करें और सुनिश्चित करें कि यह उपयोग में केवल एक है (उपयोग का चयन करें? चेकबॉक्स)।
      4. मॉडल के लिए आकार जिला का चयन करें और वांछित वितरण प्रकार और फॉर्म फैक्टरचुनें। स्केल, मीन साइजऔर चौड़ाई फ़ील्ड में मूल्यों को दर्ज करके खोज के लिए प्रारंभिक पैरामीटर सेट करें और परिणामी फॉर्म फैक्टर को आकर्षित करने के लिए गणना मॉडल पर क्लिक करें।
        नोट: फ्लेक्सिबल सिलेंडर फॉर्म फैक्टर को यूजर फॉर्म फैक्टर के रूप में जोड़ा जा सकता है और https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irenaसे डाउनलोड किया जा सकता है । पैरामीटर 1 और 2 क्रमशः सिलेंडर और कुह्न लंबाई की लंबाई के अनुरूप हैं।
      5. एक बार उचित पैरामीटर पाए जाने के बाद, डेटा के लिए कम से कम वर्ग ों को करने के लिए फिट मॉडल पर क्लिक करें। आकार वितरण मॉडल मतलब त्रिज्या और चौड़ाई देता है।
        पॉलीडिस्टिविटी (पीडीआई) उपयोग की गणना करने के लिए
        Equation 5
        किसी भी nonlinear फिटिंग प्रक्रिया के साथ के रूप में, यह डेटा रेंज(क्यू क्षेत्र) समायोजित करने के लिए और मापदंडों को शुरू करने के लिए एक स्थिर, शारीरिक रूप से उचित फिट प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
      6. एक बार एक उचित फिट प्राप्त किया जाताहै, इसे बचाने के लिए(नोटबुक में स्टोर/
    5. इसके बाद, पीसीएम कोर के भीतर व्यक्तिगत बहुलक के बिखरने को मॉडल करें। यह एक शक्ति कानून मॉडल (जैसे, आदर्श श्रृंखला के लिएक्यू-2, सूजन जंजीरों के लिएक्यू-5/3, आदि) द्वारा कब्जा किया जा सकता है। Irena एक Beaucage मॉडल43के माध्यम से इस लागू:
      Equation 6
      जहां पी शक्ति कानून है और जी और बी अग्रदूत हैं ।
      1. पूरी क्यू रेंज को कवर करने के लिए डेटा नियंत्रण को समायोजित करें और मॉडल को फिर से प्लॉट करें(मॉडल की गणनाकरें)। आमतौर पर, मध्यम से उच्च क्यू रेंज (जैसे, क्यू एंड जीटी;~ 0.1Å-1)में अतिरिक्त बिखराव देखा जाएगा।
      2. क्यू रेंज का चयन करने के लिए डेटा नियंत्रण का उपयोग करें जहां अतिरिक्त बिखरने (>10x फॉर्म फैक्टर मॉडल) मनाया जाता है।
      3. एक दूसरी बिखरती आबादी(2P)जोड़ें और सुनिश्चित करें कि यह उपयोग में केवल एक ही है (1Pके लिए अselectसिल उपयोग? )
      4. मॉडल के लिए एकीकृत स्तर का चयन करें। बी और पी प्रासंगिक पैरामीटर हैं। इन मापदंडों के लिए प्रारंभिक अनुमान प्राप्त करने के लिए सीएसआर मैक्रो के बीच प्लॉटिंग समर्थन उपकरण या फिट पी/बी का उपयोग करें, और यह सुनिश्चित करने के लिए कि मॉडल कम क्यूपर अत्यधिक बिखरने की भविष्यवाणी नहीं करता है, गिनीयर कारकों जी और आरजी को समायोजित करें।
      5. फॉर्म फैक्टर के लिए, एक nonlinear फिट प्रदर्शन करें और मापदंडों और मॉडल को रिकॉर्ड करें।
    6. इसके बाद, यदि एक विवर्तन चोटी मौजूद है, जैसा कि चित्र4 में है,तो इस मामले में क्यू रेंज में एक विवर्तन चोटी के लिए एक तीसरा मॉडल जोड़ें(q = ~ 0.22 Å-1)।
    7. एक बार व्यक्तिगत बिखरने वाली आबादी के लिए अनुमानित फिट मूल्य प्राप्त हो जाने के बाद, तीनों को एक साथ चालू करें (प्रत्येक के लिए उपयोग का चयन करें) और संयुक्त फिट का अनुकूलन करें।
    8. जांच लें कि प्रत्येक मूल्य शारीरिक रूप से उचित रहता है। इस प्रक्रिया का परिणाम एक समग्र मॉडल होना चाहिए जो SAXS डेटा को आकार तराजू की एक बड़ी श्रृंखला पर अच्छी तरह से वर्णित करता है, जैसा कि चित्र4में सचित्र है। इगोर के भीतर स्टोर करने के लिए फोल्डर बटन में स्टोर का उपयोग करके फिट सहेजें।

6. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM)

  1. क्रायो टेम
    1. ग्रिड का चयन करें। हम एक विकल्प के रूप में एक मानक TEM ग्रिड या लेसी कार्बन पर होले कार्बन समर्थन फिल्म की सलाह देते हैं। या तो मामले में, कार्बन के बीच छेद शुद्ध vitreous बर्फ और नमूना और कोई फिल्म के एक इमेजिंग क्षेत्र प्रदान करेगा ।
    2. ग्रिड कार्बन साइड को एक साफ ग्लास स्लाइड पर चमक निर्वहन उपकरण में रखें। स्लाइड को प्रयोगशाला फिल्म में लपेटकर ग्रिड हैंडलिंग में मदद मिल सकती है। चिमटी के साथ ग्रिड के केंद्र को छूने से बचें और हमेशा ग्रिड के किनारे के पास चुटकी।
    3. 30 एस के लिए ग्रिड का पर्दाफाश करें।
    4. नमूना जमाव के लिए एक विट्रीफिकेशन रोबोट तैयार करें।
      1. 100% आर्द्रता और आरटी के लिए सेट करें और ब्लॉटिंग पेपर जोड़ें। रोबोट के आधार पर तरल एथेन और तरल नाइट्रोजन स्नान तैयार करें। विट्रीफिकेशन रोबोट तैयार करने और उपयोग के साथ अतिरिक्त मदद के लिए ऑनलाइन ट्यूटोरियल और वीडियो देखें।
    5. पतला नमूना 5x।
    6. विट्रीफिकेशन रोबोट के साथ प्रदान किए गए नकारात्मक एक्शन चिमटी का उपयोग करना, एक ग्रिड उठाएं, फिर रोबोट को चिमटी संलग्न करें और चिमटी को कक्ष में ले जाएं।
    7. जबकि रोबोट में, मशीन के किनारे में छेद के माध्यम से एक पिपेट का उपयोग कर ग्रिड के कार्बन पक्ष में नमूने के 4 μL जोड़ें ।
    8. 4 मिन के लिए इनक्यूबेट।
    9. रोबोट का उपयोग करके, फिल्टर पेपर के साथ 3-5 एस दाग।
    10. विट्रीफिकेशन रोबोट ग्रिड को तरल इथेन में डुबकी देगा।
    11. चिमटी निकालें और ग्रिड को तरल नाइट्रोजन और एक भंडारण कंटेनर में ले जाएं, जो तरल नाइट्रोजन के तहत भी होना चाहिए। यह प्रक्रिया नमूने को विट्रियस बर्फ की पतली परत में ठीक करती है। इस चरण के दौरान ग्रिड तरल इथेन या तरल नाइट्रोजन से खर्च होने वाले समय को कम करें।
    12. तरल नाइट्रोजन का उपयोग करक्रायो नमूना धारक को ठंडा करें। एक देवर और जलाशय को भरा रखें।
    13. जब छवि के लिए तैयार है, क्रायो नमूना धारक पर ग्रिड लोड । तरल नाइट्रोजन के नीचे या संक्षेप में तरल सतह के ठीक ऊपर बेहद ठंडनाइट्रोजन भाप में नमूना रखें।
    14. पतली और मोटी बर्फ में 75kx और 150kx के बीच 120 केवी पर ग्रिड छवि, क्योंकि विभिन्न आकार के मिसेल एक निश्चित बर्फ मोटाई पसंद कर सकते हैं।
      1. बर्फ पिघलने और नमूने को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए बीम एक्सपोजर को सीमित करें। जहां छवि की योजना बना रहे हैं, सीधे ध्यान केंद्रित न करें; आसपास ध्यान केंद्रित करें। केवल एक छवि पर कब्जा करते समय ब्याज के क्षेत्र का पर्दाफाश करें।
      2. छवियों को देखने के दौरान नमूने से तरल एथेन बूंदों में अंतर करना सुनिश्चित करें (चित्र 5देखें)।
  2. पारंपरिक TEM नकारात्मक धुंधला का उपयोग कर
    1. दाग तैयार करें।
      1. अल्ट्राप्योर पानी के ~ 10 मीटर उबालें। 0.1 ग्राम यूरिनल फोर्ट (यूएफओ) का वजन 15 मीटर शंकुई ट्यूब में करें।
      2. 2% समाधान के लिए यूएफओ पाउडर में गर्म पानी का 5 mL जोड़ें। कसकर बंद करें और प्रकाश को ब्लॉक करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें। एक 1% मूत्र एसीटेट दाग भी आमतौर पर प्रयोग किया जाता है।
      3. भंवर या 5 मिन के लिए जोरदार हिलाएं। भंवर में ट्यूब को जकड़ने से मदद मिलेगी। 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से एक साफ शंकुई ट्यूब में फ़िल्टर करें।
      4. टी को 10 मिन ठंडा कर दें। 2 मिन के लिए तुरंत 5M NaOH और भंवर के 25 μL जोड़ें ।
        1. वैकल्पिक रूप से, 2% यूएफओ के 200 माइक्रोन एलिकोस को फ्रीज करें। उपयोग के लिए तैयार होने पर, एक एलिकोट गल, 2 मिन के लिए 5 एम नाओएच और भंवर के 1 माइक्रोन जोड़ें।
      5. दाग को पन्नी में लपेटकर रखें या प्रकाश से दूर रहें।
    2. 1x पीबीएस (या वांछित बफर) में पतला नमूना 10x।
    3. ग्रिड का चयन करें। हम कॉपर ग्रिड पर कार्बन सपोर्ट फिल्म की सलाह देते हैं। ग्रिड का गहरा, शाइनियर साइड कार्बन-लेपित पक्ष है जहां नमूना जमा और दाग दिया जाएगा।
    4. ग्रिड कार्बन साइड को एक साफ ग्लास स्लाइड पर चमक निर्वहन उपकरण में रखें। 6.1.2 चरण देखें।
    5. 30 एस के लिए ग्रिड का पर्दाफाश करें।
    6. कार्बन पक्ष के साथ ग्रिड उठाओ अभी भी सामना करना पड़ रहा है और ग्रिड के किनारे से नकारात्मक कार्रवाई चिमटी के साथ पकड़ के लिए केंद्र में इमेजिंग क्षेत्र फाड़ को रोकने के । ग्रिड के साथ चिमटी नीचे सेट अभी भी कार्बन की ओर आयोजित किया ।
    7. एक पिपेट के साथ ग्रिड के शीर्ष (कार्बन साइड) पर नमूना की 4 μL बूंद लागू करें।
    8. इनक्यूबेट 4 मिन।
    9. ~ 1 मिन छोड़ दिया के साथ, एक 10 μL और स्वच्छ प्रयोगशाला फिल्म का एक टुकड़ा पर यूएफओ समाधान के एक 20 μL ड्रॉप पिपेट ।
    10. इमेजिंग सतह के साथ किसी भी संपर्क से बचने के लिए ग्रिड (लंबवत संपर्क) के किनारे से नमूना बाती करने के लिए फिल्टर पेपर का उपयोग करें।
    11. चिमटी का उपयोग करना (अभी भी ग्रिड पकड़े हुए), तुरंत ग्रिड के नमूने पक्ष को 10 μL यूएफओ बूंद पर नीचे रखें, फिर तुरंत तरल (धोने के कदम) से बाती करें। यह महत्वपूर्ण है कि ग्रिड को सूखने न दें, इसलिए चरणों के बीच में न रुकें।
    12. इसी तरह, ग्रिड पर 20 माइक्रोन यूएफओ ड्रॉपलेट लागू करें। 40 एस बाती तरल बंद करने के लिए यूएफओ पर ग्रिड पकड़ो और ग्रिड सूखी चलो।
    13. 20,000x और 100,000x के बीच 120 केवी पर शुष्क ग्रिड छवि।
    14. रेडियोधर्मी कचरे के लिए संस्था की सुरक्षा सेवा का उपयोग कर सभी ध्वनि दूषित सामग्रियों का उचित निपटान सुनिश्चित करें।
    15. जब आवश्यक हो, चमक/विपरीत वृद्धि और पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए ImageJ में TEM छवियों पर एक औसत फिल्टर लागू किया जा सकता है । पोस्ट प्रोसेसिंग समान रूप से की जानी चाहिए, केवल उन छवियों के लिए जिनका उपयोग तीव्रता जैसे मात्रात्मक मापन के लिए नहीं किया जाता है, और हमेशा रिपोर्ट की जानी चाहिए।

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Representative Results

ऊपर वर्णित लक्षण वर्णन विधियों को समझाने के लिए, हम ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स से इकट्ठे हुए पीसीएमएस के लिए विशिष्ट परिणाम दिखाते हैं और विभिन्न लंबाई और रसायनशास्त्र(चित्रा 1)के कोपॉलिमर को ब्लॉक करते हैं। चित्रा 2 का एक उदाहरण प्रदान करता है कि कैसे पीसीएम कोर आकार (जैसा कि SAXS और TEM, चित्रा 4 और चित्रा 5से निर्धारित) चार्ज ब्लॉक लंबाई के साथ विविध है। चित्रा 3 अपेक्षाकृत लंबे ब्लॉक कोपॉलिमर और छोटे एकल फंसे अल्पाधिकारी से गठित गोलाकार पीसीएमएस के लिए डीएलएस डेटा और फिटिंग परिणाम दिखाता है। चित्रा 4 दिखाता है कि कैसे जटिल SAXS तीव्रता स्पेक्ट्रा मौजूद थे कि कई स्थानिक सहसंबंधों के लिए मॉडल के संयोजन से सही फिट किया जा सकता है (बाहरी सतह, इंट्रा कोर बिखरने, अंतर हेलिक्स आदेश), और कैसे MALS लंबी लंबाई तराजू के लिए बिखरने माप का विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंत में, चित्रा 5 अलग आकृति विज्ञान के पीसीएम के लिए प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटा दिखाता है।

Figure 1
चित्रा 1: असेंबली और न्यूक्लिक एसिड पीसीएम का लक्षण वर्णन। (A)ओनिनिक पॉलिमर, जैसे ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स, डिब्लॉक कोपॉलिमर के सीनिक क्षेत्रों के साथ चरण-अलग परिसरों का गठन किया। हाइड्रोफिलिक न्यूट्रल ब्लॉक (ग्रे) की उपस्थिति के परिणामस्वरूप स्थिर पीसीएम नैनोकणों का गठन हुआ। (ख)पीसीएमएस कोर-शेल नैनोकण थे, जिनमें कई मापदंडों की विशेषता थी । समग्र आकार (हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या, आरएच)को डीएलएस का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है, कोर त्रिज्या (आरसी)SAXS और TEM का उपयोग करके पाया जा सकता है, कोरोना आकार की गणना आरएच-आरसीके रूप में की जा सकती है, और आकृति विज्ञान को SAXS, MALS और TEM के संयोजन से कई लंबाई तराजू पर निर्धारित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मिसेल आकार निर्भरता। मिसेल कोर आकार मुख्य रूप से ब्लॉक कोपॉलिमर के आवेशित ब्लॉक की लंबाई से निर्धारित किया गया था, और काफी हद तक होमोपॉलिमर7,26की लंबाई से स्वतंत्र था। यह ब्लॉक बहुलक के विकल्प से पीसीएम आकार के नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। यहां दिखाए गए आंकड़े ८८ एनटी/बीपी डीएनए के साथ pLys-खूंटी के लिए कर रहे है और पहले26की सूचना दी गई है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: गतिशील प्रकाश बिखरने। (A)10 एनटी सिंगल-फंसे डीएनए + pLys (100) -PEG (10k) पीसीएम के लिए ऑटोसहसंबंध फ़ंक्शन (मनमाने ढंग से इकाइयां) । (ख)ईपीईएस फिट से हाइड्रोडायनामिक रेडियस डिस्ट्रीब्यूशन (हिस्टोग्राम) । ऑटोसहसंबंध फ़ंक्शन एक ही समय पैमाने के साथ एक फ्लैट मूल्य तक सड़ गया, जिसके परिणामस्वरूप REPES आकार वितरण में एक आकार पीक हो गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि SAXS और MALS डेटा और एक बेलनाकार micelle के लिए फिट । SAXS डेटा (ग्रे हलकों) pLys (50) -खूंटी (5k) और ८८ बीपी डबल फंसे डीएनए से इकट्ठे PCMs के लिए दिखाया गया है । कम क्यू (<10-2 Å-1)पर, तीव्रता ने गति हस्तांतरण पर लगभगक्यू-2 निर्भरता दिखाई, जिसका अर्थ है एक लचीला सिलेंडर आकार (कीड़ा की तरह मिसेल)। MALS डेटा (खुले काले घेरे) एक ही निर्भरता दिखाते हैं, यह दर्शाता है कि मिसेल लंबाई में कम से कम कई माइक्रोमीटर थे (TEM इमेजिंग, चित्रा 5C,डीद्वारा पुष्ट) । स्फिरोइडल मिसेल इस रेंज में क्यू पर तीव्रता की एक फ्लैट निर्भरता (क्यू0)दिखाएंगे। रंगीन लाइनें धारा 5 में वर्णित पीसीएम SAXS डेटा के लिए बहुघटक फिटिंग प्रक्रिया को दर्शाती हैं। कम क्यू (बड़ी दूरी के तराजू) पर बिखरने पर पीसीएम की बाहरी सतह का प्रभुत्व था, और एक लचीला सिलेंडर मॉडल (लाल) द्वारा अच्छी तरह से फिट होता है। उच्च क्यू मूल्यों (छोटे लंबाई पैमाने पर), बिखरने पीसीएम कोर के अंदर व्यक्तिगत बहुलक का प्रभुत्व था, कम क्यू कटऑफ के साथ एक शक्ति कानून (हरे) द्वारा यहां फिट। हमने पीसीएम कोर के भीतर डबल-फंसे डीएनए हेलिक्स की समानांतर पैकिंग भी देखी, जिसके परिणामस्वरूप अर्ध-ब्रैग विवर्तन चोटी (नीला) होता है। काले धराशायी लाइन से पता चलता है कि इन मॉडलों के संयोजन सही SAXS डेटा वर्णित है, और प्रकाश बिखरने डेटा (खुले हलकों) के अलावा परिमाण के लगभग चार आदेशों पर आकार सीमा बढ़ाया । फिटिंग परिणामों ने मतलब त्रिज्या = 11.0 एनएम और पीडीआई = 0.03, उच्च क्यू = 1.81 पर बिजली कानून और विवर्तन चोटी के साथ एक पीसीएम आबादी दी 2.71 एनएम के अंतर-हेलिक्स अंतर का प्रतिनिधित्व करती है। SAXS डेटा पहले26 की सूचना दी गई है और सार्वजनिक रूप सेउपलब्ध हैं 44. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: न्यूक्लिक एसिड पीसीएमएस की TEM छवियां। (A-B) 22 एनटी सिंगल-फंसे डीएनए + pLys (50) -PEG (5k) PCMs के क्रायो TEM, मुख्य रूप से गोलाकार आकृति विज्ञान दिखा । नीले तीर तरल इथेन बूंदों का संकेत देते हैं, पीसीएमएस (बनावट वाले स्पेरोइडल ऑब्जेक्ट्स) के साथ भ्रमित नहीं होते हैं। (क)थोड़ा कम ध्यान केंद्रित है, जबकि संकल्प के संरक्षण मामूली विपरीत जोड़ने । (ख)काफी कम ध्यान केंद्रित है, और अधिक विपरीत जोड़ने लेकिन स्पष्टता त्याग । चमक और विपरीत समायोजन और दोनों छवियों पर दो पिक्सेल मीडियन फ़िल्टर लागू किए गए थे। (C-D) 88 बीपी डबल-फंसे डीएनए + pLys (50) -PEG (5k) PCMs, जो लंबे समय लचीला सिलेंडर है की नकारात्मक दाग TEM । दोनों ही मामलों में, टीएम से कोर मूली फिटिंग SAXS डेटा से प्राप्त मूल्यों के अनुरूप थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

जैसा कि ऊपर बताया गया है, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को पॉलीएनियन घटक और प्लाय-खूंटी के रूप में ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स पर ध्यान केंद्रित करने के साथ लिखा जाता है, जो कोपॉलिनियम-न्यूट्रल ब्लॉक कोपॉलिमर के रूप में है, लेकिन हमने उन्हें विभिन्न प्रकार के पॉलीमर (एक्रेलिक एसिड), पॉलीग्लूटामेट और खूंटी-पॉली (विनाइलबेंजाइल त्रिमेथिलम्मोनियमियम) के साथ परीक्षण किया है। एक पैरामीटर जिसे अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है वह नमक एकाग्रता है जिसका उपयोग एनियलिंग के लिए किया जाता है, क्योंकि यह काफी अधिक होना चाहिए कि एनियल की शुरुआत में पीसीएमएस नहीं बनते हैं। इसे डीएलएस द्वारा प्रयोगात्मक रूप से या अकेले पॉलीइलेक्ट्रोलाइट्स (कोई तटस्थ ब्लॉक) के साथ चरण अलगाव के अवलोकन की तुलना में जांचा जा सकता है। यदि नमक एनियलिंग अवांछनीय है, तो थर्मल एनीलिंग का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि परिणामस्वरूप पॉलीफैलाव7बड़े होते हैं। लक्षण वर्णन के लिए उपयोग की जाने वाली सांद्रता को भी अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि बड़े नैनोकण छोटे लोगों की तुलना में अधिक प्रकाश को तितर-बितर करते हैं, और न्यूक्लिक एसिड रीढ़ की हड्डी में इलेक्ट्रॉन-घने फास्फोरस परमाणुओं की उपस्थिति के कारण कई अन्य बहुलक ों की तुलना में एक्स-रे को बिखरने में अधिक कुशल होते हैं। यदि या तो पॉलीइलेक्ट्रोलाइट में काम करने की स्थिति के करीब एक पीके है तो बफर के पीएच को अधिक बारीकी से नियंत्रित करना भी आवश्यक हो सकता है।

इस लेख में हम दो प्रकाश बिखरने तकनीकों (यानी, बहु कोण/स्थिर प्रकाश बिखरने और गतिशील प्रकाश बिखरने), साथ ही छोटे कोण एक्स-रे बिखरने, और दोनों क्रायो और पारंपरिक नकारात्मक दाग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, प्रत्येक के लिए प्रतिनिधि डेटा के साथ के लिए प्रोटोकॉल पेश करते हैं । सभी परिदृश्यों के लिए सभी तकनीकें आवश्यक नहीं हैं, और अन्य भी उपलब्ध हैं, जिसका प्रश्न उठाना चाहिए कि कब नियोजित किया जाना चाहिए। पर्याप्त समीक्षा साहित्य इस विषय पर मौजूद है45,46,लेकिन हम निम्नलिखित सुझाव देते हैं जब एक नया पीसीएम या इसी तरह के नैनोपार्टिकल की विशेषता है। एकत्रीकरण के लिए जांच करके शुरू करें, दोनों टर्बिडिटी के लिए दृश्य निरीक्षण और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा । यदि कोई एकत्रीकरण नहीं देखा जाता है, तो अगला कदम यह निर्धारित करना है कि कोई नैनोकण मौजूद हैं या नहीं। डीएलएस इस का निर्धारण करने का एक त्वरित तरीका है क्योंकि पीसीएमएस तेजी से प्रकाश को तितर-बितर करते हैं, और कमजोर या अस्तित्वहीन प्रकाश बिखरने गरीब नैनोपार्टिकल गठन का एक मजबूत संकेतक है। जबकि डीएलएस नैनोकणों की उपस्थिति की पुष्टि कर सकते हैं, अन्य डेटा के संदर्भ के बिना उनके आकार और आकार का निर्धारण करना मुश्किल है, क्योंकि अधिकांश विश्लेषण विधियां स्टोक्स-आइंस्टीन संबंध पर भरोसा करती हैं, जो गोलाकार कणों को मान लेती है। MALS गोलाकार आकार (फ्लैट सामान्यीकृत तीव्रता बनाम कोण) की पुष्टि कर सकते हैं, लेकिन गैर-गोलाकार कणों के आकार को निर्धारित करने में सक्षम नहीं हो सकता है जब तक कि आकार वितरण दोनों संकीर्ण न हो और संकल्प के लिए सही सीमा में गिरना होता है। नतीजतन, हम अपने गुणों को पूरी तरह से चित्रित करने के लिए किसी भी पीसीएम नमूने पर टेम, सैक्स, या दोनों प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम शिकागो विश्वविद्यालय में क्रमशः सॉफ्ट मैटर लक्षण वर्णन सुविधा और उन्नत इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सुविधा के फिल ग्रिफिन और टेरा लावोई का शुक्रिया अदा करते हैं। हम समर्थन के लिए आर्गोन नेशनल लेबोरेटरी में उन्नत फोटॉन स्रोत और पदानुक्रमित सामग्री डिजाइन (CHiMaD) के लिए NIST केंद्र के जियाओबिंग ज़ुओ और सोएनके सीफर्ट को भी धन्यवाद देते हैं। हम इस काम में उनके योगदान के लिए जेफ टिंग और माइकल Lueckheide शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

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References

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