Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Montering og karakterisering av polyelektrolyttkompleks micelles

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60894
Automatic Translation
1, 1, 1
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

Summary

Vi tilbyr protokoller og representative data for utforming, montering og karakterisering av polyelektrolyte komplekse micelles, kjerneskall nanopartikler dannet av polyelektrolytter og hydrofile ladede blokkkopolymerer.

Abstract

Polyelektrolyte komplekse micelles (PCMer), kjerneskall nanopartikler dannet av selvmontering av ladede polymerer i vandig løsning, gir en kraftig plattform for å utforske fysikken til polyelektrolyttinteraksjoner og tilbyr også en lovende løsning for å det presserende problemet med å levere terapeutiske oligonucleotides in vivo. Å utvikle prediktive struktur-eiendomsforhold for PCMer har vist seg vanskelig, delvis på grunn av tilstedeværelsen av sterke kinetiske feller under nanopartikkel selvmontering. Denne artikkelen diskuterer kriterier for valg av polymerer for PCM-konstruksjon og gir protokoller basert på saltannealing som muliggjør montering av repeterbare nanopartikler med lav polydispersitet. Vi diskuterer også PCM-karakterisering ved hjelp av lysspredning, småvinkelrøntgenspredning og elektronmikroskopi.

Introduction

Når motsatt ladede polyelektrolytter blandes i vandig løsning, entropi gevinst fra frigjøring av sine motsmoter forårsaker demixing av løsningen i en polymer-rik kondensert fase og en polymer-utarmet supernatant1,2,3,4,5, et fenomen kjent som polyelektrolytt kompleksasjon. Hvis en nøytral hydrofil blokk konjugerert til en eller begge polyelektrolytter, oppstår nanoskalafaseseparasjon i stedet (figur 1A). De resulterende selvmonterte kjerneskall nanopartikler er forskjellig referert til som polyelektrolyte komplekse micelles (PCMs), polyion kompleks micelles, blokk ionomer komplekser, eller koacervat-core micelles av analogi til overflateaktivt micellization, selv om alle komponenter i systemet er hydrofile6,7. En PCMs evne til å innkapsle hydrofile molekyler som proteiner og nukleinsyrer, samt den omfattende tunabiliteten som tilbys av blokkkopolymerbærerarkitekturen, gjør dem attraktive kandidater for å levere terapeutiske molekyler in vivo8,9,10,11,12,13.

Å levere terapeutiske nukleinsyrer til cellulære mål er en spesielt viktig utfordring, og en som PCMs tilbyr flere fordeler. Terapeutiske nukleinsyrer (genetisk DNA, mRNA og oligonucleotides som siRNA) har enormt potensial for å forbedre menneskers helse, men må overvinne mange biologiske og fysiske barrierer for å innse atpotensialet 14,15,16. Bare nukleinsyrer er degradert av serum og cellulære kjerner, blir raskt ryddet fra sirkulasjon, og deres sterke negative ladning gjør det vanskelig for dem å trenge inn i cellemembraner uten hjelp. Nåværende tilnærminger for å overvinne disse barrierene inkluderer kostbare kjemiske modifikasjoner for å forhindre skade fra kjerner og / eller innkapsling i ulike lipidnanopartikler montert via hydrofobe interaksjoner15,17,18. Mens disse metodene har vist seg effektive for lokale injeksjoner og levermålretting, gir systemisk bruk betydelige begrensninger for toksisitet, immunogenisitet og begrenset biodistribusjon16. Til sammenligning bruker PCM-er den negative ladningen av nukleinsyrer til å kondensere dem innenfor den faseseparerte kjernen, mens den nøytrale koronaen gir en steric barriere mot nedbrytning samt en plattform for å innlemme ligander for å forbedre målretting eller internalisering11,19. In vitro og dyrestudier har vist at PCM kan effektivt levere ulike nukleinsyre nyttelaster20,21,22,23,24, men svakheter i vår evne til å forutsi PCM egenskaper som størrelse, form, og stabilitet fra egenskapene til bestanddeler polymerer har hindret deres bredere adopsjon.

Nylig arbeid av vår gruppe og andre i feltet har begynt å løse dette problemet ved å utvikle struktur-eiendom, og i noen tilfeller struktur-eiendom-funksjon relasjoner for PCMer dannet fra nukleinsyrer og ulike kationsyrenøytrale polymerer7,25,26,27. To konsekvente temaer som har dukket opp fra disse studiene er viktigheten av å utvikle velkontrollerte, repeterbare protokoller for PCM-montering og fordelen av å bruke flere teknikker for å karakterisere de resulterende nanopartiklene. Polyelektrolytter, spesielt de med høy ladningtetthet som nukleinsyrer, samhandler veldig sterkt med hverandre, og ser ut til å lett bli kinetisk fanget ved blanding, noe som resulterer i PCM-preparater som er svært følsomme for små variasjoner i prosedyren og viser høy polydispersitet og dårlig gjentagbarhet fra batch til batch. PCMs har også vist seg å vedta et bredt spekter av former og størrelser avhengig av atomnivåkonfigurasjonene til komponentene sine, og fange dette mangfoldet med individuell karakteriseringsteknikk er svært vanskelig, spesielt siden noen vanlige teknikker som dynamisk lysspredning (DLS) krever antagelser om partikkelform for tolkningen.

I denne artikkelen diskuterer vi materialdesign og valg for PCMer, med fokus på oligonucleotides og kationiske nøytrale diblock kopolymerer. Vi beskriver deretter en salt annealing protokoll som bruker høye saltkonsentrasjoner etterfulgt av langsom dialyse for å unngå kinetisk fangst under PCM montering. Polyelektrolytter blandes i høye saltforhold hvor elektrostatiske attraksjoner screenes, så saltkonsentrasjonen senkes sakte for å tillate polyelektrolytter å bosette seg i sine mest energisk gunstige konfigurasjoner, analogt med den langsomme kjøleprosessen av termisk annealing. Ved hjelp av denne protokollen, vi er regelmessig i stand til å oppnå eksepsjonelt lav polydispersity og høy repeterbarhet for oligonucleotide PCMs7,26. Til slutt beskriver vi hvordan fire separate måleteknikker kan brukes til å karakterisere PCMer over et svært bredt spekter av lengdeskalaer, fra ekstern morfologi til intern struktur: DLS, flervinslysspredning (MALS), liten vinkel røntgenspredning (SAXS), og transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Vi håper at disse protokollene vil gjøre det mulig for flere forskere å effektivt utforske egenskapene til disse interessante nanopartiklene.

Polymer valg og forberedelse
PCM egenskaper er sterkt påvirket av de fysiske og kjemiske egenskapene til bestanddelene polymerer, noe som gjør polymervalg et kritisk skritt i designprosessen. De mest velkarakteriserte blokkkopolymerer for nukleinsyre-PCMer er lineære diblocks som poly(lysin)-poly(etylenglykol) (pLys-PEG), men PCM-er kan dannes mellom polyelektrolytter og en rekke hydrofile nøytrale ladede polymerer, som kan genereres på en høygjennomstrømningsmåte 28. Valget av ladet gruppe påvirker stabiliteten til ionparing og form av micelles26, og PCM-størrelse har vist seg å øke med lengden på den ladede blokken5,7,26 ( Figur2), og dermed tillate PCM egenskaper som skal justeres for kravene til en ønsket applikasjon. For lineære diblocks har vi funnet ut at den siktede blokken skal ha minst 10 kostnader og bli sterkt belastet ved ønsket pH. Lengre ladede blokker kan fremme PCM-dannelse med oligonucleotides som siRNA, som er vanskelig å komplekse med kortere blokker21. Vi har observert PCM-dannelse med blokklengder opp til 200, og litteraturen beskriver lengre polymerer. Mer fleksibilitet er tilgjengelig i valg av nøytrale blokker24, men erfaring har vist at svært korte nøytrale blokker fører til aggregering i stedet for nanopartikkeldannelse, og at den minste nøytrale lengden øker med ladet blokklengde. For pLys-PEG kreves en PEG MW på minst 3000–5000 for pLys lengder under ~ 50, og lengre lengder kreves som den ladede blokken økes ytterligere. Økt nøytral blokklengde resulterer i økt PCM-størrelse, spesielt skalltykkelse, på grunn av steric trengsel av nøytrale polymerer.

Dette manuskriptet presenterer en protokoll for å forberede PCMer fra lyofiliserte høyrenhet pLys-PEG og oligonucleotides av kjent mengde, men bør være lett tilpasningsdyktig til andre systemer også. Vi har testet det med hell med flere ladede polypeptider, inkludert polyarginin og polyglutaminsyre, samt flere syntetiske polyelektrolytter, som polyakrylsyre og poly(vinylbenzyltrimetylammonium). Vi beskriver også å forberede PCMs med et stoichiometrisk forhold mellom polyelektrolyttladninger, men dette er lett å endre. Vi finner det enklest å arbeide i ladekonsentrasjonenheter (c.c.), som også naturlig rommer polymerer som ikke er fulladet. Hvis enten polymer ikke er godt karakterisert, bør det tas hensyn til nøyaktig å bestemme polymerlengdene/massene og sikre at overflødig salt ikke er til stede utover det som trengs for ladenøytralisering ved dialyse, for eksempel. Tilstedeværelsen av eventuelt beholdt vann bør også redegjøres for når konsentrasjoner beregnes. Nukleinsyrekonsentrasjon kan enkelt kvantifiseres ved absorbans ved 260 nm, og tilstedeværelse eller fravær av terminalfosfater bør vurderes ved beregning av c.c.

Når du bruker oligonucleotides som polyanioner, hybridisering tilstand og kjemisk struktur bidra til å bestemme tilbøyelighet til selvmontering og egenskapene til den resulterende PCM5,7,26. Optimalisering av disse, innenfor kravene til biologisk effekt hvis du bruker PCMer for levering, vil øke sannsynligheten for å danne de ønskede strukturene. Nyttige verktøy for å analysere hybridisering inkluderer MATLAB-funksjoner for nukleinsyrer, NUPACK29og IDT OligoAnalyzer. Vi anbefaler å analysere en kandidatsekvens for å forstå styrken av binding til 1) seg selv i en hårnålformasjon; 2) en annen kopi av samme sekvens (selv-dimer); og 3) til andre oligonucleotides tilstede i systemet. DNA og RNA smeltetemperaturer for en bestemt sekvens kan også beregnes ved hjelp av nærmeste nabo metode30,31. Termisk annealing av nukleinsyrer (trinn 2.3) denatures noen gjenværende sekundær struktur i de enkelte nukleotider og fremmer likevekt folding.

PCM karakterisering og analyse
Et bredt spekter av teknikker er tilgjengelig for karakterisering av nanopartikler, inkludert statisk og dynamisk lysspredning, liten vinkelspredning av elektroner eller nøytroner og elektronmikroskopi. I denne artikkelen gir vi protokoller for to lysspredningsteknikker, liten vinkel røntgenspredning og to elektronmikroskopiteknikker.

DLS måler autokorrelasjonen av temporale svingninger i spredningsintensitet i en vinkel fra Brownian-bevegelsen til prøven. Montering av disse dataene kan gi hydrodynamisk radius og polydispersitet for sfæriske micelles (figur 3). Flere vinkellysspredning (MALS) måler den statiske spredningsintensiteten i mange vinkler. Denne kantete avhengigheten beskriver formen på nanopartikkelen, men er begrenset til lengdeskalaer som er lengre enn ~ 50 nm for synlig lys, noe som begrenser effektiviteten for mindre nanopartikler. Begge teknikkene er basert på brytningsindekskonflikt og beskriver først og fremst de ytre dimensjonene til nanopartikkelen.

Liten vinkel Røntgenspredning (SAXS) bruker røntgenstråler som spredningssonden, og deres kortere bølgelengde tillater målinger over en rekkevidde på ~ 0,1-100 nm. Montering av observert spredningsintensitet vs. vinkel (konvensjonelt uttrykt som momentumoverføring q)gir informasjon om PCM morfologi (dvs. størrelse og form) og også intern struktur. Hvis en absolutt intensitetskalibrering er tilgjengelig, og hvis spredningsintensiteten kan ekstrapoleres til null vinkel, kan PCM-masse- og aggregeringsnummer også anslås32, noe som gjør SAXS til en ekstremt allsidig og verdifull metode. Små vinkel nøytron spredning (SANS) er følsom over et lignende utvalg av lengde skalaer, men er bare tilgjengelig på spesialiserte fasiliteter og vil ikke bli eksplisitt diskutert i denne artikkelen33,34,35.

De siste årene har sett bruk av benkeplate SAXS instrumenter, men vi finner at synchrotron kilder er bedre egnet for PCM karakterisering, som deres høyere intensitet gjør at data kan samles mye raskere for disse lavkontrast prøver. Vi tilbyr en kort protokoll for å anskaffe PCM SAXS-data på Beamline 12-ID-B ved Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) fra et brukerperspektiv. Denne protokollen bør gjelde for de fleste synchrotron kilder, men rådgivning med lokale ansatte før du foreslår et eksperiment er sterkt anbefalt. Vi tilbyr også en datareduksjons- og analyseprotokoll ved hjelp av Irena36, et gratis sett med makroer skrevet for Igor Pro. Irena inkluderer et allsidig sett med formfaktorer for modellering av SAXS-data og muliggjør bygging av flerkomponentmodeller som er i stand til å beskrive den komplekse spredningsprofilen til PCMer (se Representative resultater, figur 4). Irena har også omfattende dokumentasjon og tutorials tilgjengelig på nettet. Før du prøver prosedyrene nedenfor, anbefaler vi å gjøre seg kjent med disse, spesielt opplæringen "Modellering av SAXS-data med to hovedscatterpopulasjoner".

Strålingsskader er en bekymring for røntgenspredning, men flere tiltak kan brukes for å minimere den. Spesielt anbefaler vi at du bruker et strømningscelleoppsett med en sprøytepumpe og PCM-prøve som flyter under datainnsamling, i stedet for en forseglet kapillær. Dette forenkler også i stor grad bakgrunnssubtraksjon. Vi foreslår også å ta flere eksponeringer av den flytende prøven i stedet for en lengre for å begrense strømmen som et enkelt utvalgsvolum ser og for å tillate sammenligning av eksponeringsdataene for å identifisere eventuelle skader.

I motsetning til spredningsteknikkene, som vanligvis krever montering for å tolke, gir transmisjonselektronmikroskopi (TEM) et ekte romvisuelt bilde av nanopartiklene ved å sende en elektronstråle gjennom prøven og projisere et bilde på en scintillation-skjerm (Figur 5). Vi presenterer protokoller for to TEM-teknikker i denne artikkelen. Cryo TEM fryser micelleprøver i et tynt lag med glassglassis, og bevarer strukturell konformasjon med minimale fremmede stoffer, optimalt for micelles ≤~10-100 nm i radius. Negativ flekk TEM bruker et tungmetallsalt (f.eks. uran) til å omgi prøven etter at den er tørket på overflaten av et rutenett. Den tette flekken vil spre flere elektroner enn prøven, legge til kontrast og produsere et negativt bilde av prøven. Cryo TEM anbefales for bilder av høy kvalitet. Det er imidlertid dyrere, tidkrevende, og kan ikke gi tilstrekkelig kontrast. Når dette er en bekymring, bør negative fargede prøver brukes. Eksempler på hver av dem vises i figur 5.

Hver av disse teknikkene rapporterer om litt forskjellige aspekter av nanopartiklene, med forskjellige styrker og begrensninger. Lysspredning er lett tilgjengelig, og er ofte den raskeste tilnærmingen, men har betydelige begrensninger i størrelse og formoppløsning. SAXS kan gi informasjon over et stort spekter av lengdeskalaer med rimelig høy gjennomstrømning, men krever spesialisert utstyr for å skaffe dataene, samt modellering for å tolke dem. TEM-bilder er enkle å tolke, men kan begrenses i kontrast og er iboende lav gjennomstrømning. Vår erfaring har vist at bruk av flere teknikker for karakterisering øker informasjonen som kan fås om PCM-egenskaper og forenkler tolkning en datasett hentet fra hver enkelt alene. For eksempel undersøker SAXS og TEM primært en PCMs tette kjerne, mens lysspredning rapporterer om de totale dimensjonene til nanopartikkelen. Dermed, kombinere dem tillater måling av både kjerne og corona størrelse. TEMs evne til å skaffe ekte rombilder kan gi bakkesannhetsdata for å muliggjøre valg av passende formfaktorer for modellering av SAXS-data som ellers kan være tvetydige. Denne artikkelen beskriver protokoller for alle fire teknikker, og en eksempelprosess for å bruke dem til å karakterisere et ukjent utvalg er gitt i Diskusjon-delen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av materialer

  1. Vei ut lyofilisert diblock polymer og tilsett vann opp til nesten volumet som kreves for en lagerløsning på 10 mg / ml endelig konsentrasjon. Vortex med maksimal hastighet i 2 min.
  2. Sonicate i 5 min. Svært lange diblocks kan kreve ekstra sonikering. Lagerløsningen skal virke helt gjennomsiktig og homogen.
  3. Juster pH til 7,4 med NaOH eller HCl etter behov. Tilsett vann i det endelige volumet. pLys-PEG-løsningene er ganske stabile, men bør kjøles ned for langtidslagring og pH må kontrolleres før bruk. Lyofilisering er å foretrekke fremfor frysing.
  4. Resuspender lyofilisert oligonucleotid(er) ved ønsket lagerkonsentrasjon, typisk 2–5 mM molekylær konsentrasjon for lengder på 50 nt eller under. Vortex grundig for å sikre full oppløsning.
  5. Beregn molarkonsentrasjoner ved hjelp av molekylvekt eller lengde som beskrevet i innledningen.
  6. Beregn molarladekonsentrasjoner (c.c.), der

Equation 1

Polyelektrolyttladningen er antall ladede monomerer, mens nukleinsyreladningen er antall baser minus 1, forutsatt ingen fosforylering. Husk at dobbelt-strandet DNA vil ha dobbelt så mange kostnader per molekyl sammenlignet med en-strandet DNA.

  1. Lag fortynnet lager ved 20 mM c.c. for hver polymer.

2. Nukleinsyre Polyelektrolytt Micelle Forberedelse

  1. I et mikrocentrifugerør på 1,5 ml blandes du følgende til et totalt volum på 280 μL:
    1. 200 μL kjernefritt vann (ultrarent vann for PCM-er som ikke inneholder nukleinsyrer).
    2. 40 μL fosfatbufret saltvann (PBS, 137 ml natriumklorid, 10 ml fosfat, pH 7,4 når det fortynnes til 1x) eller annen egnet buffer37.
    3. 40 μL på 20 ml c.c. oligonucleotid. For dobbeltstrandede oligonucleotides tilsett 20 μL av hver tråd ved 20 ml c.c.
  2. Inkuber oligonucleotidoppløsningen i 5 min ved 70 °C. Hvis den beregnede smeltetemperaturen for oligonucleotides er høyere, bør temperaturen økes tilsvarende. Vær oppmerksom på at RNA vil forringes ved forhøyede temperaturer, så dette trinnet bør ikke være lengre hvis dette eller andre sensitive komponenter er til stede.
  3. Avkjøl i 15 min. Tilsett 40 μL av 20 ml c.c. diblock, og virvel umiddelbart i 20 s med maksimal hastighet. Inkuber 5 min ved romtemperatur (RT).
  4. Utfør saltannealen.
    1. Tilsett 80 μL natriumklorid på 5 M for en endelig konsentrasjon på 1 M NaCl og sluttvolum på 400 μL. Vortex for 10 s med maksimal hastighet.
    2. Inkuber i 10 min ved romtemperatur, og last deretter inn i dialysepatroner. Vær oppmerksom på at de oppførte molekylvektcutoffsene bestemmes for kuleproteiner og vil ikke være nøyaktige for lineære polymerer. Vi opplever at en 2k MWCO-patron unngår prøvetap og gir også gradvise endringer i ionisk styrke.
    3. Forbered dialysebad.
      1. Beregn volumet av dialysebad som trengs:
        Equation 2
      2. Bland 10x PBS (eller annen ønsket buffer), 5 M NaCl og ultrarent vann for en endelig løsning på 1x PBS og 0,5 M NaCl, samt to løsninger av 1x PBS.
    4. Last dialysepatroner.
      1. Etikettpatroner med permanent markør. Bløtlegg patroner i buffer i minst 2 min for å hydrere membraner.
      2. Fjern hetten ved å vri mot klokken. Last prøve med gel lasting pipette tips. Fjern overflødig luft ved å klemme membraner forsiktig. Sett på lokket igjen.
      3. Sett patroner i 1x PBS, 0,5 M natriumklorid dialysebad. Patroner skal flyte, med begge membranene utsatt for badekaret. Skum flyter kan brukes om nødvendig.
    5. Dialyse
      1. Inkuber i 24 timer røring sakte med en magnetisk rørebar.
      2. Flytt patronene til et nytt bad på 1x PBS eller annen ønsket arbeidsbuffer. Inkuber i 24 timer, rør sakte med en magnetisk rørebar. Gjenta dette trinnet.
    6. Gjenopprett prøven.
      1. Fjern patronene fra badekaret. Fjern hetten og gjenopprett prøven ved hjelp av en gellastingpipettespiss. Vær oppmerksom på at det gjenvunnede volumet kan være høyere enn den første 400 μL på grunn av hevelse i membranen. Rekordgjenvunnet volum hvis liten fortynning er en bekymring.
      2. Plasser prøven i et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør. PCM utarbeidet på denne måten bør være stabil i flere måneder når nedkjølt, forutsatt at kjerneforurensning har vært unngått.

3. Dynamisk lysspredning

  1. For å sikre støvfrie forhold bør buffere filtreres nøye (filtrert 3x gjennom en 0,22 μm sprøyte eller vakuumfilter) og glass grundig rengjort mellom prøver. Det er også viktig å sikre at prøven har nådd termisk likevekt før målingen gjennomføres.
  2. Fortynn PCM-prøven til 0,2 mM c.c. (10x hvis du bruker protokollen som er beskrevet ovenfor) med ønsket arbeidsbuffer og last inn i en passende cuvette. Vi bruker en liten volum cuvette, som krever ~ 200 μL prøve etter fortynning.
  3. Sett DLS-detektorposisjonen til 90°.
  4. Juster laserkraften og/eller demfyatøren slik at tellehastigheten er 100 000–200 000 tellinger per sekund (cps), hvis mulig. Antall priser så lavt som 10 kcps kan brukes, men måletider må kanskje utvides for å oppnå god statistikk (trinn 4.1). Høyere antall tall bør unngås, da flere spredninger vil forvirre målingen.
  5. Innhente data for 1 min. Tellefrekvensen skal være konstant over hele oppkjøpstiden; Hvis ikke, indikerer dette at noen komponent i prøven eller instrumentet ennå ikke er likegyldig.
  6. Undersøk autokorrelasjonsdataene. Den langvarige grunnlinjen skal være svært flat, og autokorrelasjonskurven skal være jevn, med minimal spredning, som vist i figur 3A. Grunnlinjedrift indikerer mangel på likevekt, og støy i dataene kan forbedres ved å skaffe flere data.
  7. Tilpass autokorrelasjonsfunksjonen.
    1. Bruk REPES38,39 til å utføre regularisert omvendt Laplace transformasjon for å levere en fordeling av avslapningstider og en diffusjonskoeffisient, D. Denne metoden beregner deretter hydrodynamisk radius, Rh, ved hjelp av Stokes-Einstein-ligningen:
      Equation 3
      Figur 1B viser en representasjon av Rh og figur 3B viser resultatet av REPES.
    2. Alternativt kan du bruke andre metoder, inkludert CONTIN40,41 (en alternativ regulariseringsalgoritme) eller ikke-negativ minst firkanter tilpasning (NNLS). Konsistente resultater fra flere tilpasningsmetoder er en signatur av data av høy kvalitet. Merk at cumulant analyse (standard på mange instrumenter) gir ikke-fysiske verdier for multimodal størrelse / lengde distribusjoner.

4. Multi-vinkel lys spredning

MERK: Lys spredningsintensitet kontra vinkel kan måles på en rekke instrumenter. Vi har fått gode resultater ved hjelp av både goniometer-baserte instrumenter og flere detektorinstrumenter, kjører i batchmodus.

  1. Juster PCM-konsentrasjonen og belysningsintensiteten for å gi tilstrekkelig signal/støy kontra en bufferprøve i alle vinkler uten å mette noen detektor. Sistnevnte kan testes ved å forberede prøver ved ulike fortynningsfaktorer og se etter linearitet av intensitet vs. konsentrasjon (forutsatt minimal interaksjon mellom PCM).
  2. Registrer lysspredningshastigheten fra 15° til 135° i 1 min per vinkel. Hvis prøven og instrumentet er riktig likegyldig, vil spredningshastigheten være konstant over måletiden.
  3. Plott normalisert spredningshastighet, jegsynd (θ), vs. q, hvor jeg er spredningshastigheten. q er spredningsvektoren (fotonmomentumoverføring) som definert av

Equation 4

der η = oppløsningsmiddelbrytningsindeksen, θ = målevinkelen, og λ = lyskildens bølgelengde. Figur 4 viser en tomt med MALS-spredningsintensitet.

5. Liten vinkel Røntgenspredning

  1. Datainnsamling
    1. Forbered PCM-prøver som beskrevet ovenfor ved 2 mM ladekonsentrasjon for oligonucleotide PCMer for rikelig spredning over bakgrunnen. For PCMer som mangler tunge atomer (f.eks. fosfor i nukleinsyrer), kan det være nødvendig med høyere konsentrasjoner. Spredning lengde tettheter kan estimeres ved hjelp av kalkulatorer som SASSIE42.
    2. For å minimere strålingsskader ved å scavenging frie radikaler, legg til glyserol fra en konsentrert (f.eks. 50%) lageroppløsning slik at micelleoppløsningen inneholder 1 % (v/v) glyserol. Vær oppmerksom på at pen glyserol er svært viskøs og vanskelig å måle nøyaktig. Fortynning med vann eller buffer anbefales på det sterkeste.
    3. Klargjør et stort volum arbeidsbuffer med 1 % glyserol for bruk som bakgrunnsskjerm.
    4. Forbered strålelinjespesifikt strømningscelleapparat og kalibreringsdetektor. Protokollen bruker en kvartskapillær 3 mm diameter koblet til en datastyrt sprøytepumpe med liten diameter og minimal lengde polyetylenrør. Et minimumsvolum på ~ 140 μL per prøve er nødvendig med dette oppsettet.
    5. Bestem eksempeleksponeringsparametere. Den optimale eksponeringen vil variere avhengig av stråleintensitet, detektorfølsomhet og konsentrasjon, spredningsstyrke og skadefølsomhet for prøven, men målet er å utsette prøven for minimal fluks som kreves for å oppnå tilstrekkelig spredningsintensitet over q-interesseområdet.
    6. For oligonucleotide/pLys-PEG PCMer, 30x 0.2 s eksponeringer med en 1 Hz repetisjonshastighet gir god datakvalitet med liten merkbar skade. For nye eksempler kan følgende fremgangsmåte være nyttig:
      1. Forbered PCM-prøver over en rekke konsentrasjoner (f.eks. 10–10 000 μM c.c.).
      2. Fra en mellomliggende konsentrasjon, alternative PCM- og bufferprøver med varierende eksponeringstider. Se nedenfor for datainnhenting og reduksjonsprosedyre. Eksempelsignal bør ha god statistikk (liten statistisk feil eller jevn variasjon på tvers av q). Hvis statistikken er dårlig, kan eksponeringstiden økes.
      3. Eksempelsignalet bør også være tydelig skilles fra bakgrunn over q interesseområde. Beregne og tegne inn (signalbakgrunn)/bakgrunnsforholdet i forhold til q for å bestemme signal-/bakgrunnsforhold. Hvis signal-/bakgrunnsforholdet er lavt, bør prøvekonsentrasjonen økes.
      4. Kontroller at spredningsintensiteten (normalisert til konsentrasjon) er uavhengig av prøvekonsentrasjon ved å anskaffe data ved høyere og lavere konsentrasjoner, skalering av eksponeringstid om nødvendig. Interpartikkelinteraksjoner (den mest sannsynlige årsaken til konsentrasjonsavhengighet) vil være mest uttalt i det lave q-området.
    7. Innhente data for PCM-eksempler og bakgrunn (dvs. buffer med glyserol).
      1. Avtrekk sprøytepumpen for å flytte prøven gjennom kapillæren. Enten toveis eller en gang-gjennom bevegelse er akseptabelt, men forsiktighet bør tas for å isolere hver prøve (f.eks. ved å sette inn en luftboble mellom prøver). Prøver kan gjenvinnes og kan gjenbrukes på nytt hvis ingen strålingsskader er sett.
      2. Når flyten er startet, kan du utløse røntgeneksponeringen og datainnsamlingsprogrammet som er beskrevet ovenfor. Det bør utvises forsiktighet at stråleeksponeringen slutter før væskestrømmen gjør det.
    8. Etter hver prøve, utfør azimuthal snitt og plotte 1D-profilene (dvs. intensitet vs. q) for hver eksponering sammen. De bør være identiske innen statistisk feil. Endring av signal over tid kan indikere strålingsskader.
      1. Isolerte anomaliøse profiler kan indikere tilstedeværelsen av mikrobobler. Hvis bobler observeres ofte, kan det hjelpe å redusere strømningshastigheten.
    9. Gjennomsnittlig 1D-spredningsprofilene.
    10. Innhente data for buffer-bare prøver ofte (én gang per hver 4-5 PCM prøver) og sammenligne disse over tid. Økt signal fra bufferprøver indikerer at kapillæren kan være forurenset med strålingsskadet prøve.
      1. Når kontaminering merkes, vask kapillæren med blekemiddel, og vurder å redusere eksponeringstiden hvis mulig.
  2. Datareduksjon og analyse ved bruk av Irena
    1. Importere micelle og ascii-datasett for bakgrunn (SAS/Data import & eksport/import av ASCII SAS-data).
    2. Trekk fra bakgrunnsspredning fra eksempeldata. Vanligvis viser de høyeste q-verdiene (f.eks. q > 0,5) usammenhengende spredning fra løsningsmidlet som dominerer signalet. Skalering av bakgrunnsdataene slik at de samsvarer med eksempeldataene over dette q-området, fjernes enhver variasjon på grunn av variasjon i stråleintensitet og prøvekonsentrasjon.
      1. Tegne inn eksemplet og bakgrunnen sammen på en loggskala. Kontroller flat intensitet ved høy q (SAS/ Data Manipulation / Data Manipulation I). Beregn eksempel-/bakgrunnsforholdet (Data1/Data 2), tegne inn i en lineær loggskala og kontrollere den høye q-asymptoten.
      2. Beregn gjennomsnittlig (eksempel/bakgrunn) forhold over dette q-området (bruk en egendefinert makro eller kopier/lim inn i et regneark fra dataleseren).
      3. Bruk makroen Datamanipulering til å skalere bakgrunnen (f.eks. Endre data 2)ved hjelp av forholdet som er beregnet ovenfor, og plotte forholdet mellom bakgrunnstrukket signal til bakgrunn kontra q ([Data1-Data2]/Data2), som kontrollerer at det nå asymptotes til null ved høy q. Ta opp dette forholdet; det bør være <1-2% borte fra 1,0 for hver prøve.
      4. Tegn inn bakgrunnstrukket signal (Data1-Data2) vs. q og lagre dataene med et nytt navn. Ikke overskriv de opprinnelige dataene.
      5. Hvishøy- q-data ikke er tilgjengelig, bruk en skaleringsfaktor på 1 for bakgrunnssubtraksjon, men vær oppmerksom på at unøyaktigheter kan innføres i q-områder der signal-/bakgrunnsforholdet er lite.
    3. Åpne modelleringsmakroen (SAS/modellering), og last deretter inn og tegn de bakgrunnstrekkede dataene (Data cntrls/Legg til data). Ikke skaler i denne makroen.
    4. Først finner du en omtrentlig modell for den eksterne overflaten av PCM (micelle størrelse / form):
      1. I Data cntrls, velg lav til moderat q-område (f.eks. ~0.003Å-1 < q < ~0.1Å-1). Hvis svingninger er synlige, må du inkludere dem.
      2. Velg en skjemafaktor som passer for dataene. Skråningen ved lav q er et tegn på nanopartikkelform, som også kan verifiseres gjennom TEM og/eller MALS. Bruk Schulz-Zimm sfæroid (q0), sylinder (q-1), eller fleksibel sylinder (q-2) modeller. Irena tilbyr verktøy for montering av kraftlover (SAS/Support Tools for tomter og tabeller).
      3. I Modell cntrlsmerker du av for den første spredningspopulasjonen (1P) og kontrollerer at den er den eneste som er i bruk (Merk av for Bruk? ).
      4. Velg Størrelsesfordeling for Modell, og velg ønsket distribusjonstype og skjemafaktor. Angi innledende parametere for søket ved å angi verdier i feltene Skala, Gjennomsnittsstørrelseog Bredde, og klikk Beregn modell for å tegne den resulterende skjemafaktoren.
        MERK: Fleksibel sylinderformfaktor kan legges til som en brukerskjemafaktor og lastes ned fra https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irena. Parametrene 1 og 2 tilsvarer sylinderens lengde og Kuhn-lengden.
      5. Når rimelige parametere er funnet, klikker du på Tilpass modell for å utføre en ikke-lineær minst firkanter som passer til dataene. Størrelsesdistribusjonsmodellen gir gjennomsnittlig radius og bredde.
        Slik beregner du polydispersitet (PDI) bruk
        Equation 5
        Som med enhver ikke-lineær tilpasningsprosedyre, kan det være nødvendig å justere dataområdet(q-regionen) og starte parametere for å oppnå en stabil, fysisk rimelig passform.
      6. Når en rimelig passform er oppnådd, lagre den (Lagre i Notebook/ Store imappen).
    5. Deretter modellerer du spredningen av de enkelte polymerene i PCM-kjernen. Dette kan fanges opp av en strømlovmodell (f.eks. q-2 for ideelle kjeder, q-5/3 for hovne kjeder osv.). Irena implementerer dette gjennom en Beaucage modell43:
      Equation 6
      hvor P er maktloven og G og B er prefactors.
      1. Juster datakontrollene for å dekke hele q-området og plotte modellen på nytt (Beregn modell). Vanligvis vil overflødig spredning observeres i moderat til høy q-området (f.eks. q > ~0.1Å-1).
      2. Bruk datakontrollene til å velge q-området der overflødig spredning (> 10x skjemafaktormodellen) observeres.
      3. Legg til en annen spredningspopulasjon (2P) og kontroller at den er den eneste som er i bruk (fjern merket for Bruk? for 1P).
      4. Velg Enhetlig nivå for modellen. B og P er de relevante parametrene. Bruk støtteverktøyene for plotting eller fit P/B mellom csrs-makroen for å få en innledende gjetning for disse parameterne, og juster Guinier-faktorene G og Rg for å sikre at modellen ikke forutsier overdreven spredning ved lav q.
      5. Når det gjelder skjemafaktoren, utfør en ikke-lineær passform og registrerer parameterne og modellen.
    6. Deretter, Hvis en diffraksjon topp er til stede, som i figur 4,legge til en tredje modell for en diffraksjon topp i q utvalg av interesse(q = ~ 0,22 Å-1 i dette tilfellet).
    7. Når omtrentlige tilpasningsverdier er oppnådd for de enkelte spredningspopulasjonene, slår du på alle tre sammen (velg Bruk? for hver) og optimaliser den kombinerte passformen.
    8. Kontroller at hver verdi forblir fysisk rimelig. Resultatet av denne prosedyren bør være en sammensatt modell som beskriver SAXS-dataene godt over et stort utvalg av størrelsesskalaer, som vist i figur 4. Lagre passformen ved hjelp av Store i mappe-knappen for å lagre i Igor.

6. Overføring Elektron Mikroskopi (TEM)

  1. Cryo TEM
    1. Velg rutenettet. Vi anbefaler holey karbon støtte film på en standard TEM rutenett eller lacey karbon som et alternativ. I begge tilfeller vil hullene mellom karbonet gi et bildeområde med ren glasslegemet is og prøve og ingen film.
    2. Plasser rutenettet karbon side opp i en glød lossing apparat på et rent glass lysbilde. Innpakning av lysbildet i laboratoriefilm kan hjelpe med netthåndtering. Unngå å berøre midten av rutenettet med pinsett og alltid klemme nær kanten av rutenettet.
    3. Utsett rutenettet i 30 s.
    4. Forbered en vitrifiseringsrobot for prøveavsetning.
      1. Sett til 100% fuktighet og RT og legg til flekkpapir. Forbered flytende etan og flytende nitrogenbad ved foten av roboten. Se nettbaserte opplæringsprogrammer og videoer for ekstra hjelp med vitrifisering robot forberedelse og bruk.
    5. Fortynn prøve 5x.
    6. Ved hjelp av den negative handlingen pinsett utstyrt med vitrifisering robot, plukke opp et rutenett, deretter feste pinsett til roboten og flytte pinsett inn i kammeret.
    7. Mens du er i roboten, tilsett 4 μL av prøven til karbonsiden av gitteret ved hjelp av en pipette gjennom hullet i siden av maskinen.
    8. Inkuber i 4 min.
    9. Bruk roboten til å blot 3–5 s med filterpapir.
    10. Vitrifiseringsroboten vil stupe nettet inn i flytende etan.
    11. Fjern pinsettene og flytt nettet til flytende nitrogen og inn i en oppbevaringsbeholder, som også bør være under flytende nitrogen. Denne prosessen fikser prøven i et tynt lag med glass glassis. Minimer tiden nettet bruker ut av flytende etan eller flytende nitrogen i løpet av dette trinnet.
    12. Avkjøl kryoprøveholderen ved hjelp av flytende nitrogen. Hold en Dewar og reservoar full.
    13. Når du er klar til å bilde, laster du rutenettet på kryoprøveholderen. Hold prøven under flytende nitrogen eller kort i den ekstremt kalde nitrogendampen like over væskeoverflaten.
    14. Bilde av gitteret på 120 kV mellom 75kx og 150kx i tynn og tykk is, fordi forskjellige størrelse micelles kan foretrekke en viss istykkelse.
      1. Begrens stråleeksponering for å unngå smeltende is og skade prøven. Ikke fokuser direkte der du planlegger å bilde; fokus i nærheten. Bare eksponer interesseområdet mens du tar et bilde.
      2. Pass på at du skiller væskeetandråper fra prøven når du ser på bilder (se figur 5).
  2. Konvensjonell TEM ved hjelp av negativ farging
    1. Forbered flekken.
      1. Kok ~ 10 ml ultrarent vann. Veie ut 0,1 g uranylformat (UFo) inn i et 15 ml konisk rør.
      2. Tilsett 5 ml varmt vann til UFo pulveret for en 2% løsning. Lukk tett og pakk i aluminiumsfolie for å blokkere lys. En 1% uranylacetatflekk brukes også ofte.
      3. Vortex eller rist kraftig i 5 min. Fest røret til vortexeren vil hjelpe. Filtrer gjennom et 0,2 μm sprøytefilter i et rent konisk rør.
      4. La avkjøles 10 min til RT. Tilsett 25 μL 5M NaOH og vortex umiddelbart i 2 min.
        1. Alternativt fryse 200 μL aliquots av 2% UFo. Når du er klar til bruk, tine en aliquot, tilsett 1 μL av 5 M NaOH, og vortex i 2 min.
      5. Hold flekken innpakket i folie eller borte fra lys.
    2. Fortynn eksempel 10x i 1x PBS (eller ønsket buffer).
    3. Velg rutenett. Vi anbefaler karbonstøttefilm på kobbergitter. Den mørkere, blankere siden av gitteret er den karbonbelagte siden hvor prøven vil bli deponert og farget.
    4. Plasser rutenettet karbon side opp i en glød lossing apparat på et rent glass lysbilde. Se trinn 6.1.2.
    5. Utsett rutenettet i 30 s.
    6. Plukk opp nettet med karbonsiden som fortsatt vender opp og hold med negative virkningspiner ved kanten av rutenettet for å hindre å rive bildeområdet i midten. Sett ned pinsettene med rutenettet fortsatt holdt karbon side opp.
    7. Påfør en 4 μL dråpe prøve på toppen (karbonsiden) av gitteret med en pipette.
    8. Inkuber 4 min.
    9. Med ~1 min igjen, pipette en 10 μL og en 20 μL dråpe UFo-løsning på et stykke ren laboratoriefilm.
    10. Bruk filterpapir til å transportere prøven fra kanten av rutenettet (vinkelrett kontakt) for å unngå kontakt med bildeoverflaten.
    11. Bruk pinsettene (fortsatt holder gitteret), plasser umiddelbart prøvesiden av rutenettet ned på 10 μL UFo-dråpene, og trekk deretter straks av væsken (vasketrinn). Det er viktig å ikke la nettet tørke, så ikke stopp mellom trinnene.
    12. På samme måte kan du bruke 20 μL UFo-dråpene på nettet. Hold nettet på UFo i 40 s. Wick væsken av og la nettet tørke.
    13. Bilde det tørre gitteret på 120 kV mellom 20.000x og 100.000x.
    14. Sørg for å kvitte seg med alle UFo-forurensede materialer ved hjelp av institusjonens sikkerhetstjeneste for radioaktivt avfall.
    15. Når det er nødvendig, kan lysstyrke/kontrastforbedring og et medianfilter brukes på TEM-bilder i ImageJ for å redusere bakgrunnsstøy. Etterbehandling bør gjøres jevnt, bare for bilder som ikke brukes til kvantitative målinger som intensitet, og bør alltid rapporteres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å illustrere karakteriseringsmetodene som er beskrevet ovenfor, viser vi typiske resultater for PCMer montert fra oligonucleotides og blokkerer kopolymerer av ulike lengder og kjemi (Figur 1). Figur 2 gir et eksempel på hvordan PCM-kjernestørrelse (som bestemt fra SAXS og TEM, figur 4 og figur 5)varierte med ladet blokklengde. Figur 3 viser DLS-data og tilpasningsresultater for sfæriske PCMer dannet fra relativt lange blokkkopolymerer og korte en-strandede oligonucleotides. Figur 4 illustrerer hvor kompleks SAXS intensitetsspektras kan passe nøyaktig ved å kombinere modeller for de mange romlige korrelasjonene som var tilstede (ekstern overflate, intrakjernespredning, inter-helix-bestilling), og hvordan MALS kan brukes til å utvide spredningsmålinger til lengre lengdeskalaer. Til slutt viser figur 5 representative elektronmikroskopidata for PCMer av varierende morfologi.

Figure 1
Figur 1: Montering og karakterisering av nukleinsyre-PCMer. (A) Anioniske polymerer, som oligonucleotides, dannet faseseparerte komplekser med kationiske regioner av diblock kopolymerer. Tilstedeværelsen av en hydrofil nøytral blokk (grå) resulterte i dannelse av stabile PCM nanopartikler. (B) PCMer var kjerneskall nanopartikler med flere parametere for å karakterisere. Den totale størrelsen (hydrodynamisk radius, Rh) kan bestemmes ved hjelp av DLS, kjerneradiusen (Rc)kan bli funnet ved hjelp av SAXS og TEM, kan corona størrelse beregnes som Rh-Rc,og morfologi kan bestemmes over flere lengdeskalaer ved å kombinere SAXS, MALS og TEM. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Micelle størrelse avhengighet. Micelle kjernestørrelse ble først og fremst bestemt av lengden på den ladede blokken av blokken kopolymer, og i stor grad uavhengig av lengden på homopolymer7,26. Dette gir kontroll over PCM-størrelse ved valg av blokkpolymer. Dataene som vises her er for pLys-PEG med 88 nt / bp DNA og har tidligere blitt rapportert26. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Dynamisk lysspredning. (A) Autokorrelasjonsfunksjon (vilkårlige enheter) for 10 nt enkelt-strandet DNA + pLys (100)-PEG (10k) PCM. (B) Hydrodynamisk radiusfordeling (histogrammet) fra REPES passer. Autokorrelasjonsfunksjonen forfalt til en flat verdi med en enkelt tidsskala, noe som resulterer i en topp i en enkelt størrelse i REPES-størrelsesfordelingen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Representative SAXS- og MALS-data og passer for en sylindrisk micelle. SAXS-data (grå sirkler) vises for PCMer montert fra pLys (50)-PEG (5k) og 88 bp dobbeltstrandet DNA. Ved lav q (< 10-2 Å-1)viste intensiteten en omtrent q-2 avhengighet av momentumoverføring, noe som innebærer en fleksibel sylinderform (ormlignende micelle). MALS-data (åpne svarte sirkler) viser den samme avhengigheten, noe som indikerer at micelles var minst flere mikrometer i lengde (bekreftet av TEM imaging, Figur 5C,D). Spheroidal micelles ville vise en flat avhengighet (q0) av intensitet på q i dette området. De fargede linjene illustrerer multikomponenttilpasningsprosedyren for PCM SAXS-data som er beskrevet i avsnitt 5. Spredning ved lav q (store avstandsskalaer) var dominert av den ytre overflaten av PCM, og passer godt av en fleksibel sylindermodell (rød). Ved høyere q-verdier (mindre lengdeskala) var spredning dominert av de enkelte polymerene inne i PCM-kjernen, som passer her av en kraftlov (grønn) med lav q cutoff. Vi observerte også parallell pakking av dobbeltstrandede DNA-helices i PCM-kjernen, noe som resulterte i en kvasi-Bragg diffraksjon topp (blå). Den svarte stiplede linjen viser at kombinasjonen av disse modellene nøyaktig beskrev SAXS-dataene, og tillegg av lysspredningsdata (åpne sirkler) utvidet størrelsesområdet over nesten fire størrelsesordener. Tilpasningsresultater ga en PCM-populasjon med gjennomsnittlig radius = 11,0 nm og PDI = 0,03, kraftlov ved høy q = 1,81 og diffraksjonstoppen representerer inter-helix avstand på 2,71 nm. SAXS-data er tidligere rapportert26 og er offentligtilgjengelige 44. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: TEM-bilder av nukleinsyre-PCMer. -B) Cryo TEM av 22 nt single-strandet DNA + pLys (50)-PEG (5k) PCMs, viser overveiende sfærisk morfologi. Blå piler indikerer væskeetandråper, må ikke forveksles med PCMs (teksturerte spheroidale objekter). (A) er litt underfokusert, og legger til liten kontrast samtidig som oppløsningen bevares. (B) er vesentlig underfokusert, og legger til mer kontrast, men ofrer klarhet. Justeringer av lysstyrke og kontrast og et medianfilter med to piksler ble brukt på begge bildene. -Jeg har ikke noe å si tildeg. Negative farget TEM på 88 bp dobbelt-strandet DNA + pLys (50)-PEG (5k) PCMs, som er lange fleksible sylindere. I begge tilfeller var kjerneradii fra TEM i samsvar med verdiene som ble hentet fra å montere SAXS-data. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som nevnt ovenfor er protokollene som presenteres her skrevet med fokus på oligonucleotides som polyanionkomponenten og pLys-PEG som kationisk nøytral blokkkopolymer, men vi har testet dem med en rekke polymerer, for eksempel poly(akrylsyre), polyglutamat og PEG-poly(vinylbenzyltritylammonium), og tror de generelt vil gjelde for de fleste polyelektrolytepar. En parameter som kanskje må optimaliseres er saltkonsentrasjonen som brukes til annealing, fordi den skal være høy nok til at PCM-er ikke dannes i begynnelsen av anneal. Dette kan kontrolleres eksperimentelt av DLS, eller sammenlignet med observasjon av faseseparasjon med polyelektrolytter alene (ingen nøytral blokk). Termisk annealing kan brukes hvis salt annealing er uønsket, selv om de resulterende polydispersities er større7. Konsentrasjonene som brukes til karakterisering må også optimaliseres, fordi større nanopartikler sprer seg mer lys enn små, og nukleinsyrer er mer effektive for å spre røntgenstråler enn mange andre polymerer på grunn av tilstedeværelsen av elektrontette fosforatomer i ryggraden. Det kan også være nødvendig å kontrollere pH-en til bufferen nærmere hvis enten polyelektrolytt har en pKa nær arbeidstilstanden.

I denne artikkelen presenterer vi protokoller for to lysspredningsteknikker (dvs. multi-vinkel / statisk lysspredning og dynamisk lysspredning), samt liten vinkel røntgenspredning, og både kryo og konvensjonell negativ flekkoverføring elektronmikroskopi, med representative data for hver. Ikke alle teknikker er nødvendige for alle scenarier, og andre er også tilgjengelige, og reiser spørsmålet som bør brukes når. Rikelig gjennomgang litteratur eksisterer om dette emnet45,46, men vi foreslår følgende når karakteriserer en ny PCM eller lignende nanopartikkel. Begynn med å se etter aggregering, både ved visuell inspeksjon for turbiditet og optisk mikroskopi. Hvis det ikke observeres aggregering, er neste trinn å avgjøre om det finnes nanopartikler. DLS er en rask måte å bestemme dette på fordi PCM sprer lys kraftig, og svak eller ikke-eksisterende lysspredning er en sterk indikator på dårlig nanopartikkeldannelse. Mens DLS kan bekrefte tilstedeværelsen av nanopartikler, er det vanskelig å bestemme deres størrelse og form uten referanse til andre data, da de fleste analysemetoder er avhengige av Stokes-Einstein-relasjonen, som antar sfæriske partikler. MALS kan bekrefte sfæriske former (flat normalisert intensitet vs. vinkel), men kan ikke være i stand til å bestemme formen på ikke-sfæriske partikler med mindre størrelsesfordelingen er både smal og skjer for å falle i riktig område for oppløsning. Som et resultat anbefaler vi at du utfører TEM, SAXS eller begge deler på en PCM-prøve for å fullt ut karakterisere egenskapene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Phil Griffin og Tera Lavoie fra soft matter-karakteriseringsanlegget og Advanced Electron Microscopy Facility, henholdsvis ved The University of Chicago. Vi takker også Xiaobing Zuo og Soenke Seifert fra Advanced Photon Source ved Argonne National Laboratory og NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) for støtte. Vi takker Jeff Ting og Michael Lueckheide for deres bidrag til dette arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spruijt, E., Westphal, A. H., Borst, J. W., Cohen Stuart, M. A., van der Gucht, J. Binodal compositions of polyelectrolyte complexes. Macromolecules. 43 (15), 6476-6484 (2010).
  2. van der Gucht, J., Spruijt, E., Lemmers, M., Cohen Stuart, M. A. Polyelectrolyte complexes: bulk phases and colloidal systems. Journal of Colloid and Interface Science. 361 (2), 407-422 (2011).
  3. Priftis, D., Laugel, N., Tirrell, M. Thermodynamic characterization of polypeptide complex coacervation. Langmuir. 28 (45), 15947-15957 (2012).
  4. Fu, J., Schlenoff, J. B. Driving Forces for Oppositely Charged Polyion Association in Aqueous Solutions: Enthalpic, Entropic, but Not Electrostatic. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 980-990 (2016).
  5. Vieregg, J. R., et al. Oligonucleotide-Peptide Complexes: Phase Control by Hybridization. Journal of the American Chemical Society. 140 (5), 1632-1638 (2018).
  6. Voets, I. K., de Keizer, A., Cohen Stuart, M. A. Complex coacervate core micelles. Advances in Colloid and Interface Science. 147-148, 300-318 (2009).
  7. Lueckheide, M., Vieregg, J. R., Bologna, A. J., Leon, L., Tirrell, M. V. Structure-Property Relationships of Oligonucleotide Polyelectrolyte Complex Micelles. Nano Letters. 18 (11), 7111-7117 (2018).
  8. De Kruif, C. G., Weinbreck, F., de Vries, R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 9 (5), 340-349 (2004).
  9. Vieregg, J. R., Tang, T. Y. D. Polynucleotides in cellular mimics: Coacervates and lipid vesicles. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 26, 50-57 (2016).
  10. Marciel, A. B., Chung, E. J., Brettmann, B. K., Leon, L. Bulk and nanoscale polypeptide based polyelectrolyte complexes. Advances in Colloid and Interface Science. 239, 187-198 (2017).
  11. Cabral, H., Miyata, K., Osada, K., Kataoka, K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications. Chemical Reviews. 118 (14), 6844-6892 (2018).
  12. Tan, Z., et al. Block Polymer Micelles Enable CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery: Physicochemical Properties Affect Packaging Mechanisms and Gene Editing Efficiency. Macromolecules. 52 (21), 8197-8206 (2019).
  13. Horn, J. M., Kapelner, R. A., Obermeyer, A. C. Macro- and Microphase Separated Protein-Polyelectrolyte Complexes: Design Parameters and Current Progress. Polymers. 11 (4), 578 (2019).
  14. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  15. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  16. Lorenzer, C., Dirin, M., Winkler, A. M., Baumann, V., Winkler, J. Going beyond the liver: progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release. 203, 1-15 (2015).
  17. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
  18. Li, W., Szoka, F. C. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharmaceutical Research. 24 (3), 438-449 (2007).
  19. Miyata, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2562-2574 (2012).
  20. Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile ss-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. Journal of the American Chemical Society. 127 (6), 1624-1625 (2005).
  21. Christie, R. J., et al. Targeted polymeric micelles for siRNA treatment of experimental cancer by intravenous injection. ACS Nano. 6 (6), 5174-5189 (2012).
  22. Kuo, C. H., et al. Inhibition of atherosclerosis-promoting microRNAs via targeted polyelectrolyte complex micelles. Journal of Materials Chemistry B. 2 (46), 8142-8153 (2014).
  23. Ge, Z., et al. Targeted gene delivery by polyplex micelles with crowded PEG palisade and cRGD moiety for systemic treatment of pancreatic tumors. Biomaterials. 35 (10), 3416-3426 (2014).
  24. Van Bruggen, C., Hexum, J. K., Tan, Z., Dalai, R. J., Reineke, T. M. Nonviral Gene Delivery with Cationic Glycopolymers. Accounts of Chemical Research. 52 (5), 1347-1358 (2019).
  25. Hayashi, K., et al. Influence of RNA Strand Rigidity on Polyion Complex Formation with Block Catiomers. Macromolecular Rapid Communications. 37 (6), 486-493 (2016).
  26. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Polyelectrolyte Complexation of Oligonucleotides by Charged Hydrophobic-Neutral Hydrophilic Block Copolymers. Polymers. 11 (1), 83 (2019).
  27. Phillips, H. R., et al. Glycopolycation-DNA Polyplex Formulation N/P Ratio Affects Stability, Hemocompatibility, and in Vivo Biodistribution. Biomacromolecules. 20 (4), 1530-1544 (2019).
  28. Ting, J. M., Wu, H., Herzog-Arbeitman, A., Srivastava, S., Tirrell, M. V. Synthesis and Assembly of Designer Styrenic Diblock Polyelectrolytes. ACS Macro Letters. 7 (6), 726-733 (2018).
  29. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  30. Santa Lucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1460-1465 (1998).
  31. Xia, T., et al. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs. Biochemistry. 37 (42), 14719-14735 (1998).
  32. Orthaber, D., Bergmann, A., Glatter, O. SAXS experiments on absolute scale with Kratky systems using water as a secondary standard. Journal of Applied Crystallography. 33 (2), 218-225 (2000).
  33. Srivastava, S., et al. Gel phase formation in dilute triblock copolyelectrolyte complexes. Nature Communications. 8, 14131 (2017).
  34. Lindhoud, S., et al. Salt-induced disintegration of lysozyme-containing polyelectrolyte complex micelles. Langmuir. 25 (19), 11425-11430 (2009).
  35. Lindhoud, S., de Vries, R., Schweins, R., Stuart, M. A. C., Norde, W. Salt-induced release of lipase from polyelectrolyte complex micelles. Soft Matter. 5 (1), 242-250 (2009).
  36. Ilavsky, J., Jemian, P. R. Irena: tool suite for modeling and analysis of small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 347-353 (2009).
  37. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  38. Jakeš, J. Regularized positive exponential sum (REPES) program-A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. Collection of Czechoslovak Chemical Communications. 60 (11), 1781-1797 (1995).
  39. Schillen, K., Brown, W., Johnsen, R. M. Micellar Sphere-to-Rod Transition in an Aqueous Triblock Copolymer System - a Dynamic Light-Scattering Study of Translational and Rotational Diffusion. Macromolecules. 27 (17), 4825-4832 (1994).
  40. Provencher, S. W. Contin - a General-Purpose Constrained Regularization Program for Inverting Noisy Linear Algebraic and Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 229-242 (1982).
  41. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method for Inverting Data Represented by Linear Algebraic or Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 213-227 (1982).
  42. Sarachan, K. L., Curtis, J. E., Krueger, S. Small-angle scattering contrast calculator for protein and nucleic acid complexes in solution. Journal of Applied Crystallography. 46 (6), 1889-1893 (2013).
  43. Beaucage, G. Approximations leading to a unified exponential power-law approach to small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 717-728 (1995).
  44. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Materials Data Facility. , 10.18126/M2QW8R (2018).
  45. Modena, M. M., Rühle, B., Burg, T. P., Wuttke, S. Nanoparticle Characterization: What to Measure. Advanced Materials. , (2019).
  46. Mourdikoudis, S., Pallares, R. M., Thanh, N. T. K. Characterization techniques for nanoparticles: comparison and complementarity upon studying nanoparticle properties. Nanoscale. 10 (27), 12871-12934 (2018).

Tags

Kjemi Utgave 157 nukleinsyrelevering polyelektrolytekompleks micelle nanopartikler faseseparasjon oligonucleotides
Montering og karakterisering av polyelektrolyttkompleks micelles
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marras, A. E., Vieregg, J. R.,… More

Marras, A. E., Vieregg, J. R., Tirrell, M. V. Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles. J. Vis. Exp. (157), e60894, doi:10.3791/60894 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter