Vi beskriver her en metode for vekst av Neisseria gonoré i metallbegrenset flytende medium for å lette uttrykket av gener for metallopptak. Vi skisserer også nedstrøms eksperimenter for å karakterisere fenotypen av gonokokker dyrket under disse forholdene. Disse metodene kan tilpasses for å være egnet for karakterisering av metallresponsive gener i andre bakterier.
Spormetaller som jern og sink er viktige næringsstoffer kjent for å spille sentrale roller i prokaryotiske prosesser, inkludert genregulering, katalysis og proteinstruktur. Metallsekvestrasjon av verter fører ofte til metallbegrensning for bakterien. Denne begrensningen induserer bakteriell genuttrykk hvis proteinprodukter tillater bakterier å overvinne sitt metallbegrensede miljø. Karakterisering av slike gener er utfordrende. Bakterier må dyrkes i omhyggelig forberedte medier som gir tilstrekkelig tilgang til ernæringsmessige metaller for å tillate bakteriell vekst samtidig som en metallprofil bidrar til å oppnå uttrykk for de nevnte genene. Som sådan må det etableres en delikat balanse for konsentrasjonene av disse metallene. Voksende en ernæringsmessig kresen organisme som Neisseria gonoré, som har utviklet seg til å overleve bare i den menneskelige verten, legger til et ekstra nivå av kompleksitet. Her beskriver vi utarbeidelsen av et definert metallbegrenset medium tilstrekkelig til å tillate gonokokkvekst og det ønskede genuttrykket. Denne metoden gjør det mulig for etterforskeren å chelate jern og sink fra uønskede kilder mens supplere media med definerte kilder til jern eller sink, hvis forberedelse er også beskrevet. Til slutt skisserer vi tre eksperimenter som bruker dette mediet for å karakterisere proteinproduktene til metallregulerte gonokokkgener.
Neisseria gonoré forårsaker den vanlige seksuelt overførbare infeksjonen gonoré. Under infeksjon uttrykker patogenne neisseria et repertoar av metallresponsive gener som gjør at bakteriene kan overvinne metallbegrensningsarbeidet til den menneskelige verten1,2,3. Spormetaller som jern og sink spiller sentrale roller i mange cellulære prosesser, for eksempel binding til enzymer i katalytiske steder, deltakelse i redoksreaksjoner og som strukturelle faktorer i ulike proteiner4,5. Under metallbegrensede forhold er metallresponsive loci derepressed og deres resulterende proteiner kan hjelpe oppkjøpet av disse næringsstoffene. Karakterisering av disse genene og proteinene presenterer en unik teknisk utfordring for etterforskeren. Metallioner må holdes tilbake fra bakterier for å indusere transkripsjon av disse genene fra deres innfødte loci, men effektiv chelation av disse ionene fra metallbelastede medier kan være vanskelig å optimalisere. De forskjellige metallprofiler av kildevann og iboende lot-to-lot variasjon6 av pulveriserte ingredienser betyr at mengden chelator som kreves for å fjerne et bestemt metall fra et rikt medium vil variere mellom ulike steder, ingrediensleverandører, og selv over tid i et enkelt laboratorium som kjemisk inventar erstattes.
For å omgå denne utfordringen beskriver vi utarbeidelsen av et definert medium som behandles med Chelex-100 harpiks under forberedelse for å fjerne spormetaller fra løsningen. Dette mediet er tilstrekkelig næringstett for å tillate vekst av gonokokker, noe som er vanskelig å kultur utenfor den menneskelige verten, og gjør det mulig for etterforskeren å innføre en bestemt metallprofil ved å legge til sine egne definerte kilder og konsentrasjoner av Metaller. Metoden for kontrollert add-back av ønskede metaller til utarmet medium øker eksperimentell konsistens og gir mulighet for robuste, replikerbare eksperimenter uavhengig av faktorer som vannkilde og kjemiske partitall. Videre kan dette mediet distribueres som enten en væske eller fast med bare mindre modifikasjoner, noe som gjør det ganske allsidig.
For å demonstrere nytten av dette mediet, skisserer vi en protokoll for bruk for gonokokkvekst og beskriver tre vellykkede eksperimenter for å karakterisere metallresponsive Neisseria gener. For det første forbereder vi gonokokkhelcellelysates fra metallutarmede eller supplerte kulturer og viser variable nivåer av proteinproduksjon fra metallresponsiv loci. Vi skisserer deretter en sinkbegrenset vekstanalyse der gonokokkvekst styres av tilskudd av spesifikke, brukbare sinkkilder. Til slutt viser vi bindende analyser som viser hele gonokokkceller som uttrykker metallresponsive overflatereseptorer som binder seg til sine respektive metallholdige ligander. Vellykket overflatepresentasjon av disse reseptorene krever vekst i metallutarmet medium.
Den nåværende protokollen ble optimalisert spesielt for Neisseria gonoré, men mange andre bakterielle patogener bruker metalloppkjøpsstrategier under infeksjon7, så denne protokollen kan tilpasses for studiet av metall homeostase hos andre bakterier. Optimalisering av disse mediene og disse eksperimentelle protokollene for bruk hos andre bakterier vil sannsynligvis kreve liten endring av metallchelatorkonsentrasjoner og/eller behandlingstid med Chelex-100, da andre bakterier kan ha litt forskjellige metallkrav enn gonokokker. Jern og sink er de primære metallene av bekymring for de beskrevne undersøkelsene, men andre metaller (f.eks. mangan) har blitt demonstrert som kritiske for bakterier, inkludert Neisseria8,9,10,11,12. Videre har lignende metoder blitt beskrevet for metallkarakteriseringer i eukatisk cellekulturarbeid, som også kan vurderes. 13.13 til 13
Vekstmedia tjener en rekke roller i mikrobiologisk forskning. Spesialiserte medier brukes til valg, berikelse og ulike andre bruksområder for mange unike typer studier. En slik applikasjon er induksjon av metallresponsive gener, som vanligvis oppnås ved tillegg av en bestemt chelator som retter seg mot en bestemt metallion. Denne metoden er begrenset, da mengden chelation som er nødvendig for ulike spormetaller, sannsynligvis vil være variabel på grunn av forskjellige vannkilder som inneholder unike metallprofiler, …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH-stipendene R01 AI125421, R01 AI127793 og U19 AI144182. Skriveforfatteren vil gjerne takke alle laboratoriemedlemmer som bidro til korrekturlesing og gjennomgang av denne metoden.
125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
Tris | VWR | 497 | Powder |
Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |