Summary
We beschrijven hier een methode voor de groei van Neisseria gonorroe in metaal-beperkte vloeibare medium om de expressie van genen voor metaalopname te vergemakkelijken. We schetsen ook downstream experimenten om het fenotype van gonokokken te karakteriseren die in deze omstandigheden worden geteeld. Deze methoden kunnen worden aangepast om geschikt te zijn voor karakterisering van metaal-responsieve genen in andere bacteriën.
Abstract
Sporenmetalen zoals ijzer en zink zijn essentiële voedingsstoffen waarvan bekend is dat ze een belangrijke rol spelen in prokaryotische processen, waaronder genregulatie, katalyse en eiwitstructuur. Metaalvastlegging door gastheren leidt vaak tot metaalbeperking voor de bacterie. Deze beperking veroorzaakt bacteriële genexpressie waarvan de eiwitproducten bacteriën in staat stellen om hun metaalbeperkte omgeving te overwinnen. Karakterisering van dergelijke genen is een uitdaging. Bacteriën moeten worden gekweekt in zorgvuldig voorbereide media die voldoende toegang tot voedingsmetalen mogelijk maakt om bacteriële groei mogelijk te maken met behoud van een metalen profiel dat bevorderlijk is voor het bereiken van expressie van de bovengenoemde genen. Daarom moet een delicaat evenwicht worden vastgesteld voor de concentraties van deze metalen. Het kweken van een nutritioneel veeleisend organisme zoals Neisseria gonorroe, dat is geëvolueerd om alleen te overleven in de menselijke gastheer, voegt een extra niveau van complexiteit. Hier beschrijven we de voorbereiding van een gedefinieerd metaal-beperkt medium voldoende om gonokokkengroei en de gewenste genexpressie mogelijk te maken. Deze methode stelt de onderzoeker in staat om ijzer en zink uit ongewenste bronnen te chelateen en tegelijkertijd de media aan te vullen met gedefinieerde bronnen van ijzer of zink, waarvan het preparaat ook wordt beschreven. Tot slot schetsen we drie experimenten die deze media gebruiken om de eiwitproducten van metaalgereguleerde gonokokkengenen te karakteriseren.
Introduction
Neisseria gonorroe veroorzaakt de gemeenschappelijke seksueel overdraagbare infectie gonorroe. Tijdens infectie, pathogene Neisseria uitdrukken een repertoire van metaal-responsieve genen die het mogelijk maken de bacteriën metaal beperking inspanningen te overwinnen door de menselijke gastheer1,2,3. Sporenmetalen zoals ijzer en zink spelen een belangrijke rol in veel cellulaire processen, zoals binding aan enzymen in katalytische plaatsen, deelname aan redox-reacties en als structurele factoren in verschillende eiwitten4,5. In metaalbeperkte omstandigheden worden metaalresponsieve loci onderdrukt en kunnen de resulterende eiwitten de aankoop van deze voedingsstoffen helpen. Karakterisering van deze genen en eiwitten vormt een unieke technische uitdaging voor de onderzoeker. Metaalionen moeten worden ingehouden van bacteriën om transcriptie van deze genen te induceren uit hun eigen loci, maar effectieve chelatie van deze ionen uit met metaal beladen media kan moeilijk te optimaliseren zijn. De verschillende metalen profielen van bronwater en inherente lot-to-lot variatie6 van poedervormige ingrediënten betekent dat de hoeveelheid chelator die nodig is om een specifiek metaal te verwijderen uit een rijk medium zal variëren tussen verschillende locaties, ingrediënten leveranciers, en zelfs na verloop van tijd binnen een enkel laboratorium als chemische inventaris wordt vervangen.
Om deze uitdaging te omzeilen, beschrijven we de voorbereiding van een gedefinieerd medium dat tijdens de voorbereiding wordt behandeld met Chelex-100 hars om sporenmetalen uit de oplossing te verwijderen. Dit medium is voldoende voedingsstof dicht om de groei van gonokokken mogelijk te maken, wat moeilijk te kweken is buiten de menselijke gastheer, en stelt de onderzoeker in staat om een specifiek metaalprofiel in te voeren door toevoeging van zijn eigen gedefinieerde bronnen en concentraties van Metalen. De methode van gecontroleerde add-back van gewenste metalen aan uitgeput medium verhoogt experimentele consistentie en zorgt voor robuuste, repliceerbare experimenten, ongeacht factoren zoals waterbron en chemische partij nummers. Bovendien kan deze media worden ingezet als een vloeistof of vaste stof met slechts kleine wijzigingen, waardoor het heel veelzijdig.
Om het nut van dit medium aan te tonen, schetsen we een protocol voor het gebruik ervan voor gonokokkengroei en beschrijven we drie succesvolle experimenten om metaalresponsieve Neisseria-genen te karakteriseren. Ten eerste bereiden we gonokokken hele cel lysaten uit metaal-uitgeput of aangevuld culturen en tonen variabele niveaus van eiwitproductie van metaal-responsieve loci. Vervolgens schetsen we een zink-beperkte groeitest waarbij de groei van gonokokken wordt gecontroleerd door suppletie van specifieke, bruikbare zinkbronnen. Ten slotte tonen we bindende testen die hele gonokokkencellen aantonen die metaalresponsieve oppervlaktereceptoren uitdrukken die bindend zijn voor hun respectieve metaalhoudende liganden. Succesvolle oppervlaktepresentatie van deze receptoren vereist groei in metaal-uitgeput medium.
Het huidige protocol is speciaal geoptimaliseerd voor Neisseria gonorroe, maar tal van andere bacteriële pathogenen maken gebruik van metaal verwerving strategieën tijdens infectie7,dus dit protocol kan worden aangepast voor de studie van metalen homeostase in andere bacteriën. Het optimaliseren van deze media en deze experimentele protocollen voor gebruik in andere bacteriën zal waarschijnlijk een lichte wijziging van de concentraties van metalen chelator en / of de behandeling tijd met Chelex-100, zoals andere bacteriën kunnen iets andere metaal eisen dan gonococcus. IJzer en zink zijn de primaire metalen die zich zorgen maken over de beschreven onderzoeken, maar andere metalen (bijvoorbeeld mangaan) zijn als kritiek voor bacteriën aangetoond, waaronder Neisseria8,9,10,11,12. Bovendien zijn soortgelijke methoden beschreven voor metaalkarakteriseringen in eukaryotische celkweekwerk, dat ook kan worden overwogen. 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van chelex-behandelde Defined Medium (CDM) Stock Solutions
- Voorraadoplossing I
- Combineer NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) en KH2PO4 (10,9 g) in gedeïoniseerd water tot een laatste volume van 1 L.
- Filter steriliseren van de oplossing en aliquot in 50 mL conische buizen.
- Bewaar bij -20 °C.
- Voorraadoplossing II
- Combineer thiamine HCl (0,2 g), thiamine pyrofosfaat-Cl (0,05 g), calciumpantothenaat (0,19 g) en biotine (0,3 g) in 50% (vol/vol) ethanol tot een eindvolume van 1 L.
- Aliquot in 50 mL conische buizen en op te slaan op -20 °C.
- Voorraadoplossing III
- Combineer L-aspartaat (4,0 g), L-glutamaat (10,4 g), L-arginine (1,2 g), glycine (0,2 g), L-serine (0,4 g), L-leucine (0,7 g 2 g), L-isoleucine (0,24 g), L-valine (0,48 g), L-tyrosine (0,56 g), L-proline (0,4 g), L-tryptofaan (0,64 g), L-threonine (0,4 g), L-fenylalanine (0,2 g), L-asparagine-H2O (0,2 g), L-glutamine (0,4 g), L-histidine-HCl (0,2 g), L-methionine (0,12 g), L-alanine (0,8 g), L-lysine (0,4 g) en verminderde glutathion (0,36 g) in 500 mL gedeïoniseerd water.
- Los L-cysteïne (0,44 g) en L-cystine (0,28 g) op in een minimaal volume (~1 mL) van 1 M HCl en voeg toe aan de bovenstaande aminozuuroplossing.
- Pas de pH van de oplossing aan met 10 N NaOH totdat alle deeltjes zijn opgelost. De laatste pH is 10.0–11.0.
- Breng het uiteindelijke volume naar 1 L met gedeïoniseerd water.
- Filter steriliseert de oplossing en aliquot in 250 mL volumes.
- Bewaar bij -20 °C.
- Voorraadoplossing IV
- Los glucose (200 g) op in gedeïoniseerd water tot een laatste volume van 1 L.
OPMERKING: De oplossing moet mogelijk worden verwarmd om de glucose op te lossen. - Filter steriliseren en aliquot de oplossing in 50 mL conische buizen.
- Bewaar bij -20 °C.
- Los glucose (200 g) op in gedeïoniseerd water tot een laatste volume van 1 L.
- Voorraadoplossing V
- Combineer hypoxanthine (5,0 g), uracil (5,0 g) en NaOH (4,0 g) in gedeïoniseerd water tot een laatste volume van 1 L.
- Filter steriliseren en aliquot in 50 mL conische buizen.
- Bewaar bij -20 °C.
- Oplossing VI
- Bereid een 1 M CaCl2-2H2O (147 g/L) oplossing in gedeïoniseerd water. Filter steriliseren en op te slaan bij kamertemperatuur (RT).
- Voorraadoplossing VII
- Bereid een 1 M anhydrous MgSO4 oplossing in gedeïoniseerd water. Filter steriliseren en op te slaan bij RT.
- Voorraadoplossing VIII
- Bereid een 1 M NaHCO3 oplossing in gedeïoniseerd water. Filter steriliseren en op te slaan bij RT.
2. Bereiding van 4x steriel concentraat en 1x CDM
OPMERKING: Deze procedure moet worden uitgevoerd in zuur behandeld steriel glaswerk of plastic om uitloging van metalen in de oplossingen te voorkomen.
- Combineer stockoplossingen I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL) en V (20 mL) met 20,0 g HEPES en roer om te mengen.
- Pas de pH aan op 7,4 en breng het uiteindelijke volume vervolgens op 500 mL met gedeïoniseerd water.
- Was Chelex-100 hars in 1 L gedeïoniseerd water om conserveringsmiddelen te verwijderen voordat het aan het 4x steriele concentraat wordt toegevoegd. Doe dit door 50 g hars toe te voegen aan 1 L gedeïoniseerd water en minstens 1 uur roeren. Verwijder het water door vacuümfiltratie en gebruik deze gewassen hars voor stap 2.4.
- Voeg 50 g hars toe en roer langzaam gedurende precies 90 min.
- Verwijder hars door filtersterilisatie en bewaar het 4x steriele concentraat op 4 °C.
- Om een 1x werkconcentratie CDM voor te bereiden, moet u eerst het 4x-concentraat verdunnen met steriel gedeïoniseerd water, voeg vervolgens oplossing VI (125 μL per 500 mL 1x oplossing), oplossing VII (535 μL per 500 mL) en oplossing VIII (10 mL per 500 mL) toe.
OPMERKING: Hoewel alle voorraadoplossingen al zijn gesteriliseerd, is het raadzaam om de 1x-oplossing na de voorbereiding opnieuw te steriliseren.
3. Bereiding van CDM-platen
LET OP: Het onderstaande recept maakt 1 L media voor platen, maar het is het beste om deze in kleinere volumes voor te bereiden. Alles schaalt proportioneel naar beneden.
- Gewassen agarose
- Los 50 g agarose op in 1 L gedeïoniseerd water, roerend gedurende 1 uur.
- Breng de oplossing over op een centrifugefles en centrifuge op 1.200 x g voor 15 min bij RT. Giet voorzichtig de supernatant af en gooi het weg.
- Voeg voldoende gedeïoniseerd water toe om de agarosepellet opnieuw op te schorten en breng vervolgens over naar een kolf van 1 L. Breng tot een laatste volume van 1 L met gedeïoniseerd water en roer en centrifugeer als in stap 3.1.2. Gooi de supernatant weg.
- Voeg voldoende 100% ethanol toe om de pellet opnieuw op te schorten en breng vervolgens over naar een nieuwe 1 L-kolf. Breng tot een laatste volume van 1 L met ethanol. Roer en centrifugeer zoals in stap 3.1.2.
- Herhaal stap 3.1.4.
- Voeg methanol toe aan de agarosepellet om opnieuw op te schorten en breng vervolgens over naar een 1 L-kolf. Breng tot een laatste volume van 1 L met methanol. Roer en centrifugeer zoals in stap 3.1.2.
- Herhaal stap 3.1.6.
- Breng gewassen agarose naar een lade bekleed met aluminiumfolie en laat drogen in een rookkap. Als het droog is, breng je over naar een metaalvrije container voor langdurige opslag.
- Voeg 10 g gewassen agarose en 5 g aardappelzetmeel toe aan 750 mL gedeïoniseerd water.
- Autoclave gedurende 30 min bij 121 °C, 100 kPa boven de atmosferische druk.
- Laat media afkoelen tot ~ 65 °C en voeg vervolgens 250 mL 4X CDM, 250 μL oplossing VI, 1,07 mL oplossing VII en 20 mL oplossing VIII toe.
- Voeg indien gewenst de metalen van keuze toe voordat u borden giet. De toevoeging van chelators is niet nodig om metaalvrije omstandigheden te handhaven.
- Giet in petrischaaltjes en laat stollen.
4. Metaal beperkte groei van Neisseria gonorroe
OPMERKING: Voor de meeste toepassingen is het niet nodig om de bacteriën te belasten voorafgaand aan inenting van CDM. De eerste verdubbelingsstap in CDM en de daaropvolgende verdunning is voldoende om de gonokokken van hun interne ijzer- en zinkvoorraden uit te putten. Als zodanig worden de eerste twee stappen van de volgende procedure uitgevoerd met behulp van agarplaten gemaakt van GC-gemiddelde basis die zijn aangevuld met Kellogg's supplement I14 en 12,5 μM Fe(NR3)3. Als vroege metaalspanning gewenst is, raden we aan gc-middenbasisplaten te bereiden zonder Fe(NR3)3 en met 5 μM TPEN (N,N,N',N'-tetrakis (2-pyridylmethyl) ethyleen) voor zinkchelatie of 10 μM deferoxamine voor ijzerchelatie. Alle incubatie wordt uitgevoerd bij 37 °C met 5% CO2.
- Twee dagen voor het experiment, op dag -2, streep gonokokken uit vriesvoorraden op GC medium platen en incubate voor niet meer dan 24 uur.
- Op dag -1, streep enkele kolonies op verse GC medium platen. Probeer dit te doen 14-16 uur voorafgaand aan het groeiexperiment.
- Voeg op de dag van het experiment 5-10 mL 1x CDM toe aan een zuur gewassen 125 mL verbijsterde zijarmkolf(supplementaal figuur 1)en gebruik dit om een Klett colorimeter leeg te maken.
- Gebruik een steriel, katoen-puntwattenstaafje om CDM te inenten uit gezonde, enkele kolonies. Streven naar 20 Klett eenheden.
OPMERKING: Als er geen Klett colorimeter beschikbaar is, is er ook een spectrofotometer geschikt. Er is geen universele conversieformule voor Klett-eenheden naar OD, maar er is een ruwe gids beschikbaar(https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales). - Incubeer met schudden bij 250 tpm tot ongeveer een massa verdubbeling (40 Klett eenheden). Dit duurt tussen 1-2 uur.
- Op dit punt, de culturen zijn terug verdund door toevoeging van een voldoende volume cdm om de helft van de oorspronkelijke cultuurdichtheid te bereiken (bijvoorbeeld, als 5 mL van de cultuur is gegaan van 20 tot 40 Klett eenheden, 15 mL van CDM zal brengen terug naar 10 Klett eenheden) en de groei zal blijven zoals in stap 4.5. De specifieke hoeveelheid rugverdunning, metaalbehandelingen, enz. Hieronder geven we drie voorbeelden (secties 5, 6 of 7).
5. Westerse analyse van metal responsive gene producten
- Vanaf stap 4.6 verdunt u de culturen terug met drie volumes CDM (bijvoorbeeld 15 mL CDM als u begint met 5 mL). Voeg op dit punt desgewenst metalen behandelingen toe.
- IJzergevoelige genen kunnen worden onderdrukt met 12,5 μM Fe(NR3)3. Zink-responsieve genen kunnen worden onderdrukt met 10 μM ZnSO4.
- Extra ijzer- of zinkstress is niet nodig, omdat de media al uitgeput zijn, zodat responsieve genen al worden uitgedrukt. Als verdere stress gewenst is, raden we niet meer dan 1-2 μM deferoxamine of TPEN aan, omdat overmatige stress zal voorkomen dat culturen groeien.
- Kweek culturen zoals in stap 4,5 voor 4 uur en neem de uiteindelijke celdichtheid van de monsters vast. Minder metaal-beklemtoonde culturen zullen uitgroeien tot hogere einddichtheid.
- Standaardiseren van culturen tot een geschikte dichtheid en bereid lysaten voor.
- Standaardiseren hele cel lysaten tot een dichtheid gelijk aan 100 Klett eenheden in 1 mL van de cultuur. Om dit te bereiken, verdeel 100 door de Klett-eenheidsdichtheid van uw monster. Het nummer dat je krijgt is het volume, in mL, van de cultuur die zal worden gebruikt om de cel pellet te maken.
- Volg standaard SDS-PAGE en Western blotting procedures15 te sonde voor eiwitten van belang.
6. Metaal-beperkte groeitests
LET OP: Deze tests beschrijven premade groei premixen. De bereiding van deze mixen wordt beschreven in punt 8.
- Tijdens de massaverdubbeling in stap 4.5, pretreat de putten van een 96 goed microplate met 10x premixes. Wees bovendien drie putten aan om als spaties te dienen. Voeg aan deze putten 10 μL van 10x premix en 90 μL CDM toe.
- Zodra de culturen in de zijarmkolven zijn verdubbeld, voegt u 100 μL van elke cultuur toe aan een ongebruikte put in de microplaat en meet u de optische dichtheid op 600 nm (OD600). Dit kan worden gedaan met cuvettes in een spectrofotometer, maar met grotere aantallen stammen binnen een test kan dit omslachtig worden en wordt over het algemeen niet geadviseerd, tenzij uw spectrofotometer direct kan meten vanaf de arm van de zijarmkolf(Aanvullende figuur 2).
- Plaats tijdens het meten van de OD de kolven terug in de couveuse om ervoor te zorgen dat de gonokokken levensvatbaar blijven.
- Bereken de juiste hoeveelheid verdunning die nodig is om de culturen naar OD600 = 0,02 te brengen. De 10x premixen hebben een verwaarloosbaar effect op OD en kunnen worden weggelaten uit berekening.
- Verdun culturen met CDM in kleine kweekbuizen en voeg voldoende volume toe om de 10x premixes te verdunnen tot 1x in de plaat. Als er een plaatwarmer beschikbaar is, houdt u de plaat tijdens het werken op 37 °C.
- Incubeer de plaat voor 8-12 uur met schudden in een plaatlezer, waarbij OD600 metingen met de gewenste intervallen.
7. Detectie van Ligand Binding door Outer Membrane Metal Transporters
- Behandel culturen zoals gewenst als in stap 5.1, dan uitbroeden met schudden voor 4 uur.
- Kort voor de 4 uur merk, snijd drie stukken filterpapier en een stuk nitrocellulose aan de geschatte grootte die nodig is om te passen in een dot blot apparaat (Aanvullende figuur 3). Presoak de nitrocellulose in gedeïoniseerd water, monteer het apparaat met filterpapier onder de nitrocellulose.
- Om 4 uur, opnemen van de cel dichtheden en standaardiseren tot een passende uiteindelijke dichtheid. Het wordt aanbevolen om ~ 10% van de dichtheid te gebruiken die wordt gebruikt voor de bereiding van de cellysaten in stap 5. Bijvoorbeeld, als het gebruik van 100 KU in 1 mL voor de lysaten, betekent dit ~ 10 KU in 1 mL voor deze vlekken. De berekening is anders hetzelfde als beschreven in punt 5.3.1, en culturen worden direct toegevoegd aan de nitrocellulose in de berekende volumes in plaats van gemaakt in lysaten.
- Pipetcelculturen op de nitrocellulose en geven voldoende tijd voor het filterpapier om alle vloeistof op te nemen.
- Demonteer het apparaat, laat de vlek drogen en blokkeer het nitrocellulosemembraan gedurende 1 h in 5% runderserumalbumine of vetvrije melk (w/v) in tris-gebufferde zoutoplossing.
- Monteer het dot blot-apparaat opnieuw en vervang het filterpapier door paraffinefolie om een lekbestendige afdichting onder de nitrocellulose te creëren.
- Verdun de metaalbindende ligand van belang tot 0,2 μM in blokker- en sondecellen gedurende 1 uur.
- Sifon van de vloeistof met een vacuüm, was de vlek, volg dan standaard immunologische procedures om het signaal te ontwikkelen16. De waspassen kunnen in of buiten het apparaat worden uitgevoerd.
8. Metaalbelasting van transferrin, S100A7 en Calprotectin, en bereiding van 10x Premixen
LET OP: Gebruik net als bij CDM-bereiding zuurgewassen glas of plastic voor de bereiding van de oplossing.
- Los menselijke transferrin op 10 mg/mL (125 μM) in de eerste buffer (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 8.4). S100A7 en calprotectine zijn opgehangen in buffer bestaande uit 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol en 1 mM CaCl2, pH = 8,0).
- Voeg ferratieoplossing (100 mM natriumcitraat, 100 mM NaHCO3, 5 mM FeCl3-6H2O, pH = 8,4) toe aan de transferrineoplossing om 30% ijzerverzadiging te bereiken (bijv. 75 μL ferratieoplossing is geschikt voor 5 mL transferrin indien gemaakt op 10 mg/mL).
- Voeg ZnSO4 aan S100A7 of calprotectin bij een verhouding van 50% molar aan het eiwit toe om 25% verzadiging te creëren (elk eiwitmolecule heeft twee metaal bindende plaatsen). Preparaten van 100 μM S100A7 of calprotectin met 50 μM ZnSO4 kunnen worden gebruikt.
- Voor beide gevallen u end-over-end mengen gedurende ten minste 1 uur voor het laden van metaal.
- Bereid 4 L dialysebuffer (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 7,4). Splits dit op in twee afzonderlijke 2 L volumes en plaats er een op 4 °C.
- Voeg de metaalgeladen eiwitten toe aan een dialysecassette met behulp van een spuit en dialyze tegen het eerste buffervolume gedurende 4 uur bij RT.
- Verplaats de cassette naar het tweede buffervolume en dialyze 's nachts bij 4 °C. Na deze stappen moeten niet-gebonden metalen worden verwijderd.
OPMERKING: Wij adviseren een bicinchonine zuurtest om eiwitconcentraties na dialyse te bepalen. - Gebruik een 10x transferrin premix voor transferrin gebruik als een enige ijzeren bron.
- Bereid deze premix voor door 30% menselijke Fe-transferrine en boviene apo-transferrin (bereid bij 125 μM zoals beschreven voor menselijke transferrin, zonder de ijzeren laadtrap) te verdunnen tot respectievelijk 75 μM en 30 μM in PBS. Een positieve controlepremix vervangt 30% Fe-transferrin door 75 μM Fe(NR3)3, en een negatieve controlepremix laat toegevoegd ijzer weg, waarbij alleen de boviene apo-transferrin wordt behouden. Verdun in de groeitest 10 μL van deze concentraten met 90 μL cultuur. De uiteindelijke concentraties zijn 7,5 μM 30% menselijke Fe-transferrine en 3 μM bovine apo-transferrin.
- Gebruik een aangepaste versie van de transferrin 10x premix voor S100A7 of calprotectingebruik als enige zinkbron.
- Neem voor een positieve controlepremix 50 μM ZnSO4 op in de transferrine premix. Neem voor een negatieve controle 50 μM TPEN op en laat het zink weg. Neem vervolgens 10 μL van elk van deze voor elk monster dat goed nodig is en verplaats dat volume naar een nieuwe buis. Voeg daarbij evenveel volume steriele PBS. Als 10 putten bijvoorbeeld de positieve controlepremix ontvangen, neem dan 100 μL premix, verplaats deze naar een nieuwe buis en voeg 50 μL PBS toe. Doe hetzelfde voor de negatieve controle.
- Om de S100A7 of calprotectin premix te maken, neem je 10 μL van de negatieve controlepremix per goed nodig, ga naar een nieuwe buis en voeg je de helft van dat volume van de 25% Zn-S100A7 of calprotectine toe. Gebruik in de groeitest 15 μL premix en verdun met 85 μL cultuur. De uiteindelijke concentraties voor de transferrinen blijven gelijk aan in stap 8.5, met een toegevoegde 5 μM Zn, TPEN of S100A7/calprotectine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een specifiek gedefinieerd medium bij afwezigheid van sporenmetalen voor de groei van Neisseria gonorroe werd ontwikkeld en geïmplementeerd voor de karakterisering van metaalresponsieve genen en hun genproducten. In het geoptimaliseerde protocol wordt het metalen profiel van de media gecontroleerd door metalen terug te voegen naar goeddunken van de onderzoeker, in plaats van door titreerende chelatie van een metalen doel, waardoor meer controle en consistentie van lab tot lab en experiment eer mogelijk is om te experimenteren. Deze media kunnen worden gebruikt in zowel vloeibare als vaste toestand, waardoor het veelzijdig is in veel experimentele opstellingen.
Differentiële eiwitproductie in variabele metaalconcentraties is te zien in de opgenomen representatieve westerse vlekken (figuur 1). Het beeld toont de zink-responsieve buitenste membraan transporters TdfJ en TdfH, die werden upregulated in reactie op zink chelatie door TPEN. TdfJ was in wezen niet op te sporen toen zink werd toegevoegd terug naar de media, en TdfH was schaars. Bovendien is bekend dat de promotor tdfJ eerder door ijzer wordt veroorzaakt dan onderdrukt. Dit is ook zichtbaar in de vlek. Deze vlekken gebruikten de ijzer-responsieve lipoprotein TbpB2 als een lading controle. In omstandigheden van ijzer add-back, TbpB productie werd verminderd.
Metaalbeperkte groeitests tonen het gebruik aan van specifieke, gedefinieerde zinkbronnen door de gonokokken (figuur 2). Figuur 2A toont n. gonorrhoeae groeit in aanwezigheid van zn-loaded calprotectin (CP), die de werking van de zink-responsieve TdfH17,18vereist . Toen er geen bruikbare zinkbron beschikbaar was, hetzij door geen zinkadd-back of door de afwezigheid van TdfH, werd de groei beperkt. Figuur 2B toont vergelijkbare resultaten in de aanwezigheid van S100A7, die kan dienen als enige zinkbron wanneer de buitenste membraantransporter TdfJ wordt geproduceerd19. In aanwezigheid van TPEN alleen of wanneer TdfJ afwezig was, werd de groei belemmerd, maar de toevoeging van Zn-S100A7 herstelde de groei op een TdfJ-afhankelijke manier. Ten slotte vertoont figuur 2C een experimentele fout. In dit voorbeeld was de verdunningsstap van de gonokokkenculturen niet voldoende om de bacteriën van interne zinkpoelen ten opzichte van het totale kweekvolume in de microplaat uit te putten. Als zodanig, groei in de negatieve controle overschreden de gewenste OD.
Specifieke binding van hele gonokokkencellen aan hun respectieve liganden wordt aangetoond door dot blots uit culturen bereid in metaalbeperkende en metaalreplete voorwaarden (figuur 3). Figuur 3A,B toont aan dat gonokokken die in CDM werden geteeld, CP en S100A7 konden binden bij de productie van respectievelijk TdfH en TdfJ als gevolg van zinkschaarste. Figuur 3C vergelijkt transferrinbinding, die wordt bereikt door de cognate eiwitten gemaakt van de ijzergevoelige genen tbpA en tbpB20, wanneer gonococci alleen in CDM worden geteeld vs. GC medium bouillon behandeld met de ijzerchelator deferoxamine. Dit cijfer toont een verhoogde binding van transferrin door culturen geteeld in CDM, wat wijst op hogere niveaus van eiwitexpressie als gevolg van de meer ijzer-uitgeput karakter van CDM in vergelijking met chelated GC bouillon.
Figuur 1: Representatieve westerse vlek met differentiële productie van metaalresponsieve eiwitten. (A) Neisseria gonorroe wilde stam FA19 werd geteeld in CDM aangevuld met ZnSO4, Fe(NR3)3, of TPEN in de aangegeven concentraties. Na de behandeling werden culturen 4 uur lang gekweekt voordat hele cellysates van gestandaardiseerde dichtheid werden geproduceerd en onderworpen aan SDS-PAGE en Western blotting. Differentiële productieniveaus voor TdfJ, die zowel door zink als door ijzer worden onderdrukt, zijn duidelijk te zien in reactie op toevoeging/uitputting van zink en toevoeging van ijzer. (B) Relatieve signaalintensiteiten voor de westerse vlek werden via densitometry gekwantificeerd. Dit cijfer is aangepast van Maurakis etal. 19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Zinkbeperkte groei van gonokokken. Wilde type stam FA19, of isogene mutanten van deze stam die geen tdfJ of tdfH produceren, werden geteeld in (A) onbehandelde CDM totdat de exponentiële fase werd bereikt, (B) dan terug verdund tot OD600 = 0,02 en (C) OD600 = 0,1. De monsters in A werden behandeld met premix met calprotectine (boven) of geen toegevoegd zink (bodem) en geteeld voor 8 uur. De monsters in B en C werden aangevuld met premix met vrij zink, geen zink (5 μM TPEN) of S100A7, en werden gedurende 6 uur gekweekt. De groei van deze omstandigheden werd alleen hersteld na suppletie van media met een bruikbare zinkbron, zoals CP, S100A7 of vrij zink in A en B, terwijl C niet voldoende werd verdund om interne cellulaire zinkpoelen uit te putten. Figuur 2A is aangepast van Jean et al.17Figuur 2B is aangepast van Maurakis etal. 19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Representatieve bindende tests tonen gastheer liganden binding aan metaal-beklemtoonde gonokokken. (A) Wilde soort stam FA1090, of mutanten van deze stam die geen tdfJ, tdfH, of beide produceren, werden geteeld in CDM zonder aanvullende metalen en werden gestippeld op nitrocellulose in gestandaardiseerde dichtheden. Cellen werden onderzocht met calprotectine, die wordt herkend door de zink-responsieve TdfH, en binding werd beoordeeld door detectie met een anti-calprotectine antilichaam (boven). Relatieve calprotectinbinding werd gekwantificeerd via densitometry, hier weergegeven op een logschaal (onder). (B) Er werden bindende experimenten uitgevoerd zoals beschreven in A,maar in plaats daarvan met behulp van de WILDE STAM fa19 en tdfJ mutant en aangevuldstammen op die achtergrond. Cellen werden onderzocht met HRP-gelabelde S100A7, die wordt herkend door de zink-responsieve TdfJ. (C) Wild type stam FA19 werd gekweekt side-by-side in CDM of GC medium bouillon met 25 μM deferoxamine toegevoegd aan chelaat vrij ijzer, gestippeld om nitrocellulose in gestandaardiseerde hoeveelheden, en onderzocht met transferrine, die de ijzergevoelige TbpA bindt. Deze side-by-side tests tonen aan dat CDM, in tegenstelling tot GC medium bouillon, geen extra chelatie nodig om een ijzer-beperkte omgeving te bereiken. Figuur 3A is aangepast van Jean et al. en de bodem van Maurakis etal. 19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Groeimedia vervullen verschillende rollen in microbiologisch onderzoek. Gespecialiseerde media worden gebruikt voor selectie, verrijking, en diverse andere toepassingen voor vele unieke soorten studie. Een dergelijke toepassing is de inductie van metaal-responsieve genen, die meestal wordt bereikt door toevoeging van een specifieke chelator die zich richt op een bepaalde metalen ion. Deze methode is beperkt, omdat de hoeveelheid chelatie die nodig is voor verschillende spoormetalen waarschijnlijk variabel zal zijn als gevolg van verschillende waterbronnen die unieke metalen profielen bevatten, en twee partijen van hetzelfde media-ingrediënt dat verschillende metaalconcentraties bevat6. Om deze inherente tekortkoming te voorkomen, hebben we de voorbereiding en het gebruik beschreven van een gedefinieerd medium dat wordt behandeld met Chelex-100 hars om alle spoormetalen in bulk te verwijderen, waardoor gecontroleerde toevoeging van gespecificeerde metalen zo nodig terug in het medium mogelijk is.
In het huidige protocol is het eerste belangrijke punt van discussie het bronwater. Het protocol beschrijft een Chelex-behandeling die voldoende is om metalen uit laboratoriumtype 2 (1,0 megaOhms-cm volgens ISO 3696-specificaties) water te verwijderen. Verschillende waterbronnen zullen waarschijnlijk kortere of langere Chelex-behandelingen vereisen. We hebben vastgesteld dat water van hogere zuiverheid dan type 2, zoals moleculaire biologie kwaliteit water, zal niet ondersteunen bacteriële groei in deze toepassing. De keuze van het schip voor de voorbereiding van de media is net zo belangrijk als de waterbron. Wij raden schone plastic containers ten zeerste aan, omdat glaswerk metaalionen in de oplossing kan uitlekken. Als er geen plasticwerk beschikbaar is, moet glaswerk zuur gewassen worden om besmettingsrisico's te minimaliseren. Hetzelfde zuur wassen is nodig voor kweekkolven bij het gebruik van CDM.
Groei van Neisseria gonorroe in een in vitro omgeving kan behoorlijk uitdagend zijn, omdat dit organisme zich heeft ontwikkeld om specifiek te gedijen in menselijke gastheren21. Hoewel CDM geschikt is om de groei te ondersteunen voor de duur van experimenten, moet er tijdens de inentings- en verdunningsmaatregelen worden gezorgd om ervoor te zorgen dat gonokokken niet langer in atmosferische omstandigheden verkeren dan nodig is. Vanwege het capnophilic karakter van gonococci22 en de voorliefde voor temperaturen gevonden in menselijke gastheren, raden we niet aan culturen langer dan ~ 15 min in atmosferische omstandigheden te houden. Als de in stap 4.5 van de methode beschreven eerste massaverdubbelingsgebeurtenis langer duurt dan 2 uur, is het waarschijnlijk dat gonokokkenculturen niet goed zijn behandeld en het experiment moet worden afgebroken.
Hoewel de focus van deze methode ligt op methoden voor groei en karakterisering van Neisseria gonorroe specifiek, is het gebruik van dit specifieke CDM waarschijnlijk ook geschikt voor studie van andere Neisseria-soorten. Bovendien kan het gemakkelijk worden toegepast op de karakterisering van andere metaalgevoelige systemen in andere bacteriën. Zo is een soortgelijke metaalvrije media gebruikt om de metaalopname in Staphylococcus aureus23 en Escherichia coli24te karakteriseren. Het gebruik van het beschreven recept voor andere bacteriën zal waarschijnlijk kleine wijzigingen of toevoegingen met zich meebrengen, afhankelijk van de specifieke voedingsbehoeften van de bacteriën in kwestie. Supplement VIII is bijvoorbeeld opgenomen in het recept om te helpen met de behoefte van de gonococcus aan aanvullende CO2. Zoals hierboven beschreven, wordt de groei uitgevoerd bij 37 °C met een 5% CO 2-atmosfeer, maar we hebben vastgesteld dat toevoeging van aanvullend bicarbonaat in de media de eerste stadia van gonokokkengroei in gedefinieerd medium helpt. Voor organismen zonder een dergelijke eis kan dit ingrediënt worden weggelaten. Helaas moeten verdere voorbeelden van deze wijzigingen empirisch worden bepaald.
Ondanks de noodzaak om de methode enigszins aan te passen voor gebruik met andere bacteriën, moet het basiskader geschikt zijn voor breed gebruik. Karakterisering van metaal-responsieve genen en metaalvervoerders is een voortdurende inspanning in microbiële studie, met bacteriën waaronder Neisseria meningitidis18,25,26,27,28, S. aureus9, Haemophilus influenzae29, Salmonella enterica30, en E. coli31 alle aandacht ontvangen in deze niche. Onze eigen toekomstige gebruik van deze techniek zal gericht zijn op het bevorderen van het begrip van andere gonokokken metaal opname systemen dan die reeds vermeld, die het mogelijk maken de gonococcus om ijzer te verwerven uit gastheer eiwitten zoals lactoferrine32,33, hemoglobine34,35, en ook van bacteriële xenosiderophores36, en om onze studies uit te breiden naar de effecten van andere metalen zoals manganese, die is betrokken bij oxidatieve stress verdediging door Neisseria12,37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01 AI125421, R01 AI127793 en U19 AI144182. De schriftelijke auteur wil alle lableden bedanken die hebben bijgedragen aan het proeflezen en beoordelen van deze methode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
References
- Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
- Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
- Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
- Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
- Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
- Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
- Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
- Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
- Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
- Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
- Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
- Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
- Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
- Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
- Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
- Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
- Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
- Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
- Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
- Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
- Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
- Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
- Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
- Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
- Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
- Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
- Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
- Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
- Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
- Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
- Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).
