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Immunology and Infection

内塞里亚淋病的金属有限生长，用于金属反应基因特征和从宿主配体中获取金属

Published: March 4, 2020 doi: 10.3791/60903
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Biomedical Sciences, Georgia State University

Summary

我们在这里描述了一种在金属受限液体介质中生长淋病的方法，以促进金属吸走基因的表达。我们还概述了下游实验，以表征在这些条件下生长的淋球菌的表型。这些方法可以适应其他细菌中金属反应基因的表征。

Abstract

微量金属，如铁和锌，是已知在原核过程（包括基因调控、催化和蛋白质结构）中起关键作用的重要营养物质。主机的金属封存通常会导致细菌的金属限制。这种限制诱导细菌基因表达，其蛋白质产品允许细菌克服其金属有限的环境。这种基因的特性具有挑战性。细菌必须在精心准备的培养基培养中生长，使营养金属能够充分获得，从而允许细菌生长，同时保持有利于表达上述基因的金属轮廓。因此，必须为这些金属的浓度建立微妙的平衡。生长一种营养挑剔的有机体，如奈瑟里亚淋病，这种有机体进化到只在人类宿主中生存，增加了一层复杂性。在这里，我们描述了一种定义的金属有限介质的制备，该介质足以允许淋球菌生长和所需的基因表达。这种方法允许调查员从不需要的来源中分离铁和锌，同时用定义的铁或锌来源补充介质，其制备也描述。最后，我们概述了利用这种介质帮助描述金属调节性淋球菌基因的蛋白质产物的三个实验。

Introduction

淋病导致常见的性传播感染淋病。在感染期间，致病性Neisseria表达一系列金属反应基因，使细菌能够克服人类宿主1、2、3的金属限制。铁和锌等微量金属在许多细胞过程中起着关键作用，如与催化位点的酶结合、参与氧化还原反应以及各种蛋白质4、5的结构因素。在金属有限条件下，金属反应位位被压减，其产生的蛋白质可以帮助获得这些营养物质。这些基因和蛋白质的特性对研究者来说是一个独特的技术挑战。金属离子必须从细菌中预扣，才能诱导这些基因从原生位点转录，但是这些离子从含金属介质中的有效结合可能难以优化。源水的不同金属轮廓和粉末成分固有的批次到批次变化6意味着从富介质中去除特定金属所需的夹子数量会因不同位置、成分供应商而异，甚至在更换化学品库存时，在单个实验室中随时间而变化。

为了规避这一挑战，我们描述了在制备过程中用Chelex-100树脂处理的已定义介质的制备，以去除溶液中的微量金属。这种介质营养密集，允许淋巴球菌的生长，这种生长在人类宿主之外很难培养，并且允许调查员通过添加自己定义的来源和浓度来引入特定的金属轮廓。金属。将所需金属控制添加到耗尽介质的方法提高了实验的一致性，并允许进行可靠、可复制的实验，而不考虑水源和化学批次数等因素。此外，这种介质可以部署为液体或固体，只需稍作修改，使其相当通用。

为了证明这种介质的效用，我们概述了用于淋球菌生长的协议，并描述了三个成功的实验来描述金属反应性奈塞利亚基因。首先，我们从金属耗尽或补充培养物制备淋球菌全细胞解结物，并展示来自金属响应位点的蛋白质生产水平。然后，我们概述锌限制生长测定，其中淋球菌生长通过补充特定的，可使用的锌源控制。最后，我们展示了结合测定，证明整个淋球细胞表达金属反应性表面受体结合到各自的含金属配体。这些受体的成功表面呈现需要金属耗尽介质的生长。

本方案是专门针对淋病的，但许多其他细菌病原体在感染7期间采用金属采集策略，因此该协议可以适用于研究其他细菌的金属平衡。优化此介质和用于其他细菌的这些实验方案可能需要对 Chelex-100 的金属包合剂浓度和/或处理时间进行轻微修改，因为其他细菌的金属要求可能与淋球菌略有不同。铁和锌是上述调查关注的主要金属，但其他金属（如锰）已被证明对细菌至关重要，包括Neisseria8、9、10、11、12。此外，还描述了真核细胞培养工作中金属表征的类似方法，也可以考虑。13

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Protocol

1. Chelex 处理的定介质 （CDM） 库存解决方案的制备

  1. 库存解决方案 I
    1. 将 NaCl （233.8 g）、K2SO4 （40.0 g）、NH4Cl （8.8 g）、K2HPO4 （13.9 g） 和 KH2PO4 （10.9 g） 结合到去离子水中，最终体积为 1 L。
    2. 过滤溶液消毒，并等分成50 mL锥形管。
    3. 储存在-20°C。
  2. 库存解决方案 2
    1. 将硫胺 HCl （0.2 g）、硫胺热磷酸-Cl （0.05 g）、泛酸钙 （0.19 g） 和生物素 （0.3 g） 结合到 50% （vol/vol） 乙醇中，最终体积为 1 L。
    2. 与50 mL 锥形管中的异位，储存在 -20°C。
  3. 库存解决方案 III
    1. 结合 L-阿斯巴酯 （4.0 g）、L-谷氨酸 （10.4 g）、L-精氨酸 （1.2 g）、甘氨酸 （0.2 g）、L-丝氨酸 （0.4 g）、L-亮氨酸 （0.72 g）、L-isoleuin （0.24 g）、L-valine （0.48 g）、L-酪氨酸 （0.56 g）、L-proline （0.4 g）、L-色氨酸 （0.64 g）、L-- 三氯胺（0.4克）、L-苯丙氨酸（0.2克）、L-芦笋-H2O（0.2 g）、L-谷氨酰胺（0.4克）、L-硫氨酸-HCl（0.2克） ）、L-蛋氨酸（0.12克）、L-丙氨酸（0.8克）、L-利氨酸（0.4克）和500 mL去离子水中的谷胱甘肽（0.36克）。
    2. 将L-半胱氨酸（0.44克）和L-半胱氨酸（0.28克）溶解在1 M HCl的最小体积（±1 mL）中，并加入上述氨基酸溶液。
    3. 使用 10 N NaOH 调节溶液的 pH，直到所有颗粒溶解。最终的pH为10.0~11.0。
    4. 使用去离子水将最终体积调至 1 L。
    5. 过滤溶液消毒，并分量至250 mL体积。
    6. 储存在-20°C。
  4. 库存解决方案 IV
    1. 将葡萄糖（200克）溶解在去离子水中，最终体积为1升。
      注：溶液可能需要加热以溶解葡萄糖。
    2. 过滤灭菌，并将溶液与50 mL锥形管等分。
    3. 储存在-20°C。
  5. 库存解决方案 V
    1. 将低氧二元（5.0克）、尿素（5.0克）和NaOH（4.0克）结合在去离子水中，最终体积为1升。
    2. 将消毒和等分过滤成50 mL锥形管。
    3. 储存在-20°C。
  6. 解决方案六
    1. 在去离子水中制备 1M CaCl2-2H2O （147 g/L） 溶液。过滤器在室温 （RT） 下消毒和储存。
  7. 库存解决方案 VII
    1. 在去离子水中制备1M无水MgSO4溶液。过滤器消毒并储存在RT。
  8. 库存解决方案八
    1. 在去离子水中制备 1M NaHCO3溶液。过滤器消毒并储存在RT。

2. 制备4x无菌浓缩物和1倍CDM

注：此程序应在酸处理无菌玻璃器皿或塑料中执行，以防止金属渗入溶液中。

  1. 将库存溶液 I （50 mL）、II （20 mL）、III （250 mL）、IV （50 mL） 和 V （20 mL） 与 20.0 g 的 HEPES 混合。
  2. 将 pH 调节到 7.4，然后用去离子水将最终体积调至 500 mL。
  3. 在 1 L 去离子水中清洗 Chelex-100 树脂，在将其添加到 4x 无菌浓缩物之前去除防腐剂。为此，在 1 L 去离子水中加入 50 克树脂，搅拌至少 1 小时。通过真空过滤去除水，并将此洗涤树脂用于步骤 2.4。
  4. 加入50克树脂，慢慢搅拌90分钟。
  5. 通过过滤灭菌去除树脂，并将4x无菌浓缩物储存在4°C。
  6. 要制备CDM工作浓度为1倍，首先用无菌去离子水稀释4x浓缩物，然后加入溶液VI（每500 mL1x溶液125 μL）、溶液VII（每500mL535μL）和溶液VIII（每500mL10mL）。
    注：尽管所有库存溶液均已灭菌，但建议在制备后再次过滤灭菌1x溶液。

3. CDM板的制备

注： 下面的配方为板制作 1 L 介质，但最好以较小的体积准备这些介质。一切都按比例缩小。

  1. 洗过的阿加罗斯
    1. 将50克甘蔗在1L去离子水中溶解，搅拌1小时。
    2. 将溶液转移到离心瓶和离心机在1，200 x g下15分钟，在RT.小心地倒出上清液并丢弃。
    3. 加入足够的去离子水，以重新悬浮甘蔗颗粒，然后转移到1L烧瓶。将去离子水的最终体积引入 1 L，然后搅拌和离心机，如步骤 3.1.2 中。丢弃上清液。
    4. 加入足够的100%乙醇来重新悬浮颗粒，然后转移到新的1L烧瓶。用乙醇将最终体积为 1 L。搅拌和离心机，如步骤 3.1.2 中。
    5. 重复步骤 3.1.4。
    6. 将甲醇加入甘蔗颗粒以重新悬浮，然后转移到1L烧瓶中。用甲醇将最终体积为 1 L。搅拌和离心机，如步骤 3.1.2 中。
    7. 重复步骤 3.1.6。
    8. 将洗过的甘蔗转移到装有铝箔的托盘上，并在烟气罩中干燥。干燥时，转移到无金属容器进行长期存放。
  2. 将10克洗过的甘蔗和5克马铃薯淀粉加入750 mL的去离子水中。
  3. 高压灭菌器在121°C下工作30分钟，高于大气压100kPa。
  4. 让介质冷却至+65°C，然后加入250 mL的4X CDM、250 μL溶液VI、1.07 mL溶液VII和20 mL溶液VIII。
  5. 如果需要，在浇注板之前添加所选择的金属。无需添加包合器以保持无金属条件。
  6. 倒入培养皿，并允许凝固。

4.内塞利亚淋病的金属生长有限

注：对于大多数应用，在接种CDM之前，无需对细菌进行金属应力。CDM 的初始翻倍步骤和随后的稀释足以耗尽其内部铁和锌储存的淋球菌。因此，以下程序的前两个步骤使用由GC介质底座制成的琼脂板进行，这些板已辅以凯洛格的补品I14和12.5 μM Fe（NO3）3。如果需要早期金属应力，我们建议制备不含铁（NO3）3和 5 μM TPEN（N、N、N'、N'-四聚氰胺（2-pyridy甲基）乙烯二胺的 GC 介质基板，用于锌合合或 10 μM 递延氧胺用于铁合化。所有孵育在37°C下进行，CO2为5%。

  1. 实验前两天，第2天，从冷冻库存到GC介质板上的连续淋球菌，孵育不超过24小时。
  2. 第-1天，将单菌群连胜到新鲜的GC介质板上。在生长实验之前，尝试这样做14~16小时。
  3. 在实验当天，将5~10 mL 1x CDM添加到酸洗的125 mL迷糊侧臂烧瓶中（补充图1），并用它来将Klett色度计填空。
  4. 使用无菌棉签拭子从健康的单一菌落中接种CDM。瞄准20克莱特单位。
    注：如果 Klett 色度计不可用，则也适合分光光度计。Klett 单位没有通用转换为 OD 的公式，但提供了粗略的指南（https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales）。
  5. 以 250 rpm 的转速孵育，直到大约一个质量翻倍（40 Klett 单位）。这大约需要 1 到 2 小时。
  6. 此时，通过添加足够的 CDM 量，达到初始培养密度的一半（例如，如果 5 mL 的培养从 20 Klett 单位增加到 40 Klett 单位，15 mL 的 CDM 将使其降至 10 Klett 单位），并且增长将继续如第 4.5 步中的那样。背部稀释、金属处理等的具体量取决于下游应用。下面给出了三个示例（第 5、6 或 7 节）。

5. 金属反应基因产品的西方分析

  1. 从步骤 4.6 开始，用三卷 CDM（例如，从 5 mL 开始）冲淡培养物（例如，CDM 的 15 mL）。此时，如果需要，添加金属处理。
    1. 铁感应基因可以通过12.5 μM Fe（NO3）3进行解压。锌反应基因可能被10μMZnSO4压榨。
    2. 额外的铁或锌应力是没有必要的，因为介质已经耗尽，所以反应基因已经表达。如果需要进一步的压力，我们建议不超过1⁄2 μM的递生胺或TPEN，因为过度压力会阻止培养物的生长。
  2. 在步骤 4.5 中生长培养物 4 小时，并记录样本的最终细胞密度。金属应力较低的培养物将增长到更高的最终密度。
  3. 将培养物标准化到适当的密度并制备莱萨。
    1. 在 1 mL 的培养值中，将全细胞分量标准化为相当于 100 Klett 单位的密度。为此，请将 100 除以样品的 Klett 单位密度。你得到的数字是用于制造细胞颗粒的培养的体积（以 mL）。
  4. 遵循标准SDS-PAGE和西方印迹程序15，以探测感兴趣的蛋白质。

6. 金属有限生长测定

注：这些测定说明预熟的生长预混料。第 8 节描述了这些混合料的制备。

  1. 在步骤 4.5 中质量倍增期间，用 10 倍预混料预处理 96 孔微孔板的井。此外，指定三口井作为空白。在这些井中，添加 10 μL 的 10x 预混合和 90 μL 的 CDM。
  2. 一旦侧臂烧瓶中的培养物翻倍，将每个培养物的 100 μL 添加到微孔中未使用的孔中，并在 600 nm （OD600） 处测量光学密度。这可以通过分光光度计的比色皿来完成，但在测定中菌株数量较多，这可能变得很麻烦，除非分光光度计可以直接从侧臂烧瓶的手臂进行测量，否则通常不建议这样做（补充图2）。
    1. 测量 OD 时，将烧瓶放回培养箱中，以确保淋球菌保持活力。
  3. 计算将培养物带到 OD600 = 0.02 所需的正确稀释量。10x 预混料对 OD 的影响可以忽略不计，可以从计算中省略。
  4. 用CDM在小培养管中稀释培养物，并添加足够的体积，将10倍预混料稀释至板中的1倍。如果有板加热器可用，则在工作时将板保持在 37°C。
  5. 在板片读取器中摇动，孵育板 8~12 小时，以所需的间隔进行 OD600测量。

7. 外膜金属运输机对利带结合的检测

  1. 按照步骤 5.1 中所需的处理培养物，然后用摇动孵育 4 小时。
  2. 在 4 小时标记前不久，将三块滤纸和一块硝化纤维素切成适合点印装置所需的近似大小（补充图 3）。将硝基纤维素预吸到脱离子水中，然后用硝基纤维素下面的滤纸组装设备。
  3. 在 4 小时时，记录细胞密度并标准化到适当的最终密度。建议使用步骤 5 中用于制备细胞内分量的密度的 ±10%。例如，如果在 1 mL 中使用 100 KU 来用于莱沙，这意味着这些血隙在 1 mL 中为 10 KU。计算方式与 5.3.1 中所述相同，区域性直接添加到计算体积中的硝基纤维素中，而不是制成掉糖。
  4. 移管细胞培养到硝基纤维素上，让过滤纸有足够的时间吸收所有液体。
  5. 拆解设备，让斑点干燥，并在5%牛血清白蛋白或脱脂牛奶（w/v）中，在Tris缓冲盐水中将硝化纤维素膜块1小时。
  6. 重新组装点印片装置，用石蜡薄膜替换滤纸，在硝基纤维素下形成防漏密封。
  7. 将感兴趣的金属结合配体稀释至阻滞剂和探针单元中的0.2 μM，1小时。
  8. 用真空吸出液体，洗掉斑点，然后按照标准的免疫学程序开发信号16。清洗步骤可在设备内或外进行。

8. 转移剂、S100A7 和卡护素的金属装载，以及 10x 预混料的准备

注：与 CDM 制备一样，使用酸洗玻璃或塑料进行溶液制备。

  1. 在初始缓冲液（100 mM Tris，150 mM NaCl，20 mM NaHCO3，pH = 8.4）中以10mg/mL（125 μM）溶解人体转移素。S100A7 和卡保护素悬浮在缓冲液中，包括 20 mM Tris、100 mM NaCl、10 mM 2-Mercaptoto 乙醇和 1 mM CaCl2，pH = 8.0）。
    1. 在转因溶液中加入铁化溶液（100mM柠酸钠，100 mM NaHCO3，5 mM FeCl3-6H2O，pH = 8.4），以实现30%的铁饱和度（例如，75 μL的铁化溶液适用于5 mL转因，如果以10mg/mL制成）。
    2. 将 ZnSO4添加到 S100A7 或卡护林，以 50% 的摩尔比与蛋白质形成 25% 的饱和度（每个蛋白质分子有两个金属结合位点）。可使用 100 μM S100A7 或带 50 μM ZnSO4的护套。
    3. 对于这两种情况，对于金属装载，允许端对端混合至少 1 小时。
  2. 准备4 L透析缓冲液（40 mM Tris，150 mM NaCl，20 mM NaHCO3，pH = 7.4）。将此卷拆分为两个单独的 2 L 卷，并将一个卷放在 4°C。
  3. 使用注射器将金属加载的蛋白质添加到透析盒中，并在 RT 时对第一个缓冲液体积进行 4 小时透析。
  4. 将盒式磁带移到第二个缓冲液体积，并在 4°C 下进行通宵透析。在这些步骤之后，应去除任何未绑定的金属。
    注：我们建议在透析后进行双辛辛酸测定，以确定蛋白质浓度。
  5. 使用 10 倍转移素预混合剂作为唯一铁源进行转移素利用。
    1. 在PBS中分别将30%的人类Fe转移素和牛转移素（在125μM下制备，用于人体转移素，无铁载荷步骤）至75μM和30μM，制备此预混料。正控制预混料将 30% 的 Fe 转移素替换为 75 μM Fe（NO3）3，负控制预混合省略任何添加的铁，仅保留牛 apo-转移素。在生长测定中，用90μL的培养物稀释10μL。最终浓度为7.5 μM 30%人铁转移素和3μM牛apo-转移素。
  6. 使用改进版的转移素 10x 预混合 S100A7 或卡保护素利用率作为唯一锌源。
    1. 对于正控制预混合，将 50 μM ZnSO4加入转移剂预混合。对于负控制，合并 50 μM TPEN 并省略锌。然后，为每个需要的样品取10μL，并将该体积移至新管中。加上这一半无菌PBS的体积。例如，如果 10 口井将收到正控制预混合，则取 100 μL 的预混合，将其移动到新管中，并添加 50 μL 的 PBS。对负控制执行相同的操作。
    2. 要制作 S100A7 或卡护林预混料，请按所需的负控制预混合量 10 μL，移动到新管中，并添加 25% Zn-S100A7 或卡护林的一半体积。在生长测定中，使用15μL的预混合，用85μL的培养剂稀释。转移剂的最终浓度与步骤 8.5 中相同，添加 5 μM 的 Zn、TPEN 或 S100A7/卡保护。

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Representative Results

在没有微量金属的情况下，开发和实施了一种用于对金属反应基因及其基因产物进行表征的特异性介质。在优化的协议中，介质的金属轮廓通过由调查人员酌情添加金属来控制，而不是通过金属目标的定位夹层来控制，从而增加了实验室到实验室的控制和一致性，并进行了实验实验。这种介质可用于液体和固态，使其在许多实验设置中具有通用性。

可变金属浓度的差分蛋白生产可在包括的具有代表性的西方血斑中看到（图1）。图为TdfJ和TdfH的锌反应外膜运输机，它们因TPEN的锌结合而得到调节。当锌被添加回介质时，TdfJ基本上无法检测，而TdfH是稀缺的。此外，tdfJ促进器已知是由铁诱导，而不是压制。这在污点中也可见。这些污点利用铁反应脂蛋白TbpB2作为载荷控制。在铁的添加条件下，TbpB产量减少。

金属限制生长测定表明，淋球菌对特定、定义的锌源的利用（图2）。图2A显示，在存在锌加载的卡护林（CP）的情况下生长的淋病，这需要反应锌的TdfH17、18的作用。如果没有可用的锌源，无论是通过锌添加或没有TdfH，增长受到限制。图2B显示了S100A7存在的类似结果，当外膜运输机TdfJ生产19时，S100A7可以作为唯一的锌源。单独在TPEN或TdfJ缺席的情况下，增长受到阻碍，但Zn-S100A7的加入以依赖TdfJ的方式恢复了增长。最后，图2C显示了一个实验误差。在此示例中，淋球菌培养物的稀释步骤不足以消耗内部锌池相对于微孔板总培养量的细菌。因此，负控制的增长超过了所需的 OD。

在金属限制和金属充分条件下制备的点印迹证明了整个淋球细胞与各自配体的具体结合（图3）。图3A、B显示，由于锌稀缺，CDM中生长的淋球菌在生产TdfH和TdfJ时能够分别结合CP和S100A7。图3C比较转移蛋白结合，这是由铁感应基因tbpA和tbpB20制成的共和蛋白，当淋球菌单独在CDM中生长，而GC介质溴用铁夹子递化二甲胺处理。这一数字显示，在清洁发展机制中生长的培养物对转移蛋白的结合增加，这表明由于CDM的铁耗度比合合GC肉汤更铁消耗，这表明蛋白质表达水平更高。

Figure 1
图1：代表的西方斑点，显示金属反应蛋白的差别化生产。（A）奈瑟里亚淋病野生型FA19在CDM中生长，辅以ZnSO 4、Fe（NO3）3或TPEN在指示浓度中。治疗后，培养物生长4小时，然后产生标准化密度的全细胞分量，并接受SDS-PAGE和西印。TdfJ 的差别生产水平被锌抑制，由铁诱导，在锌添加/消耗和铁的添加下可以清楚地看到。（B） 西方斑点的相对信号强度是通过密度测定来定量的.这个数字是改编自莫拉基斯等人19。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：锌限制淋球菌生长。野生型菌株FA19，或异源突变体，不产生tdfJ或tdfH，生长在（A）未经处理的CDM中，直到达到指数相，（B）然后被稀释到OD600 = 0.02和（C）OD600 = 0.1。A中的样品用含有卡林（上）或无添加锌（底部）的预混合处理，生长8小时。B和C中的样品辅以含有游锡、无锌（5μM TPEN）或S100A7的预混合，生长6小时。 只有在用可利用的锌源（如CP、S100A7或A和B中的游空锌）补充介质后，这些条件下的生长才能恢复，而C没有充分稀释，以耗尽内部细胞锌池。图2A改编自Jean等人17图2B改编自Maurakis等人19。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3.代表性结合测定显示主机配体与金属应力淋球菌结合。（A） 野生型菌株 FA1090，或这种菌株的突变体，不产生tdfJ、tdfH或两者，在 CDM 中生长，没有补充金属，并且以标准化密度点缀在硝化纤维素上。细胞用钙化物进行探测，该钙化物被锌反应性TdfH识别，并通过检测用抗卡维林抗体（顶部）进行结合评估。相对卡维林结合是通过密度测定量量测定的，这里显示在对数尺度上（底部）。（B） 结合实验按A中所述进行，但采用 FA19 野生型菌株和tdfJ突变体，并在该背景下补充菌株。细胞用HRP标记的S100A7进行探测，该菌株被锌反应TdfJ.（C）野生型F19识别，在CDM或GC介质中并排生长，在无铁中加入25μM递延高氧胺，点缀到标准量中的硝化纤维素中，并探针与转移素结合，结合铁敏TbpA。这些并行测试表明，与 GC 介质汤不同，CDM 不需要额外的包合即可实现铁限环境。图3A改编自Jean等人，底部由Maurakis等人改编。请点击此处查看此图的较大版本。

Supplemental Figure 1
补充图1。请点击此处查看此图的较大版本。

Supplemental Figure 2
补充图2。请点击此处查看此图的较大版本。

Supplemental Figure 3
补充图3。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

生长介质在微生物研究中发挥着多种作用。专用介质用于选择、浓缩以及各种其他应用，用于许多独特的研究类型。其中一种应用是诱导金属响应基因，这通常是通过添加针对特定金属子的特异性包剂来完成的。这种方法是有限的，因为由于含有独特金属型材的不同水源和含有不同金属浓度的两批相同介质成分，各种微量金属所需的包合量可能是可变的。为了避免这种固有的缺陷，我们描述了使用Chelex-100树脂处理的定义介质的制备和使用，以去除散装的所有微量金属，允许根据需要将指定的金属受控地添加回介质中。

在目前的协议中，第一个重要的讨论点是水源。该协议描述了Chelex处理，足以去除实验室类型2（1.0兆欧姆-厘米，根据ISO 3696规格）水的金属。不同的水源可能需要更短或更长的切雷克斯处理。我们发现，纯度高于2型的水，如分子生物学级水，不会支持细菌生长在此应用。选用容器作为介质准备与水源一样重要。我们强烈建议使用清洁塑料容器，因为玻璃器皿可能会将金属离子浸入溶液中。如果没有塑料器皿，玻璃器皿必须用酸洗，以尽量减少污染风险。使用 CDM 时，培养瓶需要相同的酸洗。

内塞利亚淋病在体外环境中的生长可能相当具有挑战性，因为这个有机体已经进化到在人类宿主21特别茁壮成长。虽然CDM适合在实验期间支持生长，但在接种和稀释步骤中必须小心谨慎，以确保淋球菌在大气条件下不会超过必要的时间。由于淋球菌22的嗜血性及其对人类宿主体内温度的偏好，我们不建议将培养物保持在大气条件下超过15分钟。如果方法步骤 4.5 中描述的初始质量倍增事件需要超过 2 小时，则淋球菌培养可能未正确处理，实验应中止。

虽然这种方法的重点是特别用于生长和表征淋病的方法，但使用这种特定的CDM可能也适用于研究其他奈瑟利亚物种。此外，它可以很容易地应用于其他细菌中其他金属感应系统的表征。例如，类似的无金属介质已用于描述金黄色葡萄球菌23和大肠杆菌24中的金属摄入量。根据相关细菌的特定营养需求，对描述的其他细菌的配方的利用可能需要进行少量修改或添加。例如，补充八包括在食谱中，以帮助与淋球菌需要补充CO2。如上所述，生长在37°C，CO2大气为5%，但我们发现，在介质中添加补充碳酸氢盐有助于在定义的介质中生长淋球菌的初始阶段。对于没有这种要求的生物体，这种成分可以省略。不幸的是，这些修改的进一步例子必须经过经验确定。

尽管需要稍微调整方法，以便与其他细菌一起使用，但基本框架应适合广泛使用。金属反应基因和金属转运机的特性是微生物研究的一项持续努力，包括奈瑟氏脑膜炎18、25、26、27、28、S.Aureus 9、流感嗜血杆菌29、肠胃沙门氏菌30和大肠杆菌31在内的细菌都在此特定位置受到关注。我们今后利用这项技术的目的是进一步了解除上述以外其他淋球体金属接收系统，使淋巴细胞从宿主蛋白质（如乳铁素32、33、血红蛋白34、35）和细菌异种苷酶36中获取铁，并扩大我们对锰等其他金属的影响的研究。由内瑟利亚12，37。

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Disclosures

作者没有什么可申报的。

Acknowledgments

这项工作得到了 NIH 授予 R01 AI125421、R01 AI127793 和 U19 AI144182 的支持。写作作者要感谢所有为验证和审查此方法做出贡献的实验室成员。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
125 mL sidearm flasks Bellco 2578-S0030 Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol VWR M131 Open in fume hood
3MM Paper GE Health 3030-6461 Called "filter paper" in text
Agarose Biolone BIO-41025 Powder
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434 Powder
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Powder
Blotting grade blocker Bio-Rad 170-6404 Nonfat dry milk
Bovine serum albumin Roche 3116964001 Powder
Bovine transferrin Sigma-Aldrich T1428 Powder
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 Powder
Calcium pantothenate Sigma-Aldrich C8731 Powder
Calprotectin N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin Bio-Rad 142-2832 Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab Puritan 25-806 Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine Sigma-Aldrich D9533 Powder
D-glucose Sigma-Aldrich G8270 Powder
Dialysis cassette Thermo 66380 Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus Schleicher & Schwell 10484138 Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol Koptec V1016 Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride Sigma-Aldrich F7134 Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich F1143 Irritant, do not inhale
GC medium base Difco 228950 Powder, already contains agar
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Powder
HEPES Fisher L-15694 Powder
Human transferrin Sigma-Aldrich T2030 Powder
Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 Powder
Klett colorimeter Manostat 37012-0000 Uses color transmission to assess culture density
L-alanine Sigma-Aldrich A7627 Powder
L-arginine Sigma-Aldrich A5006 Powder
L-asparagine monohydrate Sigma-Aldrich A8381 Powder
L-aspartate Sigma-Aldrich A9256 Powder
L-cysteine hydrochloride Sigma-Aldrich C1276 Powder
L-cystine Sigma-Aldrich C8755 Powder
L-glutamate Sigma-Aldrich G1251 Powder
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126 Powder
L-histidine monohydrochloride Sigma-Aldrich H8125 Powder
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752 Powder
L-leucine Sigma-Aldrich L8000 Powder
L-lysine Sigma-Aldrich L5501 Powder
L-methionine Sigma-Aldrich M9625 Powder
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126 Powder
L-proline Sigma-Aldrich P0380 Powder
L-serine Sigma-Aldrich S4500 Powder
L-threonine Sigma-Aldrich T8625 Powder
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254 Powder
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754 Powder
L-valine Sigma-Aldrich V0500 Powder
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Powder
Methanol VWR BDH1135-4LP Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose GE Health 10600002 Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 60356 Powder
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Powder
Potassium sulfate Sigma-Aldrich P0772 Powder
Potato starch Sigma-Aldrich S4251 Powder
Reduced glutathione Sigma-Aldrich G4251 Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7 N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder
Sodium chloride VWR 470302 Powder
Sodium citrate Fisher S279 Powder
Sodium hydroxide Acros Organics 383040010 Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625 Powder
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754 Also called cocarboxylase
TPEN Sigma-Aldrich P4413 Powder
Tris VWR 497 Powder
Uracil Sigma-Aldrich U0750 Powder
Zinc sulfte heptahydrate Sigma-Aldrich 204986 Irritant, do not inhale

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References

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免疫学和感染，第157期，淋病，金属，定义培养基，生长测定，结合测定，细菌病原体
内<em>塞里亚淋病</em>的金属有限生长，用于金属反应基因特征和从宿主配体中获取金属
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Maurakis, S., Cornelissen, C. N. Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands. J. Vis. Exp. (157), e60903, doi:10.3791/60903 (2020).

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