Summary

Metal-Limited Crescita di Neisseria gonorrhoeae per la caratterizzazione dei geni metal-reattivi e l'acquisizione di metalli da Host Ligands

Published: March 04, 2020
doi:

Summary

Descriviamo qui un metodo per la crescita delle gonorree Neisseria nel mezzo liquido con restrizioni metalliche per facilitare l’espressione dei geni per l’assorbimento dei metalli. Illustremo anche esperimenti a valle per caratterizzare il fenotipo dei gonocchi coltivati in queste condizioni. Questi metodi possono essere adattati per essere adatti per la caratterizzazione di geni che rispondono ai metalli in altri batteri.

Abstract

I metalli traccia come ferro e zinco sono nutrienti vitali noti per svolgere un ruolo chiave nei processi procatotici, tra cui la regolazione genica, la catalisi e la struttura delle proteine. Il sequestro di metallo da parte degli ospiti spesso porta a limitazioni di metallo per il batterio. Questa limitazione induce l’espressione genica batterica i cui prodotti proteici consentono ai batteri di superare il loro ambiente limitato dai metalli. La caratterizzazione di tali geni è impegnativa. I batteri devono essere coltivati in supporti meticolosamente preparati che consentano un accesso sufficiente ai metalli nutrizionali per consentire la crescita batterica, pur mantenendo un profilo metallico favorevole al raggiungimento dell’espressione dei suddetti geni. Come tale, un delicato equilibrio deve essere stabilito per le concentrazioni di questi metalli. Coltivare un organismo nutrizionalmente esigente come Neisseria gonorrhoeae, che si è evoluto per sopravvivere solo nell’ospite umano, aggiunge un ulteriore livello di complessità. Qui, descriviamo la preparazione di un mezzo definito a limitata di metalli sufficiente a consentire la crescita gonococcica e l’espressione genica desiderata. Questo metodo consente allo sperimentatore di maticare ferro e zinco da fonti indesiderate integrando i media con fonti definite di ferro o zinco, la cui preparazione è anche descritta. Infine, illustreremo tre esperimenti che utilizzano questo mezzo per aiutare a caratterizzare i prodotti proteici dei geni gonococcici regolati dai metalli.

Introduction

Neisseria gonorrhoeae provoca la comune infezione trasmessa sessualmente gonorrea. Durante l’infezione, patogeni Neisseria esprimono un repertorio di geni che rispondono ai metalli che permettono ai batteri di superare gli sforzi di restrizione dei metalli da parte dell’ospite umano1,2,3. I metalli traccia come il ferro e lo zinco svolgono un ruolo chiave in molti processi cellulari, come il legame agli enzimi nei siti catalitici, la partecipazione alle reazioni di redox e come fattori strutturali in varie proteine4,5. In condizioni di metallo limitato, i loci che rispondono ai metalli sono derepressi e le loro proteine risultanti possono aiutare ad acquisire questi nutrienti. La caratterizzazione di questi geni e proteine rappresenta una sfida tecnica unica per lo sperimentatore. Gli ioni metallici devono essere trattenuti dai batteri per indurre la trascrizione di questi geni dai loro loci nativi, ma una malattia efficace di questi ioni da supporti carichi di metalli può essere difficile da ottimizzare. I diversi profili metallici dell’acqua di origine e la variazione intrinseca di6 ingredienti in polvere significano che la quantità di chelatore necessaria per rimuovere un metallo specifico da un mezzo ricco varierà tra diverse posizioni, fornitori di ingredienti, e anche nel tempo all’interno di un singolo laboratorio come inventario chimico viene sostituito.

Per aggirare questa sfida, descriviamo la preparazione di un mezzo definito che viene trattato con resina Chelex-100 durante la preparazione per rimuovere i metalli traccia dalla soluzione. Questo mezzo è sufficientemente nutriente denso per consentire la crescita del gonococco, che è difficile da coltura al di fuori dell’ospite umano, e permette allo sperimentatore di introdurre un profilo metallico specifico aggiungendo le proprie fonti definite e concentrazioni di Metalli. Il metodo di controllo add-back dei metalli desiderati a medio impoverito aumenta la consistenza sperimentale e consente esperimenti robusti e replicabili indipendentemente da fattori quali la fonte d’acqua e il numero di lotti chimici. Inoltre, questo supporto può essere distribuito come liquido o solido con solo piccole modifiche, rendendolo abbastanza versatile.

Al fine di dimostrare l’utilità di questo mezzo, descriviamo un protocollo per il suo utilizzo per la crescita gonococcica e descriviamo tre esperimenti di successo per caratterizzare i geni Neisseria sensibili ai metalli. In primo luogo, prepariamo lismi a cellule intere gonococcali da colture impoverite o integrate di metallo e dimostriamo livelli variabili di produzione di proteine da loci che rispondono ai metalli. Viene quindi illustrato un saggio di crescita limitato allo zinco in cui la crescita gonococcale è controllata dal completamento di specifiche fonti di zinco utilizzabili. Infine, mostriamo saggi vincolanti che dimostrano cellule gonococciche intere che esprimono recettori di superficie che rispondono al metallo che si legano ai rispettivi ligoandi contenenti metalli. La presentazione superficiale di successo di questi recettori richiede la crescita nel mezzo impoverito di metalli.

L’attuale protocollo è stato ottimizzato specificamente per neisseria gonorrhoeae, ma numerosi altri patogeni batterici impiegano strategie di acquisizione di metalli durante l’infezione7, quindi questo protocollo può essere adattato per lo studio dell’omeostasi metallica in altri batteri. Ottimizzare questo supporto e questi protocolli sperimentali per l’uso in altri batteri richiederà probabilmente una leggera modifica delle concentrazioni di chelatori metallici e/o il tempo di trattamento con Chelex-100, poiché altri batteri possono avere requisiti metallici leggermente diversi rispetto al gonococcus. Ferro e zinco sono i metalli primari di preoccupazione per le indagini descritte, ma altri metalli (ad esempio, manganese) sono stati dimostrati come critici per i batteri, tra cui Neisseria8,9,10,11,12. Inoltre, sono stati descritti metodi simili per le caratterizzazioni dei metalli nel lavoro di coltura cellulare eucarome, che può anche essere considerato. 13 del sistema

Protocol

1. Preparazione di soluzioni stock A media definita (CDM) trattate da Chelex Soluzione stock I Combinare NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) e KH2PO4 (10,9 g) in acqua deionizzata a un volume finale di 1 L. Filtro sterilizzare la soluzione e aliquota in tubi conici 50 mL. Conservare a -20 gradi centigradi. Soluzione stock II Combinare tiamina HCl (0…

Representative Results

Uno specifico mezzo definito in assenza di metalli traccia per la crescita di Neisseria gonorrhoeae è stato sviluppato e implementato per la caratterizzazione dei geni che rispondono ai metalli e dei loro prodotti genici. Nel protocollo ottimizzato, il profilo metallico dei supporti è controllato aggiungendo metalli a discrezione dello sperimentatore, piuttosto che titerando chelazione di un bersaglio metallico, consentendo un maggiore controllo e coerenza da laboratorio a labo…

Discussion

I mezzi di crescita riscantono una varietà di ruoli nella ricerca microbiologica. I supporti specializzati vengono utilizzati per la selezione, l’arricchimento e varie altre applicazioni per molti tipi di studio unici. Una di queste applicazioni è l’induzione di geni che rispondono ai metalli, che viene in genere realizzata mediante l’aggiunta di un chelante specifico che si rivolge a un particolare ione metallico. Questo metodo è limitato, in quanto la quantità di chelazione necessaria per vari metalli traccia è pr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01 AI125421, R01 AI127793 e U19 AI144182. L’autore dello scrittore desidera ringraziare tutti i membri del laboratorio che hanno contribuito alla revisione e alla revisione di questo metodo.

Materials

125 mL sidearm flasks Bellco 2578-S0030 Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol VWR M131 Open in fume hood
3MM Paper GE Health 3030-6461 Called "filter paper" in text
Agarose Biolone BIO-41025 Powder
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434 Powder
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Powder
Blotting grade blocker Bio-Rad 170-6404 Nonfat dry milk
Bovine serum albumin Roche 3116964001 Powder
Bovine transferrin Sigma-Aldrich T1428 Powder
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 Powder
Calcium pantothenate Sigma-Aldrich C8731 Powder
Calprotectin N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin Bio-Rad 142-2832 Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab Puritan 25-806 Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine Sigma-Aldrich D9533 Powder
D-glucose Sigma-Aldrich G8270 Powder
Dialysis cassette Thermo 66380 Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus Schleicher & Schwell 10484138 Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol Koptec V1016 Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride Sigma-Aldrich F7134 Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich F1143 Irritant, do not inhale
GC medium base Difco 228950 Powder, already contains agar
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Powder
HEPES Fisher L-15694 Powder
Human transferrin Sigma-Aldrich T2030 Powder
Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 Powder
Klett colorimeter Manostat 37012-0000 Uses color transmission to assess culture density
L-alanine Sigma-Aldrich A7627 Powder
L-arginine Sigma-Aldrich A5006 Powder
L-asparagine monohydrate Sigma-Aldrich A8381 Powder
L-aspartate Sigma-Aldrich A9256 Powder
L-cysteine hydrochloride Sigma-Aldrich C1276 Powder
L-cystine Sigma-Aldrich C8755 Powder
L-glutamate Sigma-Aldrich G1251 Powder
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126 Powder
L-histidine monohydrochloride Sigma-Aldrich H8125 Powder
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752 Powder
L-leucine Sigma-Aldrich L8000 Powder
L-lysine Sigma-Aldrich L5501 Powder
L-methionine Sigma-Aldrich M9625 Powder
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126 Powder
L-proline Sigma-Aldrich P0380 Powder
L-serine Sigma-Aldrich S4500 Powder
L-threonine Sigma-Aldrich T8625 Powder
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254 Powder
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754 Powder
L-valine Sigma-Aldrich V0500 Powder
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Powder
Methanol VWR BDH1135-4LP Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose GE Health 10600002 Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 60356 Powder
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Powder
Potassium sulfate Sigma-Aldrich P0772 Powder
Potato starch Sigma-Aldrich S4251 Powder
Reduced glutathione Sigma-Aldrich G4251 Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7 N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder
Sodium chloride VWR 470302 Powder
Sodium citrate Fisher S279 Powder
Sodium hydroxide Acros Organics 383040010 Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625 Powder
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754 Also called cocarboxylase
TPEN Sigma-Aldrich P4413 Powder
Tris VWR 497 Powder
Uracil Sigma-Aldrich U0750 Powder
Zinc sulfte heptahydrate Sigma-Aldrich 204986 Irritant, do not inhale

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Cite This Article
Maurakis, S., Cornelissen, C. N. Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands. J. Vis. Exp. (157), e60903, doi:10.3791/60903 (2020).

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