Vi beskriver här en metod för tillväxt av Neisseria gonorréie i metall-begränsad flytande medium för att underlätta uttrycket av gener för metall upptag. Vi beskriver också nedströms experiment för att karakterisera fenotyp av gonococci odlas under dessa förhållanden. Dessa metoder kan anpassas för att vara lämpliga för karakterisering av metall-lyhörda gener i andra bakterier.
Spårmetaller som järn och zink är viktiga näringsämnen kända för att spela nyckelroller i prokaryota processer inklusive genreglering, katalys och proteinstruktur. Metall bindning av värdar leder ofta till metall begränsning för bakterien. Denna begränsning inducerar bakteriellgenuttryck vars proteinprodukter tillåter bakterier att övervinna sin metallbegränsade miljö. Karakterisering av sådana gener är utmanande. Bakterier måste odlas i minutiöst förberedda medier som ger tillräcklig tillgång till näringsmetaller för att möjliggöra bakterietillväxt samtidigt som en metallprofil som bidrar till att uppnå uttryck för ovannämnda gener. Därför måste en känslig balans fastställas för koncentrationerna av dessa metaller. Växande en näringsmässigt kräsen organism som Neisseria gonorrée, som har utvecklats för att överleva endast i den mänskliga värden, lägger till en ytterligare nivå av komplexitet. Här beskriver vi beredningen av ett definierat metallbegränsat medium som är tillräckligt för att möjliggöra gonokocktillväxt och önskat genuttryck. Denna metod gör det möjligt för utredaren att chelate järn och zink från oönskade källor samtidigt komplettera media med definierade källor till järn eller zink, vars beredning beskrivs också. Slutligen beskriver vi tre experiment som använder detta media för att karakterisera proteinprodukter av metallreglerade gonokockgener.
Neisseria gonorrée orsakar den vanliga sexuellt överförbara infektion gonorré. Under infektion, patogena Neisseria uttrycka en repertoar av metall-lyhörda gener som tillåter bakterier att övervinna metall begränsning insatser av den mänskliga värd1,2,3. Spårmetaller som järn och zink spelar nyckelroller i många cellulära processer, såsom bindning till enzymer i katalytiska platser, deltagande i redox reaktioner, och som strukturella faktorer i olika proteiner4,5. Under metall-begränsade förhållanden, metall-lyhörd loci är förtryckta och deras resulterande proteiner kan hjälpa förvärvet av dessa näringsämnen. Karakterisering av dessa gener och proteiner utgör en unik teknisk utmaning för utredaren. Metalljoner måste undanhållas från bakterier för att inducera transkription av dessa gener från deras inhemska loci, men effektiv kelering av dessa joner från metall-lastade medier kan vara svårt att optimera. De olika metallprofilerna för källvatten och inneboende parti-till-parti-variation6 av pulveriserade ingredienser innebär att den mängd kelator som krävs för att ta bort en specifik metall från ett rikt medium varierar mellan olika platser, ingrediensleverantörer och till och med över tiden inom ett enda laboratorium som kemisk inventering ersätts.
För att kringgå denna utmaning beskriver vi utarbetandet av ett definierat medium som behandlas med Chelex-100 harts under beredningen för att avlägsna spårmetaller från lösningen. Detta medium är tillräckligt näringsrikt för att möjliggöra tillväxten av gonokocker, vilket är svårt att odla utanför den mänskliga värden, och gör det möjligt för utredaren att införa en specifik metallprofil genom tillägg av sina egna definierade källor och koncentrationer av Metaller. Metoden för kontrollerad add-back av önskade metaller till utarmade medium ökar experimentell konsistens och möjliggör robusta, reproducerbara experiment oavsett faktorer som vattenkälla och kemiska partinummer. Dessutom kan detta medium distribueras som antingen en vätska eller fast med endast mindre ändringar, vilket gör det ganska mångsidig.
För att visa nyttan av detta medium, beskriver vi ett protokoll för dess användning för gonokock tillväxt och beskriva tre framgångsrika experiment för att karakterisera metall-lyhörda Neisseria gener. Först förbereder vi gonokocker hela cell lysater från metall-utarmade eller kompletterade kulturer och visa varierande nivåer av proteinproduktion från metall-lyhörd loci. Vi beskriver sedan en zink-begränsad tillväxt analys där gonokocktillväxt styrs genom tillskott av specifika, användbara zinkkällor. Slutligen visar vi bindande analyser som visar hela gonokockceller som uttrycker metall-lyhörda ytreceptorer som är bindande för sina respektive metallhaltiga ligands. Framgångsrik ytpresentation av dessa receptorer kräver tillväxt i metallutarmade medium.
Det nuvarande protokollet optimerades speciellt för Neisseria gonorrée, men många andra bakteriella patogener använder metall förvärv strategier under infektion7, så detta protokoll kan anpassas för studier av metall homeostas i andra bakterier. Optimera detta media och dessa experimentella protokoll för användning i andra bakterier kommer sannolikt att kräva liten ändring av metall kelator koncentrationer och / eller behandlingstid med Chelex-100, eftersom andra bakterier kan ha något olika metallkrav än gonococcus. Järn och zink är de primära metallerna av oro för de beskrivna undersökningarna, men andra metaller (t.ex. mangan) har visats vara kritiska för bakterier, inklusive Neisseria8,9,10,11,12. Dessutom har liknande metoder beskrivits för metallkarakteriseringar i eukaryotiskt cellodlingsarbete, vilket också kan övervägas. 13
Tillväxtmedia tjänar en mängd olika roller inom mikrobiologisk forskning. Specialiserade medier används för urval, berikning och olika andra applikationer för många unika typer av studier. En sådan applikation är induktion av metall-lyhörda gener, som vanligtvis sker genom tillägg av en specifik kelator som riktar sig mot en viss metalljon. Denna metod är begränsad, eftersom den mängd kelering som krävs för olika spårmetaller sannolikt kommer att variera på grund av olika vattenkällor som innehåller u…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag En R01 AI125421, R01 AI127793 och U19 AI144182. Skrivförfattaren vill tacka alla labbmedlemmar som bidragit till korrekturläsning och granskning av denna metod.
125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
Tris | VWR | 497 | Powder |
Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |