Vi beskriver her en metode til vækst af Neisseria gonorrée i metal-begrænset flydende medium for at lette ekspressionen af gener for metaloptagelse. Vi skitserer også downstream eksperimenter for at karakterisere fænotype af gonococci dyrket under disse betingelser. Disse metoder kan tilpasses til at være egnet til karakterisering af metal-responsive gener i andre bakterier.
Trace metaller såsom jern og zink er vitale næringsstoffer kendt for at spille centrale roller i prokaryotiske processer, herunder genregulering, katalyse, og protein struktur. Metal binding af værter fører ofte til metal begrænsning for bakterien. Denne begrænsning inducerer bakterielgen udtryk, hvis proteinprodukter tillader bakterier at overvinde deres metal-begrænset miljø. Karakterisering af sådanne gener er udfordrende. Bakterier skal dyrkes i omhyggeligt tilberedte medier, der giver tilstrækkelig adgang til ernæringsmæssige metaller til at tillade bakterievækst og samtidig opretholde en metalprofil, der fremmer at opnå ekspression af de førnævnte gener. Som sådan skal der skabes en hårfin balance for koncentrationerne af disse metaller. Dyrkning af en ernæringsmæssigt kræsen organisme som Neisseria gonorrée, som har udviklet sig til at overleve kun i den menneskelige vært, tilføjer en ekstra grad af kompleksitet. Her beskriver vi præparatet af et defineret metalbegrænset medium, der er tilstrækkeligt til at muliggøre gonokokvækst og det ønskede genekspression. Denne metode gør det muligt for investigator at chelate jern og zink fra uønskede kilder, mens supplere medierne med definerede kilder til jern eller zink, hvis præparat er også beskrevet. Endelig skitserer vi tre eksperimenter, der udnytter dette medie til at hjælpe med at karakterisere proteinprodukter fra metalregulerede gonokokgener.
Neisseria gonorrée forårsager den almindelige seksuelt overførte infektion gonoré. Under infektion, patogene Neisseria udtrykke et repertoire af metal-responsive gener, der gør det muligt for bakterier til at overvinde metal begrænsning indsats af den menneskelige vært1,2,3. Trace metaller som jern og zink spiller centrale roller i mange cellulære processer, såsom binding til enzymer i katalytiske steder, deltagelse i redox reaktioner, og som strukturelle faktorer i forskellige proteiner4,5. Under metalbegrænsende forhold er metal-responsive loci derepressed og deres resulterende proteiner kan støtte erhvervelsen af disse næringsstoffer. Karakterisering af disse gener og proteiner udgør en unik teknisk udfordring for investigator. Metalioner skal tilbageholdes fra bakterier for at fremkalde transskription af disse gener fra deres indfødte loci, men effektiv kelation af disse ioner fra metal-laden medier kan være svært at optimere. De forskellige metalprofiler af kildevand og iboende lot-to-lot variation6 af pulveriserede ingredienser betyder, at mængden af chelator, der kræves for at fjerne et bestemt metal fra et rigt medie, vil variere mellem forskellige steder, ingrediensleverandører, og endda over tid inden for et enkelt laboratorium, da den kemiske beholdning udskiftes.
For at omgå denne udfordring beskriver vi udarbejdelsen af et defineret medium, der behandles med Chelex-100 harpiks under tilberedningen for at fjerne spormetaller fra opløsningen. Dette medium er tilstrækkeligt næringsstoftæt til at muliggøre vækst af gonococcus, som er vanskeligt at kultur uden for den menneskelige vært, og gør det muligt for investigator at indføre en specifik metalprofil ved at tilføje deres egne definerede kilder og koncentrationer af Metaller. Metoden til kontrolleret add-back af ønskede metaller til forarmet medium øger eksperimentel konsistens og giver mulighed for robuste, replikerbare eksperimenter uanset faktorer såsom vandkilde og kemiske partinumre. Desuden kan dette medie anvendes som enten en væske eller fast med kun mindre ændringer, hvilket gør det ganske alsidigt.
For at demonstrere nytten af dette medie, skitserer vi en protokol for dets anvendelse for gonokok vækst og beskrive tre vellykkede eksperimenter til at karakterisere metal-lydhør Neisseria gener. For det første forbereder vi gonokok hele celle lysates fra metal-forarmet eller suppleret kulturer og demonstrere variable niveauer af proteinproduktion fra metal-responsive loci. Vi skitserer derefter en zink-begrænset vækst analyse, hvor gonokok vækst styres ved tilskud af specifikke, brugbare zink kilder. Endelig viser vi bindende analyser, der viser hele gonokokceller, der udtrykker metalresponsive overfladereceptorer, der binder sig til deres respektive metalholdige ligander. Vellykket overfladepræsentation af disse receptorer kræver vækst i metal-forarmet medium.
Den nuværende protokol blev optimeret specielt til Neisseria gonorrée, men mange andre bakterielle patogener anvender metal erhvervelse strategier under infektion7, så denne protokol kan tilpasses til studiet af metal homøostase i andre bakterier. Optimering af dette medie og disse eksperimentelle protokoller til brug i andre bakterier vil sandsynligvis kræve let ændring af metal chelator koncentrationer og / eller behandlingstid med Chelex-100, som andre bakterier kan have lidt forskellige metal krav end gonococcus. Jern og zink er de primære metaller, der giver anledning til bekymring i forbindelse med de beskrevne undersøgelser, men andre metaller (f.eks. mangan) er blevet påvist som kritiske for bakterier, herunder Neisseria8,9,10,11,12. Desuden er lignende metoder blevet beskrevet for metal karakteriseringer i eukaryotiske celle kultur arbejde, som også kan overvejes. 13.
Vækstmedier tjener en række roller inden for mikrobiologisk forskning. Specialiserede medier bruges til udvælgelse, berigelse og forskellige andre applikationer til mange unikke typer af undersøgelse. En sådan anvendelse er induktion af metal-responsive gener, som typisk opnås ved tilsætning af en bestemt chelator, der er rettet mod en bestemt metal ion. Denne metode er begrænset, da mængden af kelation er nødvendig for forskellige spormetaller sandsynligvis vil være variabel på grund af forskellige vandkilde…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R01 AI125421, R01 AI127793, og U19 AI144182. Forfatteren vil gerne takke alle lab medlemmer, der har bidraget til korrekturlæsning og gennemgang af denne metode.
125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
Tris | VWR | 497 | Powder |
Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |