Summary

מתכת-צמיחה מוגבלת של הגגורסריה של ניציבטיים לאפיון של גנים מתכתיים מגיבים ורכישת מתכות מהמארח ליגנדס

Published: March 04, 2020
doi:

Summary

אנו מתארים כאן שיטה לצמיחה של זיבה Neisseria במדיום נוזלי מוגבל מתכת כדי להקל על ביטוי של גנים ספיגת מתכת. כמו כן, אנו מגדירים במטה ניסויים לאפיון הפנוטיפ של גונקוצ’י שגדל בתנאים אלה. שיטות אלה ניתן להתאים כדי להיות מתאים לאפיון של גנים התגובה מתכת בחיידקים אחרים.

Abstract

עקבות מתכות כגון ברזל ואבץ הם חומרים מזינים חיוניים הידועים לשחק תפקידי מפתח בתהליכים prokaryotic כולל רגולציה גנטית, זרז, מבנה החלבון. קיבוע על מתכת על ידי מארחים מוביל לעתים קרובות הגבלת מתכת עבור החיידק. מגבלה זו מעוררת ביטוי גנים חיידקי אשר מוצרי החלבון שלהם מאפשרים לחיידקים להתגבר על הסביבה מתכת מוגבלת שלהם. אפיון של גנים כאלה הוא מאתגר. חיידקים יש לגדל במדיה מוכנה בקפדנות המאפשרת גישה מספקת מתכות תזונתיות כדי לאפשר גידול חיידקי תוך שמירה על פרופיל מתכת התורמת להשגת ביטוי של הגנים הנ ל. ככזה, יש להקים איזון עדין בריכוזים של מתכות אלה. גידול אורגניזם בררן מבחינה תזונתית, כגון גונדו,שהתפתח לשרוד רק בפונדקאי האנושי, מוסיף רמה נוספת של מורכבות. כאן, אנו מתארים את ההכנה של המדיום מוגבל מתכת מוגבלת מספיק כדי לאפשר צמיחת דלקת ואת הביטוי הגן הרצוי. שיטה זו מאפשרת לחוקר ברזל ואבץ ממקורות בלתי רצויים, תוך הגדלת המדיה עם מקורות ברזל או אבץ, שהכנתה מתוארת גם כן. בסופו של דבר, אנו מתווה שלושה ניסויים המשתמשים במדיה זו כדי לעזור לאפיין את מוצרי החלבון של הגנים המוסדרים מתכת המתכת.

Introduction

גונדוניים גורם לזיבה השכיחה. של זיהום מינית במהלך הדלקת, Neisseria הפתוגניים מבטא רפרטואר של גנים מגיבים מתכת המאפשרים לחיידקים להתגבר על מאמצי הגבלת מתכת על ידי הפונדקאי האנושי1,2,3. מעקב אחר מתכות כמו ברזל ואבץ תפקידי מפתח בתהליכים סלולריים רבים, כגון קשירה לאנזימים באתרים קטליטיים, השתתפות בתגובות נגד חמצון, וכגורמים מבניים בחלבונים שונים4,5. בתנאים מוגבלים במתכת, המצב הניתן לתגובה ממתכת מצטמצם והחלבונים העשויים לסייע לרכישת החומרים המזינים הללו. אפיון הגנים והחלבונים הללו מציג אתגר טכני ייחודי עבור החוקר. יוני מתכת חייב להיות מחוץ חיידקים כדי לגרום שעתוק של גנים אלה מן המוצא הילידים שלהם, אבל הכלרות יעיל של יונים אלה מדיה לאדן מתכת יכול להיות קשה למטב. פרופילי מתכת שונים של מים המקור הטבועה הרבה-ללוט וריאציה6 של מרכיבים אבקה פירושה כי כמות הכלור נדרש כדי להסיר מתכת מסוימת ממדיום עשיר ישתנה בין מיקומים שונים, ספקי המרכיב, ואפילו לאורך זמן בתוך מעבדה אחת כמו מלאי כימי מוחלף.

כדי לעקוף את האתגר הזה, אנו מתארים את ההכנה של בינוני מוגדר כי הוא טיפל עם שרף צ’אקס-100 במהלך ההכנה להסרת מתכות מעקב מהפתרון. המדיום הזה הוא מזון מספיק צפוף כדי לאפשר את הצמיחה של gonococcus, אשר קשה לתרבות מחוץ הפונדקאי האנושי, ומאפשר לחוקר להציג פרופיל מתכת ספציפית על ידי הוספת מקורות שלהם מוגדרים וריכוזים של מתכות. שיטת התוספת מבוקרת של מתכות הרצוי לרוקן בינונית מגביר את העקביות ניסיוני ומאפשר לחזק, ניסויים השכפול ללא קשר לגורמים כגון מקור המים מספרים החומר הכימי. יתר על כן, מדיה זו ניתן לפרוס כמו נוזל או מלא עם שינויים קלים בלבד, מה שהופך אותו צדדי למדי.

כדי להדגים את כלי השירות של המדיום הזה, אנו מתארים פרוטוקול עבור השימוש בו עבור צמיחה דלקת ולתאר שלושה ניסויים מוצלחים לאפיון גנים מתכת התגובה הגיבה. ראשית, אנו מכינים בתאי מתכת שלמים מתרבויות מתכתיות או שנוספו ומדגימים רמות משתנה של ייצור חלבונים מתוך המצב התגובה המתכתי. לאחר מכן אנו מתווה שיטת צמיחה מוגבלת אבץ שבו הצמיחה דלקת נשלטת על ידי תוספי מקורות אבץ ספציפיים, שמיש. בסופו של דבר, אנו מראים כריכה מחייב כי להפגין תאים דלקת שלם ביטוי מתכת-תגובה קולטני השטח כריכה על מתכת בהתאמה שלהם המכילים ליגנדס. מצגת פני השטח מוצלחת של קולטנים אלה דורש צמיחה בינונית המרוקנת מתכת.

הפרוטוקול הנוכחי היה מיטבי במיוחד עבור גונדוסטין, אבל רבים פתוגנים חיידקים אחרים להעסיק אסטרטגיות רכישת מתכת במהלך זיהום7, כך פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם לחקר הומאוסטזיס מתכת בחיידקים אחרים. מיטוב התקשורת הזאת ואת הפרוטוקולים הניסיוניים האלה לשימוש בחיידקים אחרים צפויים לדרוש שינוי קל של ריכוזי מתכת כלאטור ו/או זמן טיפול עם צ’אקס-100, כמו חיידקים אחרים עשויים להיות מעט שונה דרישות מתכת מאשר gonococcus. ברזל ואבץ הם המתכות העיקריות של דאגה החקירות המתוארות, אבל מתכות אחרות (למשל, מנגן) הוכחו כקריטיים עבור חיידקים, כולל neisseria8,9,10,11,12. יתר על כן, שיטות דומות תוארו עבור המאפיינים מתכת בעבודה בתרבות התאים איקריוטית, אשר עשוי גם להיחשב. מיכל בן 13

Protocol

1. הכנת מניות שטופלו במדיום (CDM) פתרונות מדמין פתרון מניות אני לשלב הנאל (233.8 g), K2SO4 (40.0 g), NH4Cl (8.8 g), K2hpo4 (13.9 g), ו-KH2פו4 (10.9 g) במים מאוהים לנפח הסופי של 1 L. מסננים לחטא את הפתרון סדרת מחלקים לתוך 50 מ”ל צינורות חרוט. חנות ב-20 ° c. …

Representative Results

בינונית מוגדרת ספציפית בהיעדר מתכות מעקב לצמיחתה של ניציסריה הרואובטיים פותחה ויושמה לאפיון הגנים המגיבים במתכת ומוצרי הגנים שלהם. בפרוטוקול הממוטב, פרופיל המתכת של המדיה נשלט על ידי הוספת מתכות בחזרה לשיקול הדעת של החוקר, ולא על ידי הכלתה של מטרה מתכת, המאפשר שליט?…

Discussion

מדיית הצמיחה משרתת מגוון תפקידים במחקר מיקרוביולוגי. מדיה מתמחה משמשים לבחירה, העשרה, ויישומים אחרים שונים עבור סוגים רבים וייחודיים של המחקר. יישום אחד כזה הוא אינדוקציה של גנים המגיבים מתכת, אשר בדרך כלל מושגת על ידי הוספת כלקטור ספציפי כי מטרות יון מתכת מסוים. שיטה זו מוגבלת, ככל שכמות ה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על-ידי מענקי NIH R01 AI125421, R01 AI127793 וU19 AI144182. מחבר הכתיבה רוצה להודות לכל חברי המעבדה שתרמו להגהה ולסקירה של שיטה זו.

Materials

125 mL sidearm flasks Bellco 2578-S0030 Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol VWR M131 Open in fume hood
3MM Paper GE Health 3030-6461 Called "filter paper" in text
Agarose Biolone BIO-41025 Powder
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434 Powder
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Powder
Blotting grade blocker Bio-Rad 170-6404 Nonfat dry milk
Bovine serum albumin Roche 3116964001 Powder
Bovine transferrin Sigma-Aldrich T1428 Powder
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 Powder
Calcium pantothenate Sigma-Aldrich C8731 Powder
Calprotectin N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin Bio-Rad 142-2832 Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab Puritan 25-806 Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine Sigma-Aldrich D9533 Powder
D-glucose Sigma-Aldrich G8270 Powder
Dialysis cassette Thermo 66380 Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus Schleicher & Schwell 10484138 Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol Koptec V1016 Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride Sigma-Aldrich F7134 Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich F1143 Irritant, do not inhale
GC medium base Difco 228950 Powder, already contains agar
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Powder
HEPES Fisher L-15694 Powder
Human transferrin Sigma-Aldrich T2030 Powder
Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 Powder
Klett colorimeter Manostat 37012-0000 Uses color transmission to assess culture density
L-alanine Sigma-Aldrich A7627 Powder
L-arginine Sigma-Aldrich A5006 Powder
L-asparagine monohydrate Sigma-Aldrich A8381 Powder
L-aspartate Sigma-Aldrich A9256 Powder
L-cysteine hydrochloride Sigma-Aldrich C1276 Powder
L-cystine Sigma-Aldrich C8755 Powder
L-glutamate Sigma-Aldrich G1251 Powder
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126 Powder
L-histidine monohydrochloride Sigma-Aldrich H8125 Powder
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752 Powder
L-leucine Sigma-Aldrich L8000 Powder
L-lysine Sigma-Aldrich L5501 Powder
L-methionine Sigma-Aldrich M9625 Powder
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126 Powder
L-proline Sigma-Aldrich P0380 Powder
L-serine Sigma-Aldrich S4500 Powder
L-threonine Sigma-Aldrich T8625 Powder
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254 Powder
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754 Powder
L-valine Sigma-Aldrich V0500 Powder
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Powder
Methanol VWR BDH1135-4LP Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose GE Health 10600002 Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 60356 Powder
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Powder
Potassium sulfate Sigma-Aldrich P0772 Powder
Potato starch Sigma-Aldrich S4251 Powder
Reduced glutathione Sigma-Aldrich G4251 Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7 N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder
Sodium chloride VWR 470302 Powder
Sodium citrate Fisher S279 Powder
Sodium hydroxide Acros Organics 383040010 Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625 Powder
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754 Also called cocarboxylase
TPEN Sigma-Aldrich P4413 Powder
Tris VWR 497 Powder
Uracil Sigma-Aldrich U0750 Powder
Zinc sulfte heptahydrate Sigma-Aldrich 204986 Irritant, do not inhale

References

  1. Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
  2. Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
  3. Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
  4. Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
  5. Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
  6. Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
  7. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  8. Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
  9. Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
  11. Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
  12. Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
  13. Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
  14. Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
  17. Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
  18. Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
  19. Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
  20. Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
  21. Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
  22. Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
  23. Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
  24. Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
  25. Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
  26. Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
  27. Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
  28. Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
  29. Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
  30. Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
  31. Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
  32. Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
  33. Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
  34. Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
  35. Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
  36. Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
  37. Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).

Play Video

Cite This Article
Maurakis, S., Cornelissen, C. N. Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands. J. Vis. Exp. (157), e60903, doi:10.3791/60903 (2020).

View Video