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Immunology and Infection

धातु-उत्तरदायी जीन और मेजबान लिगांड्स से धातु अधिग्रहण के लक्षण वर्णन के लिए नेसेरिया गोनोरिया की धातु-सीमित वृद्धि

doi: 10.3791/60903 Published: March 4, 2020

Summary

हम यहां धातु-प्रतिबंधित तरल माध्यम में नेसेरिया गोनोरिया के विकास के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं ताकि धातु तेज के लिए जीन की अभिव्यक्ति को सुगम बनाया जा सके । हम इन स्थितियों में उगाए गए गोनोकोची के फेनोटाइप की विशेषता के लिए डाउनस्ट्रीम प्रयोगों की रूपरेखा भी तैयार करते हैं। इन तरीकों को अन्य बैक्टीरिया में धातु-उत्तरदायी जीन के लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त होने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

आयरन और जिंक जैसी धातुओं का पता लगाने के जीन विनियमन, उत्प्रेरक, और प्रोटीन संरचना सहित प्रोकैरियोटिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता महत्वपूर्ण पोषक तत्व हैं । मेजबानों द्वारा धातु की ज़ब्ती अक्सर जीवाणु के लिए धातु की सीमा की ओर जाता है। यह सीमा बैक्टीरियल जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करती है जिसके प्रोटीन उत्पाद बैक्टीरिया को अपने धातु-सीमित वातावरण को दूर करने की अनुमति देते हैं। ऐसे जीन का लक्षण वर्णन चुनौतीपूर्ण है। बैक्टीरिया सावधानी से तैयार मीडिया में उगाया जाना चाहिए जो उपरोक्त जीन की अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए अनुकूल धातु प्रोफ़ाइल को बनाए रखते हुए बैक्टीरियल विकास की अनुमति देने के लिए पोषण धातुओं तक पर्याप्त पहुंच की अनुमति देता है। जैसे, इन धातुओं की सांद्रता के लिए एक नाजुक संतुलन स्थापित किया जाना चाहिए। नेसेरिया गोनोरियाजैसे पोषण के रूप में दुराग्रही जीव को बढ़ाना, जो केवल मानव मेजबान में जीवित रहने के लिए विकसित हुआ है, जटिलता का एक अतिरिक्त स्तर जोड़ता है। यहां, हम गोनोकोकल विकास और वांछित जीन अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए पर्याप्त एक परिभाषित धातु-सीमित माध्यम की तैयारी का वर्णन करते हैं। यह विधि अन्वेषक को लोहे या जस्ता के परिभाषित स्रोतों के साथ मीडिया को पूरक करते हुए अवांछित स्रोतों से लोहे और जस्ता को चेलेट करने की अनुमति देती है, जिसकी तैयारी भी वर्णित है। अंत में, हम तीन प्रयोगों की रूपरेखा तैयार करते हैं जो धातु-विनियमित गोनोकोकल जीन के प्रोटीन उत्पादों की विशेषता में मदद करने के लिए इस मीडिया का उपयोग करते हैं।

Introduction

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नेसेरिया गोनोरिया आम यौन संचारित संक्रमण गोनोरिया का कारण बनता है। संक्रमण के दौरान, रोगजनक निसेरिया धातु-उत्तरदायी जीन का प्रदर्शनों की सूची व्यक्त करते हैं जो बैक्टीरिया को मानव मेजबान1,2,3द्वारा धातु प्रतिबंध प्रयासों को दूर करने की अनुमति देता है। आयरन और जिंक जैसी धातुओं का पता लगाना कई सेलुलर प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जैसे उत्प्रेरक साइटों में एंजाइमों के लिए बाध्यकारी, रेडऑक्स प्रतिक्रियाओं में भागीदारी, और विभिन्न प्रोटीन4,5 में संरचनात्मक कारकोंकेरूप में। धातु-सीमित स्थितियों में, धातु-उत्तरदायी लोकी को दबाया जाता है और उनके परिणामी प्रोटीन इन पोषक तत्वों के अधिग्रहण में सहायता कर सकते हैं। इन जीन और प्रोटीन का लक्षण वर्णन अन्वेषक के लिए एक अनूठी तकनीकी चुनौती प्रस्तुत करता है। धातु आयनों को बैक्टीरिया से रोका जाना चाहिए ताकि उनके देशी लोकी से इन जीनों के प्रतिलेखन को प्रेरित किया जा सके, लेकिन धातु से लदे मीडिया से इन आयनों के प्रभावी चेलेशन को अनुकूलित करना मुश्किल हो सकता है। स्रोत पानी के विभिन्न धातु प्रोफाइल और पाउडर सामग्री के अंतर्निहित लॉट-टू-लॉट भिन्नता6 का मतलब है कि एक समृद्ध माध्यम से एक विशिष्ट धातु को हटाने के लिए आवश्यक चेलेटर की मात्रा विभिन्न स्थानों, घटक विक्रेताओं के बीच भिन्न होगी, और यहां तक कि रासायनिक इन्वेंट्री के रूप में एक प्रयोगशाला के भीतर समय के साथ भी बदल दिया जाता है।

इस चुनौती को दरकिनार करने के लिए, हम एक परिभाषित माध्यम की तैयारी का वर्णन करते हैं जिसे समाधान से ट्रेस धातुओं को हटाने की तैयारी के दौरान चेलेक्स-100 रेसिन के साथ इलाज किया जाता है। यह माध्यम गोनोकोकस के विकास के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त पोषक तत्व घने है, जो मानव मेजबान के बाहर संस्कृति के लिए मुश्किल है, और अन्वेषक को अपने स्वयं के परिभाषित स्रोतों और सांद्रता के अलावा एक विशिष्ट धातु प्रोफ़ाइल पेश करने की अनुमति देता है धातुओं. समाप्त मध्यम करने के लिए वांछित धातुओं के नियंत्रित ऐड-बैक की विधि प्रयोगात्मक स्थिरता को बढ़ाती है और जल स्रोत और रासायनिक लॉट संख्या जैसे कारकों की परवाह किए बिना मजबूत, प्रतिकृति प्रयोगों के लिए अनुमति देती है। इसके अलावा, इस मीडिया को केवल मामूली संशोधनों के साथ या तो तरल या ठोस के रूप में तैनात किया जा सकता है, जिससे यह काफी बहुमुखी हो जाता है।

इस माध्यम की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, हम गोनोकोकल विकास के लिए इसके उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं और धातु-उत्तरदायी नेसेरिया जीन की विशेषता के लिए तीन सफल प्रयोगों का वर्णन करते हैं। सबसे पहले, हम धातु-समाप्त या पूरक संस्कृतियों से गोनोकोकल संपूर्ण-कोशिका लिसेट्स तैयार करते हैं और धातु-उत्तरदायी लोकी से प्रोटीन उत्पादन के परिवर्तनीय स्तरों को प्रदर्शित करते हैं। हम तो एक जस्ता प्रतिबंधित विकास परख जिसमें गोनोकोकल विकास विशिष्ट, useable जस्ता स्रोतों के पूरक द्वारा नियंत्रित किया जाता है रूपरेखा । अंत में, हम बाध्यकारी परख दिखाते हैं जो धातु-उत्तरदायी सतह रिसेप्टर्स को व्यक्त करने वाली पूरी गोनोकोकल कोशिकाओं को प्रदर्शित करते हैं जो अपने संबंधित धातु युक्त लिगांड के लिए बाध्यकारी हैं। इन रिसेप्टर्स की सफल सतह प्रस्तुति के लिए धातु-समाप्त माध्यम में वृद्धि की आवश्यकता होती है।

वर्तमान प्रोटोकॉल विशेष रूप से नेसेरिया गोनोरियाके लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन कई अन्य जीवाणु रोगजनक संक्रमण7के दौरान धातु अधिग्रहण रणनीतियों को नियोजित करते हैं, इसलिए इस प्रोटोकॉल को अन्य बैक्टीरिया में धातु होमोस्टोसिस के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस मीडिया और अन्य बैक्टीरिया में उपयोग के लिए इन प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने की संभावना धातु चेलेटर सांद्रता के मामूली संशोधन और/या Chelex-१०० के साथ उपचार के समय की आवश्यकता होगी, के रूप में अंय बैक्टीरिया gonococcus की तुलना में थोड़ा अलग धातु आवश्यकताओं हो सकता है । आयरन और जिंक वर्णित जांच के लिए चिंता की प्राथमिक धातुएं हैं, लेकिन अन्य धातुओं (जैसे, मैंगनीज) को बैक्टीरिया के लिए महत्वपूर्ण के रूप में प्रदर्शित किया गया है, जिसमें निसेरिया8,9,10,11, 12शामिल हैं। इसके अलावा, यूकेरियोटिक सेल कल्चर वर्क में धातु के लक्षणों के लिए इसी तरह के तरीकों का वर्णन किया गया है, जिस पर भी विचार किया जा सकता है। 13

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Protocol

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1. चेलेक्स-उपचारित परिभाषित मध्यम (सीडीएम) स्टॉक सॉल्यूशंस की तैयारी

  1. स्टॉक समाधान मैं
    1. 1 एल की अंतिम मात्रा में पानी में NaCl (233.8 ग्राम), कश्मीर2एसओ4 (40.0 ग्राम), एनएच4सीएल (8.8 ग्राम), के2एचएमओ4 (13.9 ग्राम), और KH2पीओ4 (10.9 ग्राम) को मिलाएं।
    2. फिल्टर समाधान को स्टरलाइज करता है और 50 मीटर शंकुट्यूब में बहाता है।
    3. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. स्टॉक सॉल्यूशन II
    1. थियामीन एचसीएल (0.2 ग्राम), थियामीन पायरोफॉस्फेट-सीएल (0.05 ग्राम), कैल्शियम पेंटोथेनेट (0.19 ग्राम), और बायोटिन (0.3 ग्राम) में 50% (vol/vol) इथेनॉल को 1 एल की अंतिम मात्रा में मिलाएं।
    2. अलीकोट 50 मीटर शंकुट्यूब में और स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर।
  3. स्टॉक सॉल्यूशन III
    1. एल-एस्पार्टेट (4.0 ग्राम), एल-ग्लूटामेट (10.4 ग्राम), एल-आर्जिनिन (1.2 ग्राम), ग्लाइसिन (0.2 ग्राम), एल-सेरीन (0.4 ग्राम), एल-ल्यूसिन (0.7) को मिलाएं 2 ग्राम), एल-इसोल्यूसिन (0.24 ग्राम), एल-वेलिन (0.48 ग्राम), एल-टायरोसिन (0.56 ग्राम), एल-प्रोलिन (0.4 ग्राम), एल-ट्रिप्टोफान (0.64 ग्राम), एल-थ्रेनोइन (0.4 ग्राम), एल-फेनीलालाइन (0.2 ग्राम), एल-शतावरीन-एच2ओ (0.2 ग्राम), एल-ग्लूटामाइन (0.4 ग्राम), एल-हिस्टिडीन-एचसीएल (0.2) जी), एल-मेथिओनीन (0.12 ग्राम), एल-एलेनिन (0.8 ग्राम), एल-लाइसिन (0.4 ग्राम), और 500 मीटर में ग्लूटाथिएक (0.36 ग्राम) कम हो गया।
    2. एल-साइस्टीन (0.44 ग्राम) और एल-सिस्टिन (0.28 ग्राम) को 1 एम एचसीएल की न्यूनतम मात्रा (~ 1 mL) में भंग करें और उपरोक्त अमीनो एसिड समाधान में जोड़ें।
    3. समाधान के पीएच को 10 एन नाओएच के साथ तब तक समायोजित करें जब तक कि सभी कण भंग न हो जाए। अंतिम पीएच 10.0-11.0 होगा।
    4. अंतिम मात्रा को 1 एल में डिओनाइज्ड पानी के साथ लाएं।
    5. फ़िल्टर समाधान को स्टरलाइज करता है और 250 मीटर वॉल्यूम में एलिकोट करता है।
    6. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. स्टॉक समाधान चतुर्थ
    1. ग्लूकोज (200 ग्राम) को डिओनाइज्ड पानी में 1 एल की अंतिम मात्रा में भंग करें।
      नोट: ग्लूकोज को भंग करने के लिए समाधान को गर्म करना पड़ सकता है।
    2. फिल्टर स्टरलाइज करें और समाधान को 50 मीटर शंकुट्यूब में उद्धृत करें।
    3. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. स्टॉक सॉल्यूशन V
    1. 1 एल की अंतिम मात्रा में डिओनाइज्ड पानी में हाइपोक्सेंथिन (5.0 ग्राम), उरासिल (5.0 ग्राम), और नाओएच (4.0 ग्राम) को मिलाएं।
    2. 50 मीटर शंकुट्यूब में फ़िल्टर स्टरलाइज और एलिकोट करें।
    3. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. समाधान छठी
    1. डिओनाइज्ड पानी में 1 एम सीएसीएल2-2एच2ओ (147 जी/एल) समाधान तैयार करें। फिल्टर बंध्याकरण और कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर ।
  7. स्टॉक सॉल्यूशन सातवीं
    1. डिओनाइज्ड पानी में 1 एम हाइड्रोस एमजीएसओ4 सॉल्यूशन तैयार करें। फिल्टर बंध्याकरण और आरटी पर स्टोर ।
  8. स्टॉक समाधान आठवीं
    1. डिओनाइज्ड पानी में 1 एम नाहको3 समाधान तैयार करें। फिल्टर बंध्याकरण और आरटी पर स्टोर ।

2. 4x बाँझ ध्यान केंद्रित करने और 1x सीडीएम की तैयारी

नोट: इस प्रक्रिया को या तो एसिड इलाज बाँझ कांच के बर्तन या प्लास्टिक में किया जाना है ताकि समाधानों में धातुओं की लीचिंग को रोका जा सके।

  1. स्टॉक समाधान I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL), और वी (20 mL) HEPES के 20.0 ग्राम के साथ गठबंधन और मिश्रण करने के लिए हलचल.
  2. पीएच को 7.4 पर समायोजित करें, फिर अंतिम मात्रा को डीओनाइज्ड पानी के साथ 500 मीटर तक लाएं।
  3. चेलेक्स-100 राल को 4x बाँझ ध्यान में जोड़ने से पहले प्रिजर्वेटिव को हटाने के लिए 1 एल डिओनाइज्ड पानी में धोएं। यह 1 एल deionized पानी के लिए राल के 50 ग्राम जोड़कर और कम से कम 1 घंटे के लिए सरगर्मी द्वारा ऐसा करें वैक्यूम छानने से पानी निकालें और चरण 2.4 के लिए इस धोया राल का उपयोग करें।
  4. 50 ग्राम रेसिन जोड़ें और धीरे-धीरे बिल्कुल 90 00 के लिए हलचल करें।
  5. फिल्टर नसबंदी द्वारा राल निकालें और 4x बाँझ ध्यान 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. सीडीएम की 1x कार्य एकाग्रता तैयार करने के लिए, पहले बाँझ deionized पानी के साथ 4x ध्यान पतला, तो समाधान छठी (1x समाधान के 500 मीटर प्रति 125 μL), समाधान सातवीं (535 μL प्रति 500 mL), और समाधान आठवीं (10 mL प्रति 500 mL) जोड़ें।
    नोट: हालांकि सभी स्टॉक समाधानों को पहले ही निष्फल कर दिया गया है, तैयारी के बाद 1x समाधान को फिर से फ़िल्टर करने की सिफारिश की जाती है।

3. सीडीएम प्लेट की तैयारी

नोट: नीचे नुस्खा प्लेटों के लिए 1 एल मीडिया बनाता है, लेकिन यह सबसे अच्छा है इन छोटे संस्करणों में तैयार करते हैं । सब कुछ आनुपातिक रूप से नीचे तराजू ।

  1. धोया गया अगारोज
    1. 1 एल deionized पानी में अगारोज के 50 ग्राम भंग, 1 घंटे के लिए सरगर्मी।
    2. आरटी में 15 मिनट के लिए 1,200 x ग्राम पर एक अपकेंद्रित्र बोतल और अपकेंद्री के समाधान को स्थानांतरित करें। ध्यान से सुपरनेटेंट डालना और त्यागना।
    3. अगारोज गोली को फिर से निलंबित करने के लिए पर्याप्त डिओनाइज्ड पानी जोड़ें, फिर 1 एल फ्लास्क में स्थानांतरित करें। deionized पानी के साथ 1 एल की एक अंतिम मात्रा में लाओ और फिर हलचल और चरण ३.१.२ में के रूप में अपकेंद्रित्र । अधिस्थान त्यागें।
    4. गोली को फिर से निलंबित करने के लिए पर्याप्त 100% इथेनॉल जोड़ें, फिर एक नए 1 एल फ्लास्क में स्थानांतरित करें। इथेनॉल के साथ 1 एल की अंतिम मात्रा में लाएं। 3.1.2 चरण के रूप में हिलाओ और अपकेंद्रित्र।
    5. दोहराएं चरण 3.1.4।
    6. फिर से निलंबित करने के लिए अगारोज गोली में मेथनॉल जोड़ें, फिर 1 एल फ्लास्क में स्थानांतरित करें। मेथनॉल के साथ 1 एल की अंतिम मात्रा में लाएं। 3.1.2 चरण के रूप में हिलाओ और अपकेंद्रित्र।
    7. दोहराएं चरण 3.1.6।
    8. स्थानांतरण एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लाइन में खड़ा एक ट्रे के लिए agarose धोया और एक धुएं हुड में सूखने के लिए अनुमति देते हैं । सूखते समय, दीर्घकालिक भंडारण के लिए धातु मुक्त कंटेनर में स्थानांतरित करें।
  2. 10 ग्राम धोया अगारोज और आलू स्टार्च के 5 ग्राम deionized पानी के 750 ग्राम के लिए जोड़ें।
  3. 121 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए ऑटोक्लेव, वायुमंडलीय दबाव से ऊपर 100 केपीए।
  4. मीडिया को ~ 65 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने की अनुमति दें, फिर 4X सीडीएम के 250 मीटर, समाधान VI के 250 माइक्रोन, समाधान सातवीं के 1.07 मीटर और समाधान आठवीं के 20 मीटर जोड़ें।
  5. यदि वांछित हो, तो प्लेटडालने से पहले पसंद की धातुओं को जोड़ें। धातु मुक्त स्थितियों को बनाए रखने के लिए चेलेटर का जोड़ आवश्यक नहीं है।
  6. पेट्री व्यंजन में डालो और जमना करने के लिए अनुमति देते हैं।

4. नेसेरिया गोनोरिया की मेटल लिमिटेड ग्रोथ

नोट: अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए, सीडीएम के टीका से पहले बैक्टीरिया को धातु तनाव देना आवश्यक नहीं है। सीडीएम में प्रारंभिक दोहरीकरण कदम और बाद में कमजोर पड़ने उनके आंतरिक लोहा और जस्ता भंडार के gonococci को समाप्त करने के लिए पर्याप्त है । जैसे, निम्नलिखित प्रक्रिया के पहले दो चरण जीसी मध्यम आधार से बने आगर प्लेटों का उपयोग करके आयोजित किए जाते हैं जिन्हें केलॉग के पूरक I14 और 12.5 माइक्रोएम फे (कोई3)3के साथ पूरक किया गया है। यदि शुरुआती धातु तनाव वांछित है, तो हम एफई (कोई3)3 के बिना जीसी मध्यम आधार प्लेटें तैयार करने और 5 माइक्रोन टीपेन (एन, एन, एन,एन,एन',एन-टेट्राइस (2-पाइरिडिलमेथिल) एथिलीनडायमाइन) के साथ जिंक चेलेशन के लिए या लोहे के चेलेशन के लिए 10 माइक्रोएम डिफेक्टोक्समाइन तैयार करने की सलाह देते हैं। सभी ऊष्मायन 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जाताहै।

  1. प्रयोग से दो दिन पहले, दिन-2 पर, जीसी मध्यम प्लेटों पर फ्रीजर स्टॉक से लकीर gonococci और कोई 24 घंटे से अधिक के लिए इनक्यूबेट ।
  2. दिन-1 पर, ताजा जीसी मध्यम प्लेटों पर लकीर एकल कालोनियों । कोशिश करें कि विकास प्रयोग से पहले इसे 14-16 घंटे करें।
  3. प्रयोग के दिन, एक एसिड धोया 125 mL चकित साइडआर्म फ्लास्क(पूरक चित्रा 1)के लिए 5-10 mL 1x सीडीएम जोड़ें और एक Klett रंगेमीटर खाली करने के लिए इसका उपयोग करें।
  4. स्वस्थ, एकल उपनिवेशों से सीडीएम का टीका लगाने के लिए बाँझ, कपास-इत्तला देने वाली झाड़ू का उपयोग करें। 20 Klett इकाइयों के लिए लक्ष्य।
    नोट: यदि एक Klett रंगका उपलब्ध नहीं है, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के रूप में अच्छी तरह से उपयुक्त है । ओडी के लिए Klett इकाइयों के लिए कोई सार्वभौमिक रूपांतरण फार्मूला है, लेकिन एक मोटा गाइड उपलब्ध है(https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales)
  5. लगभग एक बड़े पैमाने पर दोहरीकरण (40 Klett इकाइयों) तक 250 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ इनक्यूबेट। यह 1-2 घंटे के बीच ले जाना चाहिए।
  6. इस बिंदु पर, संस्कृतियों को प्रारंभिक संस्कृति घनत्व के आधे तक पहुंचने के लिए सीडीएम की पर्याप्त मात्रा के अतिरिक्त द्वारा पतला किया जाता है (उदाहरण के लिए, यदि संस्कृति का 5 mL 20 से 40 Klett इकाइयों तक चला गया है, तो सीडीएम का 15 मिलील इसे वापस 10 केलेट इकाइयों तक लाएगा) और विकास जारी रहेगा चरण 4.5 के रूप में। बैक कमजोर पड़ने, धातु उपचार आदि की विशिष्ट मात्रा डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों पर निर्भर करती है। हम नीचे तीन उदाहरण देते हैं (धारा 5, 6, या 7)।

5. धातु उत्तरदायी जीन उत्पादों का पश्चिमी विश्लेषण

  1. चरण 4.6 से शुरू, सीडीएम के तीन खंडों के साथ संस्कृतियों को पतला करें (उदाहरण के लिए, सीडीएम के 15 मिलीग्राम यदि 5 मिलील से शुरू होता है)। इस बिंदु पर, यदि वांछित हो तो धातु उपचार जोड़ें।
    1. आयरन सेंसिंग जीन 12.5 माइक्रोन फे (कोई3)3के साथ दबाया जा सकता है। जिंक-उत्तरदायी जीन को 10 माइक्रोन जेडएनएसओ4के साथ डिप्रेस किया जा सकता है ।
    2. अतिरिक्त लोहा या जस्ता तनाव आवश्यक नहीं है, क्योंकि मीडिया पहले से ही समाप्त हो गया है, इसलिए उत्तरदायी जीन पहले से ही व्यक्त किए जाएंगे। यदि आगे तनाव वांछित है, तो हम 1-2 माइक्रोन से अधिक deferoxamine या TPEN की सलाह देते हैं, क्योंकि अत्यधिक तनाव संस्कृतियों को बढ़ने से रोकदेगा।
  2. 4 एच के लिए चरण 4.5 के रूप में संस्कृतियों को बढ़ाएं और नमूनों के अंतिम सेल घनत्व को रिकॉर्ड करें। कम धातु पर बल दिया संस्कृतियों उच्च अंतिम घनत्व के लिए विकसित होगा ।
  3. संस्कृतियों को उपयुक्त घनत्व के लिए मानकीकृत करें और lysates तैयार करें।
    1. संस्कृति के 1 mL में 100 Klett इकाइयों के बराबर घनत्व के लिए पूरे सेल lysates मानकीकृत। इसे पूरा करने के लिए, अपने नमूने के Klett इकाई घनत्व द्वारा 100 विभाजित करें। आपको जो नंबर मिलता है वह संस्कृति की मात्रा, एमएल में है जिसका उपयोग सेल पैलेट बनाने के लिए किया जाएगा।
  4. ब्याज के प्रोटीन की जांच के लिए मानक एसडी-पेज और वेस्टर्न ब्लॉटिंग प्रक्रियाओं15 का पालन करें ।

6. धातु सीमित विकास परख

नोट: ये परख प्रीमेड ग्रोथ प्रीमिक्स का वर्णन करते हैं। इन घोला जासकता है की तैयारी धारा 8 में वर्णित है।

  1. चरण 4.5 में बड़े पैमाने पर दोहरीकरण के दौरान, 10x प्रीमिक्स के साथ 96 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के कुओं का पूर्वनिर्धारित करें। इसके अतिरिक्त, रिक्त स्थान के रूप में सेवा करने के लिए तीन कुओं को नामित करें। इन कुओं में 10x प्रीमिक्स के 10 माइक्रोन और सीडीएम के 90 माइक्रोन जोड़ें।
  2. एक बार साइडआर्म फ्लास्क में संस्कृतियों दोगुनी हो गई है, माइक्रोप्लेट में एक अप्रयुक्त अच्छी तरह से प्रत्येक संस्कृति के 100 μL जोड़ें और 600 एनएम (OD600)पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने। यह एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में क्यूवेट के साथ किया जा सकता है, लेकिन एक परख के भीतर बड़ी संख्या में उपभेदों के साथ यह बोझिल हो सकता है और आम तौर पर सलाह नहीं दी जाती है जब तक कि आपका स्पेक्ट्रोफोटोमीटर सीधे साइड आर्म फ्लास्क(पूरक चित्रा 2)के हाथ से माप नहीं सकता है।
    1. ओडी को मापते समय, गोनोकोची को व्यवहार्य बनाए रखने के लिए इनक्यूबेटर में फ्लास्क को वापस रखें।
  3. संस्कृतियों को ओडी600 = 0.02 पर लाने के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने की सही मात्रा की गणना करें। 10x प्रीमिक्स का ओडी पर नगण्य प्रभाव पड़ता है और इसे गणना से छोड़ा जा सकता है।
  4. छोटी संस्कृति ट्यूबों में सीडीएम के साथ संस्कृतियों को पतला करें और प्लेट में 1x में 10x प्रीमिक्स को पतला करने के लिए पर्याप्त मात्रा जोड़ें। अगर कोई प्लेट वार्मर उपलब्ध है तो काम करते समय प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  5. एक प्लेट रीडर में मिलाते हुए के साथ 8-12 घंटे के लिए प्लेट इनक्यूबेट, वांछित अंतराल पर ओडी600 माप ले।

7. बाहरी झिल्ली धातु ट्रांसपोर्टरों द्वारा लिगामेंट बाइंडिंग का पता लगाना

  1. चरण 5.1 में वांछित संस्कृतियों का इलाज करें, फिर 4 एच के लिए मिलाते हुए इनक्यूबेट करें।
  2. 4 एच मार्क से कुछ ही समय पहले, फिल्टर पेपर के तीन टुकड़ों और एक डॉट ब्लॉट उपकरण(पूरक चित्रा 3)में फिट होने के लिए आवश्यक अनुमानित आकार में नाइट्रोसेल्यूलोज का एक टुकड़ा काट लें। निट्रोसेल्यूलोज को डिओनाइज्ड पानी में प्रीसोल्ड करें, फिर नाइट्रोसेल्यूलोज के नीचे फिल्टर पेपर के साथ उपकरण को इकट्ठा करें।
  3. 4 घंटे में, सेल घनत्व रिकॉर्ड करें और एक उपयुक्त अंतिम घनत्व के लिए मानकीकरण करें। चरण 5 में सेल लिसेट्स की तैयारी के लिए उपयोग किए जाने वाले घनत्व का ~ 10% उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। उदाहरण के लिए, यदि लिसेट के लिए 1 00 केयू में 100 केयू का उपयोग कर रहे हैं, तो इसका मतलब है कि इन धब्बों के लिए 1 एमएल में ~ 10 केयू। गणना अन्यथा 5.3.1 में वर्णित है, और संस्कृतियों को सीधे गणना की गई मात्रामें नाइट्रोसेल्यूलोस में जोड़ दिया जाता है बजाय इसके कि वे लिसेट्स में बनाई जाती हैं।
  4. नाइट्रोसेल्यूलोज पर पिपेट सेल संस्कृतियां और फिल्टर पेपर को सभी तरल को अवशोषित करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देती हैं।
  5. उपकरण को अलग करें, दाग को सूखने दें, और ट्रिस-बफर ्ड लवलाइन में 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन या नॉनफैट दूध (w/v) में 1 घंटे के लिए नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को अवरुद्ध करें।
  6. नाइट्रोसेल्यूलोज के तहत लीक प्रूफ सील बनाने के लिए फिल्टर पेपर को पैराफिन फिल्म के साथ बदलते हुए डॉट ब्लॉट उपकरण को फिर से इकट्ठा करें ।
  7. 1 घंटे के लिए अवरोधक और जांच कोशिकाओं में 0.2 माइक्रोन के लिए ब्याज की धातु बाध्यकारी लिगांड पतला।
  8. वैक्यूम के साथ तरल को साइफन करें, दाग धोएं, फिर सिग्नल16विकसित करने के लिए मानक प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करें। वॉश स्टेप्स में या बाहर उपकरण के बाहर किया जा सकता है।

8. ट्रांसफरिन, S100A7, और Calprotectin, और 10x प्रीमिक्स की तैयारी के धातु लोडिंग

नोट: सीडीएम तैयारी के साथ के रूप में, समाधान तैयार करने के लिए एसिड धोया ग्लास या प्लास्टिक का उपयोग करें।

  1. प्रारंभिक बफर (100 एम ट्रिस, 150 एमएम नैल, 20 एम एम नाहको3,पीएच = 8.4) में 10 मिलीग्राम/एमएल (125 माइक्रोन) पर मानव स्थानांतरित करें। S100A7 और calprotectin 20 mM Tris, १०० mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol, और 1 mM CaCl2,पीएच = ८.०) से मिलकर बफर में निलंबित कर रहे हैं ।
    1. 30% आयरन संतृप्ति प्राप्त करने के लिए ट्रांसफरिन समाधान में फेड्रेशन सॉल्यूशन (100 एमएम सोडियम साइटेट, 100 एमएम नाहको3,5 एमएम फेसीएल3-6एच2ओ, पीएच = 8.4) जोड़ें, यदि 10 मिलीग्राम/एमएल पर बनाया जाता है तो 5 एमएल ट्रांसफरिन के लिए उपयुक्त है।
    2. 25% संतृप्ति बनाने के लिए प्रोटीन में 50% मोलर अनुपात में ZnSO4 जोड़ें या कैल्प्रोफिन (प्रत्येक प्रोटीन अणु में दो धातु बाध्यकारी साइटें हैं)। 100 माइक्रोन S100A7 या 50 माइक्रोन ZnSO4 के साथ calprotectin की तैयारी का इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. दोनों मामलों के लिए, धातु लोडिंग के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए एंड-ओवर-एंड मिश्रण की अनुमति दें।
  2. डायलिसिस बफर (40 एमएम ट्रिस, 150 एमएम नैक्ल, 20 एमएम नाहको3,पीएच = 7.4) के 4 एल तैयार करें। इसे दो अलग-अलग 2 एल वॉल्यूम में विभाजित करें और एक को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. आरटी में 4 घंटे के लिए पहले बफर वॉल्यूम के खिलाफ सिरिंज और डायलिसिस का उपयोग करके डायलिसिस कैसेट में धातु लोडेड प्रोटीन जोड़ें।
  4. कैसेट को दूसरे बफर वॉल्यूम में ले जाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर डायलिसिस करें। इन कदमों के बाद किसी भी अनबाउंड धातु को हटा देना चाहिए।
    नोट: हम डायलिसिस के बाद प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करने के लिए एक बिकिरोनिक एसिड परख की सलाह देते हैं।
  5. एकमात्र लोहे के स्रोत के रूप में स्थानांतरित उपयोग के लिए प्रीमिक्स में 10x ट्रांसफर का उपयोग करें।
    1. पीबीएस में क्रमशः 75 माइक्रोन और 30 माइक्रोन के लिए 30% मानव फे-ट्रांसफरिन और गोजातीय एपीओ-ट्रांसफरिन (मानव हस्तांतरण के लिए वर्णित 125 माइक्रोन पर तैयार) को पतला करके इस प्रीमिक्स को तैयार करें। एक सकारात्मक नियंत्रण प्रीमिक्स 75 माइक्रोन फे (कोई3)3के साथ 30% फे-ट्रांसफरिन की जगह लेता है, और एक नकारात्मक नियंत्रण प्रीमिक्स किसी भी जोड़े हुए लोहे को छोड़ देता है, केवल गोजातीय एपो-ट्रांसफरिन को बनाए रखता है। विकास परख में, इन में से 10 μL पतला संस्कृति के 90 μL के साथ केंद्रित है। अंतिम सांद्रता 7.5 माइक्रोन 30% मानव फे-ट्रांसफरिन और 3 माइक्रोन गोजातीय एपीओ-ट्रांसफर हैं।
  6. S100A7 के लिए ट्रांसफरइन 10x प्रीमिक्स के संशोधित संस्करण या एकमात्र जिंक स्रोत के रूप में कैल्प्रोटेक्टिन उपयोग का उपयोग करें।
    1. एक सकारात्मक नियंत्रण प्रीमिक्स के लिए, 50 μM ZnSO4 को ट्रांसफर इन प्रीमिक्स में शामिल करें। नकारात्मक नियंत्रण के लिए, 50 माइक्रोन टीपेन को शामिल करें और जिंक को छोड़ दें। फिर, हर नमूना अच्छी तरह से जरूरत के लिए इनमें से प्रत्येक के 10 μL ले लो, और एक नई ट्यूब के लिए है कि मात्रा ले । बाँझ PBS की ज्यादा मात्रा के रूप में इस आधे में जोड़ें । उदाहरण के लिए, यदि 10 कुओं को सकारात्मक नियंत्रण प्रीमिक्स प्राप्त होगा, तो प्रीमिक्स के 100 माइक्रोन लें, इसे एक नई ट्यूब पर ले जाएं, और पीबीएस के 50 माइक्रोन जोड़ें। नेगेटिव - कंट्रोल के लिए भी ऐसा ही करें।
    2. S100A7 या calprotectin प्रीमिक्स बनाने के लिए, अच्छी तरह से जरूरत के प्रति नकारात्मक नियंत्रण प्रीमिक्स के 10 μL ले, एक नई ट्यूब के लिए कदम है, और 25% Zn-S100A7 या calprotectin की मात्रा आधा जोड़ें । विकास परख में, संस्कृति के 85 माइक्रोन के साथ प्रीमिक्स और पतला के 15 μL का उपयोग करें। ट्रांसफरिन के लिए अंतिम सांद्रता चरण 8.5 में समान रहती है, जिसमें जेडएन, टीपेन या S100A7/calprotectin का एक जोड़ा 5 माइक्रोन होता है।

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Representative Results

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नेसेरिया गोनोरिया के विकास के लिए ट्रेस धातुओं के अभाव में एक विशिष्ट परिभाषित माध्यम विकसित किया गया था और धातु-उत्तरदायी जीन और उनके जीन उत्पादों के लक्षण वर्णन के लिए लागू किया गया था। अनुकूलित प्रोटोकॉल में, मीडिया की धातु प्रोफ़ाइल को धातु लक्ष्य के मिटरेशन के बजाय अन्वेषक के विवेक पर धातुओं को वापस जोड़कर नियंत्रित किया जाता है, जिससे प्रयोगशाला से प्रयोगशाला और प्रयोग करने के लिए नियंत्रण और स्थिरता में वृद्धि होती है। इस मीडिया को तरल और ठोस दोनों राज्य में नियोजित किया जा सकता है, जिससे यह कई प्रयोगात्मक सेटअप में बहुमुखी हो जाता है।

चर धातु सांद्रता में अंतर प्रोटीन उत्पादन शामिल प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बों(चित्रा 1)में देखा जा सकता है । छवि जिंक-उत्तरदायी बाहरी झिल्ली ट्रांसपोर्टरों टीडीएफजे और टीडीएफएच को दिखाती है, जिन्हें टीपेन द्वारा जिंक चेलेशन के जवाब में अपरेच किया गया था। TdfJ अनिवार्य रूप से पता लगाने योग्य था जब जस्ता मीडिया में वापस जोड़ा गया था, और TdfH दुर्लभ था । इसके अलावा, टीडीएफजे प्रमोटर को लोहे से दमित करने के बजाय प्रेरित करने के लिए जाना जाता है। यह भी दाग में दिख रहा है। इन धब्बों ने लोडिंग नियंत्रण के रूप में लोहे-उत्तरदायी लिपोप्रोटीन टीबीबी2 का उपयोग किया। आयरन ऐड बैक की शर्तों में टीबीपीबी का उत्पादन कम हुआ।

धातु प्रतिबंधित विकास परखों गोनोकोकस(चित्रा 2)द्वारा विशिष्ट, परिभाषित जस्ता स्रोतों के उपयोग को प्रदर्शित करता है । चित्रा 2 से पता चलता है एन गोनोरिया Zn-भरी हुई calprotectin (सीपी) की उपस्थिति में बढ़ रही है, जो जस्ता-उत्तरदायी TdfH17,18की कार्रवाई की आवश्यकता है । जब कोई उपयोग योग्य जस्ता स्रोत उपलब्ध नहीं था, या तो कोई जस्ता ऐड-बैक के माध्यम से या टीडीएफएच की अनुपस्थिति से, विकास प्रतिबंधित था । चित्रा 2बी S100A7 की उपस्थिति में इसी तरह के परिणाम दिखाता है, जो बाहरी झिल्ली ट्रांसपोर्टर टीडीएफजेके 19उत्पादित होने पर एकमात्र जिंक स्रोत के रूप में काम कर सकता है। अकेले TPEN की उपस्थिति में या जब TdfJ अनुपस्थित था, विकास बाधित था, लेकिन Zn-S100A7 के अलावा एक TdfJ पर निर्भर तरीके से वृद्धि बरामद की । अंत में, चित्रा 2सी एक प्रयोगात्मक त्रुटि दिखाता है। इस उदाहरण में, गोनोकोकल संस्कृतियों का कमजोर पड़ना कदम माइक्रोप्लेट में कुल संस्कृति की मात्रा के सापेक्ष आंतरिक जिंक पूल के बैक्टीरिया को कम करने के लिए पर्याप्त नहीं था। इस प्रकार, नकारात्मक नियंत्रण में वृद्धि वांछित ओडी से अधिक हो गई।

अपने संबंधित लिगामेंट के लिए पूरे गोनोकोकल कोशिकाओं के विशिष्ट बाध्यकारी धातु सीमित और धातु परिपूर्ण स्थितियों(चित्रा 3)में तैयार संस्कृतियों से डॉट ब्लॉट द्वारा प्रदर्शित किया जाता है। चित्रा 3ए, बी से पता चलता है कि सीडीएम में उगाई गई गोनोकोची जस्ता की कमी के परिणामस्वरूप क्रमशः टीडीएफएच और टीडीएफजे का उत्पादन करते समय सीपी और S100A7 को बांधने में सक्षम थी। चित्रा 3सी ट्रांसफरइन बाइंडिंग की तुलना करता है, जो आयरन सेंसिंग जीन टीबीपीए और टीबीपीबी20से बने कॉग्नेट प्रोटीन द्वारा पूरा किया जाता है, जब गोनोकोची अकेले सीडीएम बनाम जीसी मीडियम शोरबा में आयरन चेलेटर डेडिकैलॉक्समाइन के साथ इलाज किया जाता है । यह आंकड़ा सीडीएम में उगाई जाने वाली संस्कृतियों द्वारा स्थानांतरित होने के बाध्यकारी में वृद्धि को दर्शाता है, जो चेलेटेड जीसी शोरबा की तुलना में सीडीएम की अधिक लौह-समाप्त प्रकृति के कारण प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर का संकेत है ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि पश्चिमी दाग धातु उत्तरदायी प्रोटीन के अंतर उत्पादन दिखा । (A) नेसेरिया गोनोरिया जंगली प्रकार तनाव FA19 सीडीएम में ZnSO4,Fe (NO3)3,या संकेत सांद्रता में TPEN के साथ पूरक में उगाया गया था । उपचार के बाद, संस्कृतियों को 4 घंटे के लिए विकसित किया गया था इससे पहले कि मानकीकृत घनत्व के पूरे सेल lysates का उत्पादन किया गया और SDS-पृष्ठ और पश्चिमी धब्बा के अधीन थे । टीडीएफजे के लिए अंतर उत्पादन का स्तर, जो जिंक द्वारा दमित और लोहे द्वारा प्रेरित दोनों है, को जिंक अतिरिक्त/कमी और लोहे के अलावा के जवाब में स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है । (ख)पश्चिमी दाग के लिए सापेक्ष संकेत तीव्रता घनत्व के माध्यम से निर्धारित किया गया । यह आंकड़ा मौराकी एट अल19से अनुकूलित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: गोनोकोची का जिंक-प्रतिबंधित विकास। जंगली प्रकार तनाव FA19, या इस तनाव है कि tdfJ या tdfH का उत्पादन नहीं करते के आइसोजेनिक म्यूटेंट,(ए)अनुपचारित सीडीएम में उगाया गया जब तक घातीय चरण तक पहुंच गया था,(ख)तो वापस ओडी६०० = ०.०२ और(सी)ओडी६०० = ०.१ को पतला । में नमूनों का इलाज कैल्प्रोटेक्टिन (ऊपर) या कोई अतिरिक्त जिंक (नीचे) वाले प्रीमिक्स के साथ किया गया और 8 घंटे के लिए उगाया गया । बी और सी में नमूनों को मुफ्त जिंक, कोई जस्ता (5 μM TPEN), या S100A7 युक्त प्रीमिक्स के साथ पूरक किया गया था, और इन स्थितियों में 6 घंटे की वृद्धि के लिए उगाया गया था केवल एक उपयोगी जस्ता स्रोत के साथ मीडिया के पूरक ीकरण पर बरामद किया गया था, जैसे सीपी, S100A7, या और बीमें मुफ्त जस्ता, जबकि सी पर्याप्त रूप से आंतरिक सेलुलर जिंक पूल को कम करने के लिए पतला नहीं था । चित्रा 2A जीन एट अल से अनुकूलित है ।17चित्रा 2B मौराकिस एट अल19से अनुकूलित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3. प्रतिनिधि बाध्यकारी परखों से पता चलता है मेजबान ligands धातु पर बल दिया gonococci के लिए बाध्यकारी । (क)जंगली प्रकार तनाव FA1090, या इस तनाव के म्यूटेंट जो टीडीएफजे, टीडीएफएच या दोनों का उत्पादन नहीं करते हैं, सीडीएम में पूरक धातुओं के बिना उगाए गए थे और मानकीकृत घनत्व में नाइट्रोसेल्यूलोज पर बिंदीदार थे। कोशिकाओं की जांच कैल्प्रोफिन के साथ की गई थी, जिसे जिंक-उत्तरदायी टीडीएफएच द्वारा मान्यता प्राप्त है, और एक एंटी-कैल्प्रोटेक्टिन एंटीबॉडी (शीर्ष) के साथ पता लगाकर बाध्यकारी का आकलन किया गया था। सापेक्ष कैल्प्रोटेक्टिन बाइंडिंग को घनत्व के माध्यम से निर्धारित किया गया था, जो लॉग स्केल (नीचे) पर दिखाया गया था। (ख)बाध्यकारी प्रयोगों के रूप में एकमें वर्णित किया गया था, लेकिन इसके बजाय FA19 जंगली प्रकार तनाव और tdfJ उत्परिवर्ती और उस पृष्ठभूमि में पूरित उपभेदों का उपयोग कर । कोशिकाओं की जांच एचआरपी-लेबल S100A7 के साथ की गई थी, जिसे जिंक-उत्तरदायी टीडीएफजे द्वारा मान्यता प्राप्त है।(सी)वाइल्ड टाइप स्ट्रेन FA19 को सीडीएम या जीसी मीडियम शोरबा में साथ-साथ 25 माइक्रोएम डेडिटॉक्सामाइन के साथ जोड़ा गया था, जो मानकीकृत मात्रा में नाइट्रोसेल्यूलोज को बिंदीदार था, और ट्रांसफरिन के साथ जांच करता है, जो लोहे के प्रति संवेदनशील टीबीए को बांधता है । इन साइड-बाय-साइड परीक्षणों से पता चलता है कि सीडीएम, जीसी मध्यम शोरबा के विपरीत, लोहे के सीमित वातावरण को प्राप्त करने के लिए कोई अतिरिक्त चेलेशन की आवश्यकता नहीं है । चित्रा 3A जीन एट अल से अनुकूलित है और मौराकिस एट अल19से नीचे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 1
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Supplemental Figure 2
पूरक चित्रा 2. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 3
पूरक चित्रा 3. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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विकास मीडिया माइक्रोबायोलॉजिकल अनुसंधान में विभिन्न भूमिकाओं में कार्य करता है। विशेष मीडिया का उपयोग कई अद्वितीय प्रकार के अध्ययन के लिए चयन, संवर्धन और विभिन्न अन्य अनुप्रयोगों के लिए किया जाता है। ऐसा ही एक आवेदन धातु-उत्तरदायी जीन का शामिल है, जो आमतौर पर एक विशिष्ट चेलेटर के अलावा पूरा होता है जो एक विशेष धातु आयन को लक्षित करता है। यह विधि सीमित है, क्योंकि विभिन्न ट्रेस धातुओं के लिए आवश्यक चेलेशन की मात्रा अद्वितीय धातु प्रोफाइल वाले विभिन्न जल स्रोतों के कारण चर होने की संभावना है, और एक ही मीडिया घटक के दो बहुत सारे जिसमें विभिन्न धातु सांद्रता6शामिल हैं। इस अंतर्निहित कमी से बचने के लिए, हमने एक परिभाषित माध्यम की तैयारी और उपयोग का वर्णन किया है जिसे चेलेक्स-100 राल के साथ माना जाता है ताकि सभी ट्रेस धातुओं को थोक में हटाया जा सके, जिससे निर्दिष्ट धातुओं को आवश्यकतानुसार माध्यम में वापस भेज दिया जा सके।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, चर्चा का पहला महत्वपूर्ण बिंदु स्रोत पानी है। प्रोटोकॉल एक चेलेक्स उपचार का वर्णन करता है जो आईएसओ 3696 विनिर्देशों के अनुसार प्रयोगशाला प्रकार 2 (1.0 मेगाओएचएमएस-सेमी) पानी से धातुओं को हटाने के लिए पर्याप्त है। विभिन्न जल स्रोतों की संभावना कम या लंबे समय तक Chelex उपचार की आवश्यकता होगी । हमने पाया है कि टाइप 2 की तुलना में उच्च शुद्धता का पानी, जैसे आणविक जीव विज्ञान ग्रेड पानी, इस आवेदन में बैक्टीरियल विकास का समर्थन नहीं करेगा । मीडिया की तैयारी के लिए पोत का चुनाव जल स्रोत की तरह ही महत्वपूर्ण है । हम प्लास्टिक के साफ कंटेनरों की अत्यधिक सलाह देते हैं, क्योंकि ग्लासवेयर समाधान में धातु आयनों को लीच कर सकता है। यदि प्लास्टिक वेयर उपलब्ध नहीं है, तो प्रदूषण के जोखिम को कम करने के लिए कांच के बर्तन को एसिड धोया जाना चाहिए। सीडीएम का उपयोग करते समय संस्कृति फ्लास्क के लिए एक ही एसिड धोने की आवश्यकता होती है।

इन विट्रो सेटिंग में नेसेरिया गोनोरिया का विकास काफी चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि यह जीव विशेष रूप से मानव मेजबान21में पनपने के लिए विकसित हुआ है। जबकि सीडीएम प्रयोगों की अवधि के लिए विकास का समर्थन करने के लिए उपयुक्त है, टीका और कमजोर पड़ने के कदम के दौरान देखभाल की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि गोनोकोची आवश्यक से अधिक वायुमंडलीय परिस्थितियों में नहीं हैं । गोनोकोची22 की कैनोफिलिक प्रकृति और मानव मेजबानों के भीतर पाए जाने वाले तापमान के लिए इसके पूर्वाग्रह के कारण, हम संस्कृतियों को ~ 15 मिनट से अधिक समय तक वायुमंडलीय परिस्थितियों में रखने की सलाह नहीं देते हैं। यदि विधि के चरण 4.5 में वर्णित प्रारंभिक द्रव्यमान दोहरीकरण घटना में 2 घंटे से अधिक समय लगता है, तो यह संभावना है कि गोनोकोकल संस्कृतियों को ठीक से संभाला नहीं गया है और प्रयोग को निरस्त किया जाना चाहिए।

जबकि इस विधि का ध्यान विशेष रूप से नेसेरिया गोनोरिया के विकास और लक्षण वर्णन के तरीकों पर है, इस विशिष्ट सीडीएम का उपयोग अन्य निसेरिया प्रजातियों के अध्ययन के लिए भी उपयुक्त है। इसके अलावा, इसे अन्य बैक्टीरिया में अन्य धातु-संवेदन प्रणालियों के लक्षण वर्णन पर आसानी से लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, स्टेफिलोकोकस ऑरियस23 और एस्चेरिचिया कोलाई24में धातु तेज की विशेषता के लिए इसी तरह के धातु मुक्त मीडिया का उपयोग किया गया है। अन्य बैक्टीरिया के लिए वर्णित नुस्खा के उपयोग की संभावना छोटे संशोधनों या परिवर्धन शामिल होगा, सवाल में बैक्टीरिया की विशिष्ट पोषण की जरूरत के आधार पर । उदाहरण के लिए, पूरक आठवीं नुस्खा में शामिल करने के लिए पूरक सीओ2के लिए ' gonococcus की जरूरत के साथ सहायता की है । जैसा कि ऊपर वर्णित है, विकास 5% सीओ2 वातावरण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है, लेकिन हमने पाया है कि मीडिया में पूरक बाइकार्बोनेट के अलावा परिभाषित माध्यम में गोनोकोकल विकास के प्रारंभिक चरणों को एड्स करता है। ऐसी आवश्यकता के बिना जीवों के लिए, इस घटक को छोड़ा जा सकता है। दुर्भाग्य से, इन संशोधनों के आगे उदाहरण अनुभवजन्य निर्धारित किया जाना चाहिए ।

अन्य बैक्टीरिया के साथ उपयोग के लिए कुछ हद तक विधि को अनुकूलित करने की आवश्यकता के बावजूद, बुनियादी ढांचा व्यापक उपयोग के लिए उपयुक्त होना चाहिए। धातु-उत्तरदायी जीन और धातु ट्रांसपोर्टरों का लक्षण वर्णन माइक्रोबियल अध्ययन में एक सतत प्रयास है, जिसमें नेसेरिया मेनिनजिटिस18,25,26,27,28, एस ऑरियस9, हीमोफिलस इन्फ्लूएंजा29, साल्मोनेला आंत्रिका30और ई कोलाई31 सभी इस आला में ध्यान प्राप्त कर रहे हैं। इस तकनीक के हमारे अपने भविष्य के उपयोग का उद्देश्य पहले से बताए गए लोगों से परे अन्य गोनोकोकल धातु तेज प्रणालियों की समझ को आगे बढ़ाना होगा, जो गोनोकोकस को मेजबान प्रोटीन जैसे लैक्टोफेरिन32,33,हीमोग्लोबिन34,35,और बैक्टीरियल ज़ेनोसाइडोर्प्स36से भी लोहा प्राप्त करने की अनुमति देता है, और हमारे अध्ययनों को अन्य धातुओं जैसे मैंगनीज़ के प्रभावों में विस्तारित करना है, जो कि रक्षा में अन्य धातुओं के प्रभावों में हमारे अध्ययनों का विस्तार करते हैं। नेसेरिया12,37द्वारा ।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को NIH अनुदान R01 AI125421, R01 AI127793, और U19 AI144182 द्वारा समर्थित किया गया था । लेखन लेखक उन सभी प्रयोगशाला सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहेगा जिन्होंने इस विधि की प्रूफरीडिंग और समीक्षा में योगदान दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
125 mL sidearm flasks Bellco 2578-S0030 Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol VWR M131 Open in fume hood
3MM Paper GE Health 3030-6461 Called "filter paper" in text
Agarose Biolone BIO-41025 Powder
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434 Powder
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Powder
Blotting grade blocker Bio-Rad 170-6404 Nonfat dry milk
Bovine serum albumin Roche 3116964001 Powder
Bovine transferrin Sigma-Aldrich T1428 Powder
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 Powder
Calcium pantothenate Sigma-Aldrich C8731 Powder
Calprotectin N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin Bio-Rad 142-2832 Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab Puritan 25-806 Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine Sigma-Aldrich D9533 Powder
D-glucose Sigma-Aldrich G8270 Powder
Dialysis cassette Thermo 66380 Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus Schleicher & Schwell 10484138 Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol Koptec V1016 Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride Sigma-Aldrich F7134 Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich F1143 Irritant, do not inhale
GC medium base Difco 228950 Powder, already contains agar
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Powder
HEPES Fisher L-15694 Powder
Human transferrin Sigma-Aldrich T2030 Powder
Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 Powder
Klett colorimeter Manostat 37012-0000 Uses color transmission to assess culture density
L-alanine Sigma-Aldrich A7627 Powder
L-arginine Sigma-Aldrich A5006 Powder
L-asparagine monohydrate Sigma-Aldrich A8381 Powder
L-aspartate Sigma-Aldrich A9256 Powder
L-cysteine hydrochloride Sigma-Aldrich C1276 Powder
L-cystine Sigma-Aldrich C8755 Powder
L-glutamate Sigma-Aldrich G1251 Powder
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126 Powder
L-histidine monohydrochloride Sigma-Aldrich H8125 Powder
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752 Powder
L-leucine Sigma-Aldrich L8000 Powder
L-lysine Sigma-Aldrich L5501 Powder
L-methionine Sigma-Aldrich M9625 Powder
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126 Powder
L-proline Sigma-Aldrich P0380 Powder
L-serine Sigma-Aldrich S4500 Powder
L-threonine Sigma-Aldrich T8625 Powder
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254 Powder
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754 Powder
L-valine Sigma-Aldrich V0500 Powder
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Powder
Methanol VWR BDH1135-4LP Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose GE Health 10600002 Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 60356 Powder
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Powder
Potassium sulfate Sigma-Aldrich P0772 Powder
Potato starch Sigma-Aldrich S4251 Powder
Reduced glutathione Sigma-Aldrich G4251 Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7 N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder
Sodium chloride VWR 470302 Powder
Sodium citrate Fisher S279 Powder
Sodium hydroxide Acros Organics 383040010 Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625 Powder
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754 Also called cocarboxylase
TPEN Sigma-Aldrich P4413 Powder
Tris VWR 497 Powder
Uracil Sigma-Aldrich U0750 Powder
Zinc sulfte heptahydrate Sigma-Aldrich 204986 Irritant, do not inhale

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References

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धातु-उत्तरदायी जीन और मेजबान लिगांड्स से धातु अधिग्रहण के लक्षण वर्णन के लिए <em>नेसेरिया गोनोरिया</em> की धातु-सीमित वृद्धि
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Maurakis, S., Cornelissen, C. N. Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands. J. Vis. Exp. (157), e60903, doi:10.3791/60903 (2020).More

Maurakis, S., Cornelissen, C. N. Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands. J. Vis. Exp. (157), e60903, doi:10.3791/60903 (2020).

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