Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

ホストリガンドからの金属応答遺伝子の特性評価と金属獲得のためのナイセリア淋菌の金属有限成長

doi: 10.3791/60903 Published: March 4, 2020

Summary

ここでは、金属取り込み用遺伝子の発現を促進するために、金属制限液体培地中の淋菌のナイセリアの増殖方法について説明する。また、これらの条件で増殖したゴノコッカスの表現型を特徴付けるための下流実験についても概説する。これらの方法は、他の細菌における金属応答性遺伝子の特性評価に適するように適合され得る。

Abstract

鉄や亜鉛などの微量金属は、遺伝子調節、触媒、タンパク質構造を含む原核生物プロセスにおいて重要な役割を果たすことが知られている重要な栄養素です。宿主による金属隔離は、しばしば細菌の金属制限をもたらす。この制限は、タンパク質製品が細菌が金属制限された環境を克服することを可能にする細菌遺伝子発現を誘導する。このような遺伝子の特性評価は困難です。細菌は、前述の遺伝子の発現を達成するのに役立つ金属プロファイルを維持しながら細菌の増殖を可能にする栄養金属への十分なアクセスを可能にする綿密に調製された媒体で増殖しなければならない。そのため、これらの金属の濃度に対しては微妙なバランスを確立する必要があります。人間の宿主のみで生き残るために進化してきたナイセリア淋菌のような栄養的に潔癖な生物を育てることは、さらに複雑さを増す。ここでは、ゴノコッカルの増殖及び所望の遺伝子発現を可能にするのに十分な定義済金属限定培地の調製について説明する。この方法により、研究者は、鉄または亜鉛の定義された供給源を培地に補いながら、望ましくない供給源から鉄および亜鉛をキレートすることができ、その調製物も記載されている。最後に、この培地を利用して金属安定化ゴノコッカル遺伝子のタンパク質産物を特徴付ける3つの実験について概説する。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ナイセリア淋菌は、一般的な性感染症淋病を引き起こす。感染時、病原性ナイセリアは、細菌がヒト宿主1、2、3による金属制限の努力を克服することを可能にする金属応答性遺伝子のレパートリーを発現する。鉄や亜鉛などの微量金属は、触媒部位の酵素への結合、酸化還元反応への参加、および様々なタンパク質の構造因子として4、5などの多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。金属に限られた条件では、金属応答性の遺伝子座は破壊され、その結果生じるタンパク質はこれらの栄養素の獲得を助けることができる。これらの遺伝子およびタンパク質の特性評価は、研究者にとってユニークな技術的課題を提示する。金属イオンは、これらの遺伝子のネイティブ遺伝子の転写を天然の遺伝子から誘導するためには細菌から源泉徴収されなければならないが、金属を含む培地からのこれらのイオンの有効なキラキラを最適化することは困難である。原料水の異なる金属プロファイルと粉末成分の固有のロット間変動6は、豊富な媒体から特定の金属を除去するために必要なキレート剤の量が異なる場所、成分ベンダー、さらには化学在庫として単一の実験室内で時間をかけて変化することを意味します。

この課題を回避するために、溶液から微量金属を除去するための調製中にChelex-100樹脂で処理される定義された培地の調製について説明する。この培地は、ヒト宿主の外で培養することが困難であるゴノコッカスの増殖を可能にする十分な栄養密度であり、また、研究者は独自の定義された供給源および濃度を加えることによって特定の金属プロファイルを導入することを可能にする。金属。必要な金属を枯渇させる金属の制御されたアドインの方法は、実験の一貫性を高め、水源や化学ロット数などの要因に関係なく、堅牢で複製可能な実験を可能にします。さらに、この媒体はわずかな変更だけ液体か固体として展開することができる、非常に多目的な。

この培地の有用性を実証するために、ゴノコッカル成長のためのプロトコルを概説し、金属応答性Neisseria遺伝子を特徴付けるための3つの成功した実験について説明する。まず、金属枯渇または補足培養物からゴノコッカス全細胞ライセートを調製し、金属応答性遺伝子座からのタンパク質産生の可変レベルを実証する。次に、特定の有効な亜鉛源の補給によってゴノコッカルの成長を制御する亜鉛制限成長アッセイの概要を説明します。最後に、金属を含むリガンドに結合する金属応答性表面受容体を発現する全ゴノコッカル細胞を示す結合アッセイを示す。これらの受容体の表面提示に成功するには、金属枯渇培地の成長が必要です。

本プロトコルは、ナイセリア淋菌のために特別に最適化されたが、他の多くの細菌病原体は、感染中に金属獲得戦略を採用して7、このプロトコルは、他の細菌における金属恒常性の研究のために適応され得る。他の細菌で使用するためにこの培地およびこれらの実験プロトコルを最適化するには、他の細菌がゴノコッカスとわずかに異なる金属要件を有する可能性があるため、キレックス-100による金属キレート濃度および/または処理時間のわずかな変更が必要になる可能性があります。鉄と亜鉛は、記載された調査のために懸念される主要な金属であるが、他の金属(例えば、マンガン)は、ナイセリア8、9、10、11、12を含む細菌に対して重要として実証されている。さらに、真核細胞培養作業における金属特性評価についても同様の方法が記載されているが、これも考えられる。13

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. チェレックス処理済み定義済み培地(CDM)ストックソリューションの調製

  1. ストックソリューションI
    1. NaCl(233.8 g)、K2 SO4(40.0 g)、NH4Cl(8.8 g)、K2HPO4(13.9 g)、KH2PO4(10.9 g)をイオン化した水で1Lの最終体積に組み合わせます。
    2. 50 mL円錐形チューブに溶液とアリコートを滅菌します。
    3. -20 °Cで保管してください。
  2. 株式ソリューション II
    1. チアミンHCl(0.2g)、チアミンピロリン酸-Cl(0.05g)、パントテン酸カルシウム(0.19g)、ビオチン(0.3g)を50%(vol/vol)エタノールで50%(vol/vol)エタノールで1Lの最終体積に結合する。
    2. アリコートを50 mL円錐形チューブにし、-20°Cで保管します。
  3. 株式ソリューション III
    1. L-アスパラギン酸(4.0 g)、L-グルタミン酸(10.4 g)、L-アルギニン(1.2 g)、グリシン(0.2 g)、L-セリン(0.4 g)、L-ロイシン(0.7 g) 2g)、L-イソロイシン(0.24g)、L-バリン(0.48g)、L-チロシン(0.56g)、Lプロリン(0.4グラム)、L-トリプトファン(0.64g)、L-リプトファン(0.64g)、L--レ スレオニン(0.4 g)、L-フェニルアラニン(0.2 g)、L-アスパラギン-H 2O(0.2 g)、L-グルタミン(0.4 g)、L-ヒスチジン-HCl(0.2 g) 500 mL脱イオン水中のL-メチオニン(0.12g)、L-アラニン(0.8g)、L-リジン(0.4g)、および還元グルタチオン(0.36g)を含む。
    2. L-システイン(0.44 g)およびL-シスチン(0.28 g)を最小体積(〜1 mL)のHClで溶解し、上記のアミノ酸溶液に添加する。
    3. すべての微粒子が溶解するまで、溶液のpHを10N NaOHで調整します。最終 pH は 10.0 ~ 11.0 になります。
    4. 最終体積を脱イオン水で1 Lにします。
    5. フィルターは250 mLの容積に溶液およびアリコートを殺菌する。
    6. -20 °Cで保管してください。
  4. 株式ソリューション IV
    1. グルコース(200g)を脱イオン水に1Lの最終体積に溶解する。
      注:溶液は、グルコースを溶解するために加熱する必要があります。
    2. フィルター滅菌し、50 mL円錐形チューブに溶液をアリクォートします。
    3. -20 °Cで保管してください。
  5. ストックソリューションV
    1. 脱イオン水中の低キサンチン(5.0g)、ウラシル(5.0g)、NaOH(4.0 g)を1Lの最終体積に結合します。
    2. 50 mL円錐形チューブにフィルター滅菌し、アリクォートします。
    3. -20 °Cで保管してください。
  6. ソリューション VI
    1. 脱イオン水で1MCaCl2-2H2O(147g/L)溶液を調製する。フィルター滅菌し、室温(RT)で保存します。
  7. ストックソリューションVII
    1. 脱イオン水中に1M無水MgSO4溶液を調製する。フィルター滅菌し、RTで保存します。
  8. ストックソリューションVIII
    1. 脱イオン水で1MNaHCO3溶液を調製する。フィルター滅菌し、RTで保存します。

2. 4x滅菌濃縮物と1x CDMの調製

注:この手順は、溶液中への金属の浸出を防ぐために、酸処理無菌ガラス製品またはプラスチックのいずれかで行われるべきです。

  1. ストックソリューションI(50 mL)、II(20mL)、III(250mL)、IV(50mL)、およびV(20mL)を20.0gのHEPESと組み合わせて混ぜ合わせます。
  2. pHを7.4に調整し、その後、脱イオン水で500mLに最終体積を持って来ます。
  3. キレックス-100樹脂を1L脱イオン水で洗浄し、4x滅菌濃縮物に添加する前に防腐剤を除去する。これを行うには、1 L脱イオン水に50gの樹脂を加え、少なくとも1時間攪拌して、真空ろ過によって水を取り出し、この洗浄した樹脂をステップ2.4に使用します。
  4. 50gの樹脂を加え、ちょうど90分間ゆっくりかき混ぜます。
  5. フィルター滅菌により樹脂を除去し、4°Cの滅菌濃縮物を4°Cに保存します。
  6. CDMの1倍の働き量を準備するには、まず4x濃縮物を無菌脱イオン水で希釈し、次に溶液VI(1x溶液の500mLあたり125μL)、溶液VII(500mL当たり535μL)、および溶液VIII(500mL当たり10mL)を加える。
    注:すべてのストック溶液はすでに滅菌されていますが、調製後に1x溶液を再び滅菌することを推奨します。

3. CDMプレートの製造

注:以下のレシピは、プレートのための1 Lメディアを作るが、それは小さなボリュームでこれらを準備するのが最善です。すべてが比例してスケールダウンします。

  1. 洗浄アガロース
    1. アガロース50gを1L脱イオン水に溶かし、1時間攪拌する。
    2. RTで15分間1,200 x gで遠心分離機ボトルと遠心分離機に溶液を移し、慎重に上清を注ぎ、廃棄します。
    3. アガロースペレットを再懸濁するのに十分な脱イオン水を加え、次いで1Lフラスコに移す。脱イオン水で1 Lの最終体積に持ち込み、ステップ3.1.2のようにかき混ぜて遠心分離します。上清を捨てます。
    4. 十分な100%エタノールを加え、ペレットを再懸濁し、次いで新しい1Lフラスコに移す。エタノールで1 Lの最終容積に持って来なさい。ステップ3.1.2のようにかき混ぜ、遠心分離します。
    5. 手順 3.1.4 を繰り返します。
    6. アガロースペレットにメタノールを加え再懸濁し、1Lフラスコに移します。メタノールで1 Lの最終体積に持ち込みます。ステップ3.1.2のようにかき混ぜ、遠心分離します。
    7. 手順 3.1.6 を繰り返します。
    8. 洗浄したアガロースをアルミホイルが並ぶトレイに移し、ヒュームフードで乾燥させます。乾燥した場合は、長期保存のために金属フリー容器に移す。
  2. 750 mLの脱イオン水に、洗浄したアガロース10gとジャガイモデンプン5gを加える。
  3. 121 °Cで30分間、大気圧より100kPa上のオートクレーブ。
  4. 媒体を〜65°Cまで冷却し、4X CDMの250 mL、溶液VIの250 μL、溶液VIIの1.07 mL、および20 mLの溶液VIIIを加えます。
  5. 必要に応じて、プレートを注ぐ前に、選択した金属を追加します。キレート剤の添加は、金属フリー条件を維持するために必要ではありません。
  6. ペトリ皿に注ぎ、固める。

4.金属は、ナイセリア淋菌の限られた成長

注:ほとんどのアプリケーションでは、CDMの接種前に細菌に金属応力を加える必要はありません。CDMの最初の倍増ステップとその後の希釈は、その内部鉄および亜鉛の店のゴノコッカスを枯渇させるのに十分である。したがって、以下の手順の最初の2つのステップは、ケロッグのサプリメントI14および12.5 μM Fe(NO3)3を補充したGC培地ベースから作られた寒天プレートを使用して行われます。早期の金属応力が望ましい場合は、Fe(NO3)3を使用せず、5 μM TPEN (N,N,N,N'-テトラキス (2-ピリジルメチル) エチレンジアミン) を使用して鉄キレーション用に GC 中ベースプレートを準備することをお勧めします。すべてのインキュベーションは、5%のCO2で37°Cで行われる。

  1. 実験の2日前、-2日目に、冷凍庫ストックからGC培地プレートにストリークゴノコッカスを入れ、24時間以下でインキュベートします。
  2. 日-1に、新鮮なGC中型プレートに単一のコロニーをストリーク。この 14 ~ 16 時間は、成長実験の前に実行してください。
  3. 実験当日、酸洗浄した125mLのサボアームフラスコ(補足図1)に5~10mL1x CDMを加え、これを使用してクレットの色調をブランクにします。
  4. 無菌の綿棒を使用して、健康な単一コロニーからCDMを接種します。20クレットユニットを目指してください。
    注:クレットの色素メーターが利用できない場合、分光光度計も同様に適しています。KLETT ユニットから OD へのユニバーサル変換式はありませんが、大まかなガイドがあります (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales)。
  5. 約1質量倍増(40クレット単位)まで250rpmで振とうをインキュベートする。この時間は 1 ~ 2 時間です。
  6. この時点で、培養は、初期培養密度の半分に達するCDMの十分な量を加えることによって希釈され(例えば、5 mLの培養が20から40 Klett単位に達した場合、CDMの15 mLは10 Klett単位に戻る)、成長は続くだろう。ステップ 4.5 と同様にします。バック希釈、金属処理などの特定の量は、下流の用途によって異なります。以下の3つの例(セクション5、6、7)を挙げます。

5. 金属反応遺伝子製品のウェスタン分析

  1. ステップ4.6から、3つのボリュームのCDM(例えば、5 mLから始まる場合は15 mLのCDM)で培養物を希釈します。この時点で、必要に応じて金属処理を追加します。
    1. 鉄を検出する遺伝子は、12.5 μM Fe(NO3)3で退化する可能性があります。亜鉛応答性遺伝子は、10 μM ZnSO4で押し下げられる可能性がある。
    2. 追加の鉄や亜鉛のストレスは、メディアがすでに枯渇しているので、応答性遺伝子はすでに発現しているので、必要ありません。さらにストレスが必要な場合は、過度のストレスが培養の増加を妨げるため、1~2 μM以下のデフェロキサミンまたはTPENを推奨します。
  2. 4時間のステップ4.5のように培養を成長させ、サンプルの最終的な細胞密度を記録します。金属にストレスを感じの少ない文化は、最終的な密度が高くなります。
  3. 適切な密度に培養を標準化し、ライセートを調製する。
    1. 培養の1 mLで100クレット単位に相当する密度に全細胞ライセートを標準化します。これを達成するには、サンプルのKlett単位密度で100を割ります。あなたが得る数は、細胞ペレットを作るために使用される培養量(mL)です。
  4. 標準的なSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング手順15に従って、目的のタンパク質をプローブします。

6. 金属限定成長アッセイ

注: これらのアッセイは、前作の成長プレミックスを記述します。これらの混合の調製は、セクション8で説明される。

  1. ステップ4.5で質量倍増の間に、10xプレミックスと96ウェルマイクロプレートの井戸を引き出します。さらに、ブランクとして機能する 3 つの井戸を指定します。これらの井戸に、10μLの10μLのプレミックスと90 μLのCDMを加えてください。
  2. サイドアームフラスコ内の培養物が2倍になったら、マイクロプレートの未使用井戸に各培養物の100μLを加え、600nm(OD600)で光学密度を測定する。これは分光光度計のキュベットで行うことができますが、アッセイ内の株の数が多いとこれは面倒になる可能性があり、一般的に、あなたの分光光度計が側腕フラスコの腕から直接測定できない限り、お勧めしません(補足図2)。
    1. ODを測定しながら、フラスコをインキュベーターに戻して、ゴノコッカスが生存可能なままであることを確認します。
  3. カルチャを OD600 = 0.02 に持ち込むために必要な希釈量を計算します。10x プレミックスは OD に対して無視できる影響を与え、計算から省略できます。
  4. 小さな培養管でCDMで培養し、10xプレミックスをプレート内の1xに希釈するのに十分な量を加える。プレートウォーマーが利用可能な場合は、作業中にプレートを37 °Cに保ちます。
  5. プレートリーダーでの揺れでプレートを8~12時間インキュベートし、OD600の測定を所望の間隔で行います。

7. 外膜金属輸送体によるリガンド結合の検出

  1. 工程5.1のように所望の培養物を処理し、その後4時間振とうを伴ってインキュベートする。
  2. 4時間のマークの少し前に、3枚のろ紙とニトロセルロースをドットブロット装置に収めるのに必要なおおよその大きさに切り取った(補足図3)。ニトロセルロースを脱イオン水に前置きし、ニトロセルロースの下にろ紙で装置を組み立てます。
  3. 4時間で、細胞密度を記録し、適切な最終密度に標準化します。ステップ5で細胞ライセートの調製に使用される密度の10%を〜10%使用することが推奨される。例えば、1mLの1mLで100KUを使用して、これらのブロットについて1mLで〜10KUを意味する。それ以外の場合、計算は5.3.1で説明したのと同じであり、培養液は、ライセートにするのではなく、計算されたボリュームでニトロセルロースに直接追加されます。
  4. ピペット細胞培養物をニトロセルロース上に培養し、濾紙が全ての液体を吸収するのに十分な時間を確保した。
  5. 装置を分解し、ブロットを乾燥させ、トリス緩衝生理食液中の5%ウシ血清アルブミンまたは非脂肪乳(w/v)で1時間ニトロセルロース膜を遮断する。
  6. ドットブロット装置を組み立て直し、ろ紙をパラフィンフィルムに置き換え、ニトロセルロースの下に漏れ防止シールを作成する。
  7. 目的の金属結合リガンドをブロッカーおよびプローブ細胞で0.2μMに1時間希釈します。
  8. 液体を真空で吸い取り、ブロットを洗い、その後、標準的な免疫学的手順に従って信号16を開発する。洗浄手順は、装置の中または外で行われてもよい。

8. トランスフェリン、S100A7、カルプロテクチンの金属装填と10xプレミックスの調製

注:CDM製剤と同様に、溶液調製のために酸洗浄ガラスまたはプラスチックを使用してください。

  1. ヒトトランスフェリンを初期バッファー(100 mMトリス、150 mM NaCl、20 mM NaHCO3、pH= 8.4)で10 mg/mL (125 μM) で溶解します。S100A7およびカルプロテキンは、20 mMトリス、100 mM NaCl、10 mM 2-メルカプトエタノール、および1 mM CaCl2、pH = 8.0からなるバッファーに懸濁される。
    1. フェレーション溶液(クエン酸ナトリウム100mM、100 mM NaHCO3、5mM FeCl3-6H2O、pH = 8.4)を加えて30%の鉄飽和を達成する(例えば、75 μLのフェレーション溶液は10mg/mLで行われた場合5mLのトランスファーに適している)。
    2. ZnSO4をS100A7またはカルプロテキンに添加し、タンパク質に対して50%のモル比で25%の飽和を生じさせる(各タンパク質分子は2つの金属結合部位を有する)。50 μM ZnSO4を用いた100 μM S100A7またはカルプロテクチンの調製物を使用できます。
    3. どちらの場合も、金属荷重に対して少なくとも1時間のエンドエンド混合を許可します。
  2. 4 L の透析バッファー (40 mM トリス、150 mM NaCl、20 mM NaHCO3、pH = 7.4) を準備します。これを2つの独立した2 Lボリュームに分割し、1つを4°Cに配置します。
  3. RTで4時間の最初の緩衝液量に対してシリンジと透析を使用して透析カセットに金属装填タンパク質を加える。
  4. カセットを第2の緩衝液容量に移動し、4°Cで一晩透析する。これらの手順の後、非結合金属を除去する必要があります。
    注:透析後のタンパク質濃度を決定するために、ビチンポニン酸アッセイを勧めます。
  5. 唯一の鉄源としてトランスフェリンの利用のために10xトランスフェリンプレミックスを使用してください。
    1. このプレミックスを準備するには、30%のヒトFe-トランスフェリンとウシアポトランスフェリン(鉄荷重ステップなしでヒトトランスフェリンについて説明したように125μMで調製)をPBSでそれぞれ75μMおよび30μMに希釈します。陽性コントロールプレミックスは、30%Fe-トランスフェリンを75 μM Fe(NO3)3に置き換え、負のコントロールプレミックスは、ウシアポトランスフェリンのみを保持し、追加された鉄を省略します。成長アッセイでは、これらの濃縮物の10μLを90μLの培養で希釈します。最終濃度は7.5 μM 30%ヒトFe-トランスフェリンおよび3 μMウシアポトランスフェリンです。
  6. S100A7用トランスフェリン10xプレミックスの修正版またはカルプロテクチン利用を唯一の亜鉛源として使用してください。
    1. ポジティブコントロールプレミックスの場合、50 μM ZnSO4をトランスフェリンプレミックスに組み込みます。負の制御の場合は、50 μM TPEN を組み込み、亜鉛を省略します。次に、必要なサンプルごとに各サンプルを10 μLずつ取り、その体積を新しいチューブに移動します。無菌PBSのこの半分のボリュームに追加します。例えば、10ウェルがポジティブコントロールプレミックスを受け取る場合、プレミックスの100μLを取り、それを新しいチューブに移動させ、50 μLのPBSを加えます。負の制御に対して同じ操作を行います。
    2. S100A7またはカルプロテクチンプレミックスを作るために、必要な1ウェルあたり10 μLのマイナスコントロールプレミックスを取り、新しいチューブに移動し、25%Zn-S100A7またはカルプロテクチンの半分の体積を加えます。増殖アッセイでは、15 μLのプレミックスを使用し、85 μLの培養で希釈します。トランスフェリンの最終濃度はステップ8.5と同じままで、Zn、TPEN、またはS100A7/カルプロテクチンの5 μMを加えた。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ナイセリア淋菌の増殖のための微量金属の存在しない特定の定義された媒体が開発され、金属応答性遺伝子とその遺伝子産物の特性評価のために実施された。最適化されたプロトコルでは、メディアの金属プロファイルは、金属ターゲットの滴定キレートではなく、研究者の裁量で金属を追加して制御し、ラボからラボ、実験から実験までの制御と一貫性を高めることによって制御されます。この媒体は液体および固体の両方の状態で使用することができ、多くの実験的なセットアップ間で多目的である。

可変金属濃度における差動タンパク質産生は、付属の代表的なウェスタンブロット(図1)で見ることができる。画像は、TPENによる亜鉛キレート化に応答してアップレギュレートされた亜鉛応答性外膜輸送機TdfJおよびTdfHを示している。亜鉛を培地に戻すと、TdfJは本質的に検出不能であり、TdfHは不足していた。さらに、tdfJプロモーターは、鉄によって抑圧されるのではなく、誘導されることが知られている。これはブロットにも表示されます。これらのブロットは、鉄応答性リポタンパク質TbpB2をローディングコントロールとして利用した。鉄のアドバックの条件では、TbpBの生産は減った。

金属制限成長アッセイは、ゴノコッカスによる特異的で定義された亜鉛源の利用を示す(図2)。2Aは、亜鉛応答性TdfH17,18の作用を必要とするZn負荷カルプロテクチン(CP)の存在下で増殖するN.淋病を示す。使用可能な亜鉛源が利用できなかった場合、亜鉛の添加が戻らないか、TdfHが存在しないかによって、増殖が制限された。図2Bは、S100A7の存在下で同様の結果を示し、外膜輸送機TdfJが製造されたときに唯一の亜鉛源として働くことができる19。TPENの存在下またはTdfJが不在の場合、成長は妨げられたが、Zn-S100A7の添加はTdfJ依存的な方法で成長を回復した。最後に、図2のCは実験誤差を示す。この例では、ゴノコッカル培養物の希釈工程は、マイクロプレート中の全培養量に対する内部亜鉛プールの細菌を枯渇するのに十分ではなかった。したがって、陰性対照の成長は所望のODを超えた。

それぞれのリガンドに対するゴノコッカル細胞全体の特異的結合は、金属制限および金属レクレテ条件で調製された培養物からのドットブロットによって実証される(図3)。3A、Bは、亜鉛不足の結果として、CDMで増殖したゴノコッカスがTdfHとTdfJをそれぞれ産生した際にCPとS100A7を結合できたことを示す。図3Cは、鉄センシング遺伝子tbpAおよびtbpB20から作られた同調タンパク質によって達成されるトランスフェリン結合を比較し、ゴノコッカスがCDM単独で増殖した場合、鉄キレート剤ジフェノキサミンで処理したGC培地ブロスと比較する。この図は、CDMで成長した培養物によるトランスフェリンの結合の増加を示しており、キレートGCスープと比較してCDMの鉄欠乏性に起因するタンパク質発現のレベルが高いことを示している。

Figure 1
図1:金属応答性タンパク質の差動生産を示す代表的なウェスタンブロット。(A)ナイセリア淋菌野生型株FA19は、示された濃度でZnSO4、Fe(NO3)3、またはTPENを補充したCDMで増殖させた。治療後、培養物を4時間培養した後、標準化された密度の全細胞ライセートが産生され、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを行った。亜鉛によって抑圧され、鉄によって誘導されるTdfJの差異生産レベルは、亜鉛の添加/枯渇および鉄の添加に応じて明確に見ることができます。(B) ウェスタンブロットの相対信号強度は、密度測定を介して定量された。この図は、マウラキスら19から適応しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:亜鉛制限のゴノコッカスの成長野生型株FA19、又はtdfJまたはtdfHを産生しないこの株のアイソジェニック変異株は指数相に達するまで(A)未処理CDMで成長し、(B)後に戻ってOD600=0.02及び(C)OD600=0.1に希釈した。 Aのサンプルをカルプロテクチン(上)または亜鉛を添加していない(下)を含むプレミックスで処理し、8時間成長した。BおよびCのサンプルは、遊離亜鉛、亜鉛(5μM TPEN)、またはS100A7を含むプレミックスを添加し、6時間成長し、CP、S100A7、またはAおよびBの遊離亜鉛などの使用できる亜鉛源を有する培地を補充した場合にのみ回収されたが、Cは内部細胞亜鉛プールを枯渇させるために十分に希釈されなかった。図2A、17図2Bから適合され、マウラキスら19から適応される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3.代表的な結合アッセイは、金属ストレスのゴノコッカスに結合する宿主リガンドを示す。(A)野生型株FA1090、又はtdfJ、tdfH、またはその両方を産生しないこの株の変異株は、補足金属を含まないCDMで成長し、標準化された密度でニトロセルロースに点在した。細胞を、亜鉛応答性TdfHによって認識されるカルプロテクチンでプローブし、抗カルプロテクチン抗体(上)で検出することにより結合を評価した。相対カルプロテクチン結合は、デンデンスオメトリーを介して定量し、ここで示す対数スケール(下)に示す。(B) Aに記載のように結合実験を行ったが、代わりにFA19野生型株とtdfJ変異株を使用して、その背景に相補された株を使用した。細胞をHRP標識S100A7でプローブし、亜鉛応答性TdfJによって認識される(C)野生型株FA19はCDMまたはGC培地スープに並べて増殖させ、25 μMのフェデロキサミンを加えて遊離鉄を加え、標準化された量のニトロセルロースに点在し、トランスフェリンでプローブし、鉄-TAを結合させる。これらの横並びのテストは、CDMがGC中液ブロスとは異なり、鉄制限された環境を達成するために追加のキレートを必要としなっていることを示しています。図3Aは、マウラキスら19からジャンら及び底部から適応される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Supplemental Figure 1
補足図 1.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Supplemental Figure 2
補足図 2.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Supplemental Figure 3
補足図 3.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

成長メディアは、微生物学研究において様々な役割を果たします。特殊なメディアは、多くのユニークなタイプの研究のために、選択、濃縮、および他の様々なアプリケーションに使用されます。そのような用途の1つは、金属応答性遺伝子の誘導であり、これは典型的には、特定の金属イオンを標的とする特定のキレート剤を添加することによって達成される。この方法は限定され、様々な微量金属に必要なキレート量が異なる金属プロファイルを含む異なる水源に起因して変動する可能性があるため、異なる金属濃度を含む2つの同一の媒体成分6とが異なる。この固有の欠点を避けるために、我々は、必要に応じて媒体に戻って指定された金属の制御された追加を可能にする、バルクですべての微量金属を除去するために、Chelex-100樹脂で処理される定義された媒体の調製と使用について説明しました。

現在のプロトコルでは、議論の最初の重要なポイントは、ソース水です。このプロトコルは、実験室タイプ2(ISO 3696仕様に従って1.0メガオーム-cm)水から金属を除去するのに十分なチェレックス処理を記述します。異なる水源は、おそらくより短いまたは長いチェレックス処理を必要とします.我々は、分子生物学グレードの水のようなタイプ2よりも高純度の水は、このアプリケーションで細菌の成長をサポートしないことを発見しました。媒体準備のための容器の選択は水源と同じくらい重要である。ガラス製品は金属イオンを溶液に浸出させる可能性があるため、きれいなプラスチック容器を強くお勧めします。プラスチック製品が利用できない場合、ガラス製品は、汚染リスクを最小限に抑えるために、酸洗浄する必要があります。CDMを使用する場合、培養フラスコに同じ酸洗浄が必要です。

この生物は人間の宿主21で特異的に繁栄するように進化したので、インビトロ環境でのナイセリア淋菌の成長は非常に困難な場合があります。CDMは実験の間の成長を支えるのに適しているが、ゴノコッカスが必要以上に大気条件でないことを確実にするために接種および希釈のステップの間に注意を払わなければならない。ゴノコッカス22のカプノフィル性とヒト宿主内の温度に対するその素因のために、我々は〜15分よりも長い大気条件で培養を維持することはお勧めしません。この方法のステップ4.5で説明した最初の質量倍増事象が2時間以上かかる場合、ゴノコッカス培養物が適切に処理されておらず、実験を中止する必要があります。

この方法の焦点は、特にネイセリア淋菌の増殖および特徴付けのための方法であるが、この特定のCDMの使用は、他のネイセリア種の研究にも適している可能性が高い。また、他の細菌における他の金属センシングシステムの特性評価にも容易に適用できます。例えば、黄色ブドウ球菌23および大腸菌24における金属取り込みの特徴付けにも同様の金属フリーの培地が使用されている。他の細菌に関する記載されたレシピの利用は、問題の細菌の特定の栄養ニーズに応じて、小さな変更または追加を伴う可能性が高い。例えば、補足的なCO2のためのゴノコッカスの必要性を助けるためにサプリメントVIIIがレシピに含まれています。上述したように、成長は5%CO2雰囲気で37°Cで行われるが、培地中に補間重炭酸塩を添加することは、定義された培地におけるゴノコッカル成長の初期段階を助けることがわかった。このような要求のない生物の場合、この成分は省略してもよい。残念ながら、これらの変更のさらなる例は、経験的に決定されなければならない。

他の細菌との使用のために多少の方法を適応させる必要があるにもかかわらず、基本的なフレームワークは、広い使用に適している必要があります。金属応答性遺伝子および金属輸送体の特性評価は、ナイセリア髄膜炎を含む細菌を含む細菌と微生物研究で進行中の努力であり、18、25、26、27、28、S.アウレウス9、血友病インフルエンザインフルエンザ29、サルモネラ腸管30、および大腸菌31はすべてこのニッチで注目を集めています。この技術の将来の利用は、ゴノコッカスがラクトフェリン32、33、ヘモグロビン34、35、細菌ゼノシドロフォア36などの宿主タンパク質から鉄を取得することを可能にする、既に述べた以上の他のゴノコッカル金属取り込みシステムの理解をさらに深め、細菌ゼノシクロフォア36からも研究を拡大することを目指します。によってネイセリア12,37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者は宣言するものは何もありません。

Acknowledgments

この作業は、NIH補助金R01 AI125421、R01 AI127793、およびU19 AI144182によってサポートされました。筆記著者は、この方法の校正とレビューに貢献したすべてのラボメンバーに感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
125 mL sidearm flasks Bellco 2578-S0030 Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol VWR M131 Open in fume hood
3MM Paper GE Health 3030-6461 Called "filter paper" in text
Agarose Biolone BIO-41025 Powder
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434 Powder
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Powder
Blotting grade blocker Bio-Rad 170-6404 Nonfat dry milk
Bovine serum albumin Roche 3116964001 Powder
Bovine transferrin Sigma-Aldrich T1428 Powder
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 Powder
Calcium pantothenate Sigma-Aldrich C8731 Powder
Calprotectin N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin Bio-Rad 142-2832 Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab Puritan 25-806 Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine Sigma-Aldrich D9533 Powder
D-glucose Sigma-Aldrich G8270 Powder
Dialysis cassette Thermo 66380 Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus Schleicher & Schwell 10484138 Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol Koptec V1016 Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride Sigma-Aldrich F7134 Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich F1143 Irritant, do not inhale
GC medium base Difco 228950 Powder, already contains agar
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Powder
HEPES Fisher L-15694 Powder
Human transferrin Sigma-Aldrich T2030 Powder
Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 Powder
Klett colorimeter Manostat 37012-0000 Uses color transmission to assess culture density
L-alanine Sigma-Aldrich A7627 Powder
L-arginine Sigma-Aldrich A5006 Powder
L-asparagine monohydrate Sigma-Aldrich A8381 Powder
L-aspartate Sigma-Aldrich A9256 Powder
L-cysteine hydrochloride Sigma-Aldrich C1276 Powder
L-cystine Sigma-Aldrich C8755 Powder
L-glutamate Sigma-Aldrich G1251 Powder
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126 Powder
L-histidine monohydrochloride Sigma-Aldrich H8125 Powder
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752 Powder
L-leucine Sigma-Aldrich L8000 Powder
L-lysine Sigma-Aldrich L5501 Powder
L-methionine Sigma-Aldrich M9625 Powder
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126 Powder
L-proline Sigma-Aldrich P0380 Powder
L-serine Sigma-Aldrich S4500 Powder
L-threonine Sigma-Aldrich T8625 Powder
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254 Powder
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754 Powder
L-valine Sigma-Aldrich V0500 Powder
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Powder
Methanol VWR BDH1135-4LP Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose GE Health 10600002 Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 60356 Powder
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Powder
Potassium sulfate Sigma-Aldrich P0772 Powder
Potato starch Sigma-Aldrich S4251 Powder
Reduced glutathione Sigma-Aldrich G4251 Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7 N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder
Sodium chloride VWR 470302 Powder
Sodium citrate Fisher S279 Powder
Sodium hydroxide Acros Organics 383040010 Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625 Powder
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754 Also called cocarboxylase
TPEN Sigma-Aldrich P4413 Powder
Tris VWR 497 Powder
Uracil Sigma-Aldrich U0750 Powder
Zinc sulfte heptahydrate Sigma-Aldrich 204986 Irritant, do not inhale

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76, (1), (2018).
  2. Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187, (14), 4865-4874 (2005).
  3. Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194, (23), 6594-6603 (2012).
  4. Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5, (11), 3173-3178 (2006).
  5. Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93, (4), 609-616 (2014).
  6. Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39, (2), 51-60 (2018).
  7. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10, (8), 525-537 (2012).
  8. Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23, (6), 737-748 (2018).
  9. Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81, (9), 3395-3405 (2013).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14, (2), 218-224 (2010).
  11. Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70, (2), 344-361 (2006).
  12. Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60, (2), 401-416 (2006).
  13. Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8, (3), 188-192 (1995).
  14. Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4, (9), 429-434 (2012).
  16. Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152, (2), 227-236 (1992).
  17. Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84, (10), 2982-2994 (2016).
  18. Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9, (10), 1003733 (2013).
  19. Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15, (8), 1007937 (2019).
  20. Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14, (5), 843-850 (1994).
  21. Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16, (4), 226-240 (2018).
  22. Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4, (2), 129-132 (1976).
  23. Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8, (5), 01281-01317 (2017).
  24. Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190, (15), 5431-5438 (2008).
  25. Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
  26. Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81, (6), 1915-1927 (2013).
  27. Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80, (2), 657-667 (2012).
  28. Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
  29. Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79, (8), 3366-3376 (2011).
  30. Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75, (12), 5867-5876 (2007).
  31. Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
  32. Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67, (1), 455-459 (1999).
  33. Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63, (8), 2958-2967 (1995).
  34. Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64, (12), 5008-5014 (1996).
  35. Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
  36. Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181, (9), 2895-2901 (1999).
  37. Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40, (5), 1175-1186 (2001).
ホストリガンドからの金属応答遺伝子の特性評価と金属獲得のための<em>ナイセリア淋菌</em>の金属有限成長
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maurakis, S., Cornelissen, C. N. Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands. J. Vis. Exp. (157), e60903, doi:10.3791/60903 (2020).More

Maurakis, S., Cornelissen, C. N. Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands. J. Vis. Exp. (157), e60903, doi:10.3791/60903 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter