Summary

Neisseria gonorrhoeae'nin Metal-Sınırlı Büyümesi, Ev Sahibi Ligandlardan Metal Duyarlı Genlerin Karakterizasyonu ve Metal Edinimi için

Published: March 04, 2020
doi:

Summary

Burada metal alımı için genlerin ekspresyonunu kolaylaştırmak için metal sınırlı sıvı ortamda Neisseria gonorrhoeae büyüme için bir yöntem açıklar. Ayrıca bu koşullarda yetiştirilen gonokokların fenotipini karakterize etmek için aşağı akım deneylerini ana hatlar. Bu yöntemler, diğer bakterilerde metal duyarlı genlerin karakterizasyonu için uygun olarak uyarlanabilir.

Abstract

Demir ve çinko gibi eser metaller gen regülasyonu, kataliz ve protein yapısı gibi prokaryotik süreçlerde önemli rol oynadığı bilinen hayati besinlerdir. Ev sahipleri tarafından metal ayrıştırma genellikle bakteri için metal sınırlamasına yol açar. Bu sınırlama, protein ürünleri bakterilerin metal sınırlı çevrelerinin üstesinden gelmesine izin veren bakteriyel gen ekspresyonuna neden olur. Bu tür genlerin karakterizasyonu zordur. Bakteriler, yukarıda bahsedilen genlerin ekspresyonunu gerçekleştirmeye yardımcı olan bir metal profilini korurken bakteri büyümesine izin vermek için besin metallerine yeterli erişim sağlayan titizlikle hazırlanmış medyada yetiştirilmelidir. Bu nedenle, bu metallerin konsantrasyonları için hassas bir denge kurulmalıdır. Neisseria gonorrhoeaegibi besin açısından titiz bir organizmanın büyümesi, sadece insan konakta hayatta kalmak için evrimleşmiştir, karmaşıklık ek bir düzeyde ekler. Burada, gonokok büyümesi ve istenilen gen ekspresyonuna izin verecek kadar tanımlanmış metal sınırlı bir ortamın hazırlanmasını açıklıyoruz. Bu yöntem araştırmacının demir ve çinkoyu istenmeyen kaynaklardan elde etmesini sağlarken, ortamı da tanımlı demir veya çinko kaynaklarıyla tamamlar. Son olarak, metal leregüle gonokok genlerinin protein ürünlerini karakterize etmeye yardımcı olmak için bu ortamı kullanan üç deneyi ana hatlatıyoruz.

Introduction

Neisseria belsoğukluğu yaygın cinsel yolla bulaşan enfeksiyon bel soğukluğu neden olur. Enfeksiyon sırasında, patojenik Neisseria bakterilerin insankonak1 ,2,3tarafından metal kısıtlama çabaları aşmak için izin metal duyarlı genlerin bir repertoire ifade . Demir ve çinko gibi eser metaller katalitik bölgelerdeenzimlere bağlanma, redoks reaksiyonlarına katılım gibi birçok hücresel süreçte kilit rol oynarlar ve çeşitli proteinlerde yapısal faktörler olarak4,5. Metal sınırlı koşullarda, metal duyarlı loci derepressed ve ortaya çıkan proteinler bu besinlerin edinimi yardımcı olabilir. Bu genlerin ve proteinlerin karakterizasyonu araştırmacı için benzersiz bir teknik sorun sunar. Metal iyonları kendi yerli loci bu genlerin transkripsiyon ikna etmek için bakterilerden uzak tutulmalıdır, ancak metal yüklü medya bu iyonların etkili şelasyon optimize etmek zor olabilir. Kaynak suyun farklı metal profilleri ve toz malzemelerin doğal lot-to-lot varyasyon6 zengin bir ortamdan belirli bir metal kaldırmak için gerekli şelatör miktarı farklı yerler arasında değişecektir anlamına gelir, madde satıcıları, ve kimyasal envanter değiştirilir gibi zaman içinde bile.

Bu zorluğu aşmak için, çözeltiden eser metalleri çıkarmak için hazırlık sırasında Chelex-100 reçin ile tedavi edilen tanımlanmış bir ortamın hazırlanmasını anlatıyoruz. Bu ortam yeterince besin yoğun insan konak dışında kültür zordur gonokok, büyümesini sağlamak için yoğun ve araştırmacı kendi tanımlanmış kaynakları ve konsantrasyonları ekleyerek belirli bir metal profili tanıtmak için izin verir Metal. İstenilen metallerin tükenmiş ortama kontrollü şekilde eklenmesi yöntemi deneysel tutarlılığı artırır ve su kaynağı ve kimyasal lot sayıları gibi faktörlere bakılmaksızın sağlam, çoğaltılabilir deneylere olanak sağlar. Ayrıca, bu ortam sadece küçük değişiklikler ile bir sıvı veya katı olarak dağıtılabilir, oldukça çok yönlü hale.

Bu ortamın yararını göstermek için, gonokok alabilmesi için bir protokol uyguluyoruz ve metalduyarlı Neisseria genlerini karakterize etmek için üç başarılı deney imal ediyoruz. İlk olarak, metal tükenmiş veya takviye edilmiş kültürlerden gonokok tüm hücreli lysates hazırlamak ve metal duyarlı loci protein üretiminin değişken düzeyde göstermek. Daha sonra gonokok alonu belirli, uygulanabilir çinko kaynaklarının takviyesi ile kontrol edilir çinko sınırlı büyüme töz anahat. Son olarak, metal içeren ligandlara bağlanan metal duyarlı yüzey reseptörlerini ifade eden tüm gonokok hücrelerini gösteren bağlayıcı tahliller gösteririz. Bu reseptörlerin başarılı yüzey sunumu metal tükenmiş ortamda büyüme gerektirir.

Mevcut protokol özellikle Neisseria gonorrhoeaeiçin optimize edilmiştir, ancak çok sayıda diğer bakteriyel patojenler enfeksiyon sırasında metal edinme stratejileri istihdam7, Bu protokol diğer bakterilerde metal homeostaz çalışması için adapte edilebilir bu yüzden. Diğer bakteriler gonokok biraz daha farklı metal gereksinimleri olabilir gibi bu ortam ve diğer bakterilerde kullanılmak üzere bu deneysel protokolleri optimize büyük olasılıkla metal şelatör konsantrasyonları ve / veya Chelex-100 ile tedavi süresi hafif değişiklik gerektirir. Demir ve çinko açıklanan araştırmalar için endişe birincil metaller, ancak diğer metaller (örneğin, manganez) bakteriler için kritik olarak gösterilmiştir, Neisseriadahil 8,9,10,11,12. Ayrıca ökaryotik hücre kültürü çalışmalarında metal karakterizasyonlar için de benzer yöntemler tanımlanmıştır. 13.000

Protocol

1. Chelex ile tedavi edilen Tanımlı Orta (CDM) Stok Çözümlerinin hazırlanması Stok çözümü I NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) ve KH2PO4 (10,9 g) deiyonize suda 1 L’lik son hacmi birleştirin. Filtre çözeltisi sterilize ve 50 mL konik tüpler içine aliquot. -20 °C’de saklayın. Stok çözeltisi II Birleştirir tiamin HCl (0.2 g), tia…

Representative Results

Neisseria gonorrhoeae büyümesi için iz metallerin yokluğunda belirli bir tanımlanmış ortam geliştirilmiş ve metal duyarlı genler ve gen ürünlerinin karakterizasyonu için uygulanmıştır. Optimize edilmiş protokolde, medyanın metal profili, metal bir hedefin titre şelasyonunu değil, araştırmacının takdirine bağlı olarak metaller ekleyerek kontrol edilir ve laboratuvardan laboratuvara ve deneyden deneye kadar daha fazla kontrol ve tutarlılık sağlar. Bu or…

Discussion

Büyüme ortamı mikrobiyolojik araştırmalarda çeşitli rollere hizmet vermektedir. Özel ortam seçimi, zenginleştirme ve çalışma birçok benzersiz türleri için çeşitli diğer uygulamalar için kullanılır. Böyle bir uygulama metal duyarlı genlerin indüksiyon, genellikle belirli bir metal iyon hedefleyen belirli bir şelatör eklenmesi ile gerçekleştirilir. Bu yöntem sınırlıdır, çeşitli eser metaller için gerekli şelasyon miktarı benzersiz metal profilleri içeren farklı su kaynakları nedeni…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH’nin R01 AI125421, R01 AI127793 ve U19 AI144182 hibeleri ile desteklenmiştir. Yazar, bu yöntemin okunmasında ve incelenmesinde emeği geçen tüm laboratuvar üyelerine teşekkür eder.

Materials

125 mL sidearm flasks Bellco 2578-S0030 Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol VWR M131 Open in fume hood
3MM Paper GE Health 3030-6461 Called "filter paper" in text
Agarose Biolone BIO-41025 Powder
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434 Powder
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Powder
Blotting grade blocker Bio-Rad 170-6404 Nonfat dry milk
Bovine serum albumin Roche 3116964001 Powder
Bovine transferrin Sigma-Aldrich T1428 Powder
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 Powder
Calcium pantothenate Sigma-Aldrich C8731 Powder
Calprotectin N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin Bio-Rad 142-2832 Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab Puritan 25-806 Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine Sigma-Aldrich D9533 Powder
D-glucose Sigma-Aldrich G8270 Powder
Dialysis cassette Thermo 66380 Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus Schleicher & Schwell 10484138 Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol Koptec V1016 Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride Sigma-Aldrich F7134 Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich F1143 Irritant, do not inhale
GC medium base Difco 228950 Powder, already contains agar
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Powder
HEPES Fisher L-15694 Powder
Human transferrin Sigma-Aldrich T2030 Powder
Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 Powder
Klett colorimeter Manostat 37012-0000 Uses color transmission to assess culture density
L-alanine Sigma-Aldrich A7627 Powder
L-arginine Sigma-Aldrich A5006 Powder
L-asparagine monohydrate Sigma-Aldrich A8381 Powder
L-aspartate Sigma-Aldrich A9256 Powder
L-cysteine hydrochloride Sigma-Aldrich C1276 Powder
L-cystine Sigma-Aldrich C8755 Powder
L-glutamate Sigma-Aldrich G1251 Powder
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126 Powder
L-histidine monohydrochloride Sigma-Aldrich H8125 Powder
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752 Powder
L-leucine Sigma-Aldrich L8000 Powder
L-lysine Sigma-Aldrich L5501 Powder
L-methionine Sigma-Aldrich M9625 Powder
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126 Powder
L-proline Sigma-Aldrich P0380 Powder
L-serine Sigma-Aldrich S4500 Powder
L-threonine Sigma-Aldrich T8625 Powder
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254 Powder
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754 Powder
L-valine Sigma-Aldrich V0500 Powder
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Powder
Methanol VWR BDH1135-4LP Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose GE Health 10600002 Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 60356 Powder
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Powder
Potassium sulfate Sigma-Aldrich P0772 Powder
Potato starch Sigma-Aldrich S4251 Powder
Reduced glutathione Sigma-Aldrich G4251 Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7 N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder
Sodium chloride VWR 470302 Powder
Sodium citrate Fisher S279 Powder
Sodium hydroxide Acros Organics 383040010 Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625 Powder
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754 Also called cocarboxylase
TPEN Sigma-Aldrich P4413 Powder
Tris VWR 497 Powder
Uracil Sigma-Aldrich U0750 Powder
Zinc sulfte heptahydrate Sigma-Aldrich 204986 Irritant, do not inhale

References

  1. Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
  2. Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
  3. Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
  4. Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
  5. Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
  6. Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
  7. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  8. Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
  9. Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
  11. Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
  12. Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
  13. Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
  14. Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
  17. Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
  18. Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
  19. Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
  20. Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
  21. Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
  22. Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
  23. Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
  24. Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
  25. Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
  26. Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
  27. Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
  28. Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
  29. Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
  30. Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
  31. Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
  32. Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
  33. Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
  34. Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
  35. Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
  36. Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
  37. Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).

Play Video

Cite This Article
Maurakis, S., Cornelissen, C. N. Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands. J. Vis. Exp. (157), e60903, doi:10.3791/60903 (2020).

View Video