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Genetics

आरएनए-सेक्यू विश्लेषण द्वारा मानव प्राथमिक केराटिनोसाइट्स के इन विट्रो भेदभाव का लक्षण वर्णन

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/60905
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, 3Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत संपर्क अवरोध द्वारा मानव प्राथमिक केराटिनोसाइट्स के इन विट्रो भेदभाव के लिए एक स्टेपवाइज प्रक्रिया है जिसके बाद आरएनए-सेक्यू विश्लेषण द्वारा आणविक स्तर पर लक्षण वर्णन किया जाता है।

Abstract

मानव प्राथमिक केराटिनोसाइट्स का उपयोग अक्सर एपिडर्मल भेदभाव और संबंधित बीमारियों पर अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में किया जाता है। विभिन्न प्रेरण स्थितियों का उपयोग करके दो-आयामी (2डी) जलमग्न शिष्टाचार में सुसंस्कृत केराटिनोसाइट्स के इन विट्रो भेदभाव के लिए विधियों की सूचना दी गई है। यहां वर्णित संपर्क अवरोध और बाद में आरएनए-एसईक्यू द्वारा आणविक लक्षण वर्णन द्वारा 2डी इन विट्रो केराटिनोसिटे भेदभाव विधि के लिए एक प्रक्रिया है। संक्षेप में, केराटिनोसाइट्स को परिभाषित केराटिनसाइट माध्यम में विकास कारकों के साथ पूरक किया जाता है जब तक कि वे पूरी तरह से कॉन्फ्लोटेंट न हों। भेदभाव केराटिनोसाइट्स के बीच घनिष्ठ संपर्कों से प्रेरित होता है और माध्यम में विकास कारकों को छोड़कर आगे उत्तेजित होता है। आरएनए-सेक्यू विश्लेषणों का उपयोग करके, यह दिखाया गया है कि दोनों 1) विभेदित केराटिनोसाइट्स विभेदन के दौरान अलग-अलग आणविक हस्ताक्षर प्रदर्शित करते हैं और 2) गतिशील जीन अभिव्यक्ति पैटर्न काफी हद तक एपिडर्मल स्तरीकरण के दौरान कोशिकाओं जैसा दिखता है। सामान्य केराटिनोसिटे भेदभाव की तुलना के लिए, ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर पी 63 के उत्परिवर्तनों को ले जाने वाले केराटिनोसाइट्स ने अपने भेदभाव दोषों के अनुरूप आकृति विज्ञान और आणविक हस्ताक्षरों को बदल दिया। अंत में, यह प्रोटोकॉल आरएनए-सेक्यू डेटा के बायोइन्फॉर्मेटिक विश्लेषण पर जोर देने के साथ 2डी इन विट्रो केराटिनोसाइट भेदभाव और इसके आणविक लक्षण वर्णन के लिए कदमों का विवरण देता है। क्योंकि आरएनए निष्कर्षण और आरएनए-एसईक्यू प्रक्रियाओं को अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, यह इस प्रोटोकॉल का ध्यान केंद्रित नहीं है। इन विट्रो केराटिनोसिटे विभेदन और बायोइंफॉर्मेटिक विश्लेषण पाइपलाइन की प्रायोगिक प्रक्रिया का उपयोग स्वस्थ और रोगग्रस्त केराटिनोसाइट्स में एपिडर्मल भेदभाव के दौरान आणविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

मानव त्वचा से प्राप्त मानव प्राथमिक केराटिनोसाइट्स का उपयोग अक्सर एपिडर्मिस 1,2, 3 ,4के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक सेलुलर मॉडल के रूप में कियाजाताहै। एपिडर्मिस के स्तरीकरण को केराटिनोसिटे भेदभाव द्वारा मॉडलिंग किया जा सकता है, या तो 2D जलमग्न मोनोलेयर फैशन या 3 डी एयर-लिफ्ट ऑर्गेनोटिपिकमॉडल2,3,5,6,7में। यद्यपि एपिडर्मल संरचना और कार्य का आकलन करने के लिए 3 डी मॉडल तेजी से महत्वपूर्ण हो गए हैं, लेकिन उनकी सुविधा और विश्लेषण के लिए बड़ी संख्या में कोशिकाओं को उत्पन्न करने की संभावना के कारण 2डी भेदभाव मॉडल अभी भी व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं।

सीरम के अलावा, कैल्शियम की उच्च एकाग्रता, कम तापमान और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर्स 2,3के अवरोध सहित2डीमें केराटिनोसिटे भेदभाव को प्रेरित करने के लिए विभिन्न शर्तें लागू की गई हैं। इन तरीकों में से प्रत्येक को कई केराटिनोसिटे विभेदन मार्कर जीन द्वारा मान्य किया गया है और रोग ों की स्थिति सहित केराटिनोसिटे भेदभाव का आकलन करने में प्रभावी दिखाया गया है। हालांकि , इन इंडक्शन स्थितियां उनकी भेदभाव दक्षता और काइनेटिक्स में भी अंतर दिखाती हैं जब मार्कर जीन के विशिष्ट पैनलों की जांच की जाती है2,3.

इनमें से एक पद्धति में संस्कृति माध्यम8में केराटिनोसिट संपर्क अवरोध और विकास कारकों की कमी शामिल है । यह दिखाया गया है कि जब कोशिकाएं पूर्ण घनत्व तक पहुंचती हैं तो केराटिनोसाइट्स अनायास अंतर कर सकते हैं।  संस्कृति माध्यम में विकास कारकों को छोड़कर भेदभाव को और बढ़ा सकते हैं । संपर्क अवरोध और घटते विकास कारकों के संयोजन की विधि को कई एपिडर्मल मार्कर3का उपयोग करते समय सामान्य स्तरीकृत एपिडर्मिस के समान जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ विभेदित केराटिनोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है, यह सुझाव देता है कि यह मॉडल सामान्य केराटिनोसिटे भेदभाव का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। हाल ही में, इस मॉडल का उपयोग करके केराटिनोसिटे भेदभाव के दो व्यापक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण9,10की सूचना दी गई है । शोधकर्ताओं ने आणविक स्तर पर इस मॉडल को मान्य किया और दिखाया कि इसका उपयोग सामान्य और रोगग्रस्त केराटिनसाइट भेदभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल आरएनए-एसईक्यू का उपयोग करके इन विट्रो भेदभाव विधि और विभेदित कोशिकाओं के आणविक विश्लेषण की प्रक्रिया का वर्णन करता है। यह भेदभाव दिवस 0 (प्रसार चरण), 2 दिन, 4 दिन, और 7 दिन (क्रमशः प्रारंभिक, मध्यम और देर से भेदभाव) पर कोशिकाओं के प्रतिलिपिकरण के लक्षण वर्णन भी करता है। यह दिखाया गया है कि विभेदित केराटिनोसाइट्स जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदर्शित करते हैं जो काफी हद तक एपिडर्मल स्तरीकरण के दौरान कोशिकाओं के समान होते हैं। यह जांचने के लिए कि क्या इस विधि का उपयोग त्वचा विकृति का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, हमने ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर p63 के म्यूटेशन को ले जाने वाले केराटिनोसाइट्स की जांच करने के लिए एक ही प्रयोगात्मक और विश्लेषण पाइपलाइन लागू की जो ectrodactyly, एक्टोडर्मल डिस्प्लासिया और फांक होंठ/तालू (ईईसी) सिंड्रोम11,12के साथ रोगियों से प्राप्त होते हैं । यह प्रोटोकॉल केराटिनोसाइट्स के इन विट्रो भेदभाव के साथ-साथ आरएनए-एसईक्यू के बाद के बायोइन्फॉर्मेटिक विश्लेषण पर केंद्रित है। आरएनए निष्कर्षण, आरएनए-सेक्यू नमूना तैयारी और पुस्तकालय निर्माण जैसी पूरी प्रक्रिया में अन्य कदम अच्छी तरह से प्रलेखित हैं और आसानी से पालन किया जा सकता है, खासकर जब कई आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले वाणिज्यिक किट का उपयोग करते हैं। इसलिए, इन कदमों को प्रोटोकॉल में केवल संक्षेप में वर्णित किया गया है। आंकड़ों से पता चलता है कि यह पाइपलाइन स्वस्थ और रोगग्रस्त केराटिनोसाइट्स में एपिडर्मल भेदभाव के दौरान आणविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है।

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Protocol

त्वचा बायोप्सी स्वस्थ स्वयंसेवकों या p63 म्यूटेशन के साथ रोगियों के ट्रंक से लिया गया था, प्राथमिक keratinocyte संस्कृति स्थापित करने के लिए । मानव प्राथमिक केराटिनोसाइट्स की स्थापना के बारे में सभी प्रक्रियाओं को रैडबोड विश्वविद्यालय निजमेगेन मेडिकल सेंटर ("कॉमिसी मेंसगेबॉन्डन ओन्डरज़ोक अर्नहेम-निजमेगेन") की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सूचित सहमति प्राप्त की गई थी ।

1. संपर्क अवरोध द्वारा मानव प्राथमिक केराटिनोसिट भेदभाव

  1. जरूरत पड़ने पर केराटिनोसाइट बेसल मीडियम(मैटेरियल की टेबल)से केराटिनोसिएट ग्रोथ मीडियम (केजीएम) तैयार करें।
  2. पहले से तैयार स्टॉक्स (केजीएम-प्रो; देखें टेबल 1)का उपयोग करके 500 एमएल प्रसार माध्यम बनाएं।
  3. 500 एमएल विभेदन माध्यम (केजीएम-डीआईएफ; टेबल 2देखें) बनाएं।
    नोट: पूरक के साथ केजीएम को दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। लंबे भंडारण के लिए, इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. कोशिका प्रसार क्षमता के आधार पर 5.0-20 x10 3 कोशिकाओं/सेमी2के घनत्व में बीज प्राथमिक केराटिनोसाइट्स। कोशिकाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त केजीएम-प्रो माध्यम जोड़ें।
    नोट: 1) केजीएम माध्यम के भीतर नियमित सेल संस्कृति का विवरण Lonza13की वेबसाइट में पाया जा सकता है । 2) प्रत्येक सेल लाइन के लिए सीडिंग घनत्व का परीक्षण किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, एक सामान्य प्राथमिक केराटिनोसाइट लाइन को 5.0 x 103 कोशिकाओं/सेमी2के घनत्व पर वरीयता दी जा सकती है, जबकि ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर p63 में उत्परिवर्तन ले जाने वाली एक लाइन जो कम प्रसारित होती है, को 20 x 103 कोशिकाओं/सेमी2के घनत्व पर वरीयता दी जानी चाहिए। 3) प्रायोगिक स्थापित के आधार पर, कई व्यंजन या कोशिकाओं के कुओं को प्रतिकृतियों में विभिन्न भेदभाव दिनों पर नमूने एकत्र करने की अनुमति देने के लिए वरीयता दी जानी चाहिए।
  5. सीडिंग के बाद दो दिनों के लिए केजीएम-प्रो माध्यम के साथ कोशिकाओं को ताज़ा करें (0 दिन पर सीडिंग, 3 दिन पर 1 सेंट टाइमके लिए ताज़ा)। बाद में, हर दूसरे दिन केजीएम-प्रो माध्यम के साथ ताज़ा करें। कोशिकाओं की नियमित रूप से जांच करें, कम से कम हर दूसरे दिन।
  6. कोशिका भेदभाव को प्रेरित करें जब कोशिकाएं माध्यम को केजीएम-डिफ में बदलकर 90% से अधिक भ्रमित होती हैं। केजीएम-डिफ में माध्यम बदलने का दिन भेदभाव दिवस 0 के रूप में परिभाषित किया गया है। डीपीबीएस के साथ पहले 2x धोने के द्वारा आगे आरएनए विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करें, बाद में लाइसिस बफर (आरएनए निष्कर्षण किट से) में जोड़ते हैं।
    नोट: उपर्युक्त सीडिंग घनत्व के साथ, कोशिकाओं को 7-10 दिनों के भीतर नरमी तक पहुंचना चाहिए। कोशिकाओं को जल्दी ही भरोसी तक पहुंचने के लिए उच्च प्रारंभिक घनत्व के साथ वरीयता प्राप्त की जा सकती है। यदि कोशिकाएं प्रसारित नहीं होती हैं, तो लंबी प्रतीक्षा पूरी तरह से संकुचित कोशिकाओं को जन्म नहीं दे सकती है। एक उच्च सीडिंग घनत्व की आवश्यकता हो सकती है।
  7. हर दिन केजीएम-डिफ माध्यम के साथ कोशिकाओं को ताज़ा करें और 2, 4 दिन पर कोशिकाओं को इकट्ठा करें। और 7 आगे आरएनए निष्कर्षण के लिए ।

2. आरएनए निष्कर्षण

  1. कुल आरएनए को अलग करें। यह एक वाणिज्यिक आरएनए आइसोलेशन किट (जैसे ज़िमो क्विक-आरएनए माइक्रोप्रिप आरएनए) का उपयोग करके या फिनॉल14का उपयोग करके किया जा सकता है। हालांकि, डीएनए संदूषण और फिनॉल को रोकने के लिए आरएनए-एसईक्यू नमूनों के लिए डीएनएई उपचार युक्त एक आइसोलेशन किट अत्यधिक अनुशंसित है। सामग्री की तालिका में एक वाणिज्यिक आरएनए-आइसोलेशन किट का एक उदाहरण दिया जाता है।
  2. एक स्पेक्ट्रोमीटर के साथ आरएनए एकाग्रता को मापें। डीएनए और आरएनए दोनों में २६० एनएम पर अवशोषण शिखर है ।
    नोट: 1) आरएनए की शुद्धता का आकलन करने के लिए 260 एनएम और 280 एनएम पर अवशोषित के बीच अनुपात का उपयोग किया जाता है। लगभग 2.0 का अनुपात आम तौर पर 'शुद्ध' आरएनए के रूप में स्वीकार किया जाता है। यदि अनुपात 2.0 से काफी कम है, तो नमूना संदूषकों से दूषित हो सकता है जो प्रोटीन, फिनोल या अन्य पदार्थों जैसे 280 एनएम पर अवशोषित होते हैं। 2) 260 एनएम और 230 एनएम पर अवशोषित के बीच अनुपात न्यूक्लिक एसिड शुद्धता को मापता है। 2.0 और 2.2 के बीच अनुपात की उम्मीद है। यदि अनुपात काफी कम है, तो नमूना संदूषकों से दूषित हो सकता है जो 230 एनएम जैसे ईडीटीए, इथेनॉल या अन्य पदार्थों को अवशोषित करते हैं।

3. आरएनए गुणवत्ता की जांच

  1. आरएनए इंटीग्रिटी नंबर (आरआईएन) को मात्रात्मक रूप से मान्य करने के लिए बायोएनालाइजर आरएनए पिको चिप पर या तो आरएनए चलाएं, या गुणात्मक उपाय के लिए जेल पर। सामान्य तौर पर, कम से कम आठ का रिन अत्यधिक उचित है। हालांकि, ऊतकों से आरएनए निकालते समय रिन कम हो सकता है।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, आरएनए सामग्री पर क्यूपीसीआर द्वारा गुणवत्ता नियंत्रण किया जा सकता है।

4. आरएनए-एसईक्यू पुस्तकालय की तैयारी

नोट: आरएनए-एसईक्यू लाइब्रेरी की तैयारी अक्सर वाणिज्यिक किट के साथ या वाणिज्यिक सेटिंग्स के तहत की जाती है। वर्णित प्रोटोकॉल को एक वाणिज्यिक किट, रिबोरेस (इलुमिना) के साथ कापा आरएनए हाइपरप्रीप किट से अनुकूलित किया गया है, जिसमें सभी आवश्यक चरणों का संक्षिप्त विवरण है: मानव रिबोसोमल आरएनए, आरएनए विखंडन, प्रथम-कतरा संश्लेषण, दूसरा-स्ट्रैंड संश्लेषण और ए-टेलिंग, और प्रत्येक चरण15के बाद सफाई के लिए ओलिगो संकरण के साथ कमी। इसके लिए लाइब्रेरी तैयार करने वाली अन्य किट का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके इस चरण को करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि उत्पन्न सीडीएनए पुस्तकालय की गुणवत्ता अक्सर अधिक सुसंगत होती है। 2) 1x पुस्तकालय की तैयारी के लिए निम्नलिखित चरणों का वर्णन किया गया है। यदि कई नमूने तैयार कर रहे हैं, तो मास्टर को 10% अतिरिक्त मात्रा के साथ घोला जा सकता है।

  1. ओलिगो संकरण और आरएनए की कमी
    1. ओलिगो हाइब्रिडाइजेशन मास्टर मिक्स तैयार करें (कुल = 11 माइक्रोन, संकरण बफर के 4.4 माइक्रोन के साथ, संकरण ओलिगोस के 4.4 माइक्रोन, और आरएनएसई-मुक्त पानी के 2.2 माइक्रोन) और कमी मास्टर मिश्रण (कुल = 5.5 माइक्रोन, 3.3 माइक्रोन बफर और आरएनएसई एच के 2.2 माइक्रोन के साथ)।
    2. थर्मोसाइकिलर पर पीसीआर रिएक्शन प्रोग्राम सेट करें: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; रैंप -0.1 डिग्री सेल्सियस पर 45 डिग्री सेल्सियस तक नीचे; 45 डिग्री सेल्सियस ठहराव; 30 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस; 4 डिग्री सेल्सियस हमेशा के लिए।
      नोट: प्रवर्धन के लिए आवश्यक से अधिक आरएनए की दोगुनी राशि के साथ शुरू करने पर विचार करें । पहले प्रयास में, निम्नलिखित चरणों को जारी रखने के लिए राशि का एक-आधा उपयोग करें। यह सुनिश्चित करना है कि इन चरणों को अलग-अलग संख्या में चक्रों के साथ दोहराने के लिए अभी भी सामग्री है (चरण 4.7.2 देखें), यदि प्रवर्धन के चक्र अपर्याप्त या अति-सरल हो जाते हैं।
    3. आरएनईई-मुक्त पानी के 10 माइक्रोन में कुल आरएनए के 25 एनजी और 1 माइक्रोग्राम के बीच उपयोग करें, ओलिगो हाइब्रिडाइजेशन मास्टर मिश्रण के 10 माइक्रोन जोड़ें। पूर्व प्रोग्राम किए गए थर्मोसाइकिलर में नमूने रखें और कार्यक्रम शुरू करें।
    4. जब कार्यक्रम 45 डिग्री सेल्सियस पर ठहराव कदम तक पहुंचता है, तो थर्मोसाइकिलर से इसे हटाने के बिना 20 माइक्रोन हाइब्रिडाइजेशन प्रतिक्रिया में 5 माइक्रोन मास्टर मिश्रण जोड़ें। कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    5. कमी कदम (30 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस) के साथ जारी रखने के लिए थर्मोसाइकिलर कार्यक्रम फिर से शुरू करें।
      नोट: 1) प्रोटोकॉल के अगले भाग के लिए कमी कदम के दौरान कमरे के तापमान (आरटी) पर rRNA कमी (उदाहरण के लिए, KAPA शुद्ध मोती) के लिए मोती रखो । 2) DNase पाचन मास्टर मिश्रण (धारा 4.2 के लिए) तैयार करने पर विचार करें, क्योंकि आरएनए कमी सफाई के बाद सीधे रिएजेंट्स की आवश्यकता होती है।
    6. 2.2x मनका-आधारित कापा शुद्ध मोती सफाई करें: आरएनए मिश्रण (25 माइक्रोन) और कापा प्योर मोतियों (55 माइक्रोन) को अच्छी तरह से बढ़ाकर आरएनए मिश्रण में मोतियों को कई बार पाइपिंग करके फिर से उठाया जाए।
    7. मोतियों के लिए बाध्यकारी आरएनए की अनुमति देने के लिए 5 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें, और तरल स्पष्ट होने तक मोतियों को पकड़ने के लिए एक चुंबक रैक पर ट्यूब (एस) रखें, और ध्यान से हटा दें और 60 माइक्रोन को हटा दें।
    8. चुंबक पर ट्यूब (एस) रखते हुए, ≥30 एस के लिए इथेनॉल के साथ मोतियों को इनक्यूबेटिंग करके 80% इथेनॉल के 200 माइक्रोन के साथ 2x धोएं और इथेनॉल को त्यागें। दूसरी धोने के बाद मोतियों को परेशान किए बिना सभी अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने की कोशिश करें।
    9. 3-5 मिनट के लिए या जब तक सभी इथेनॉल सुखाया है आरटी पर मोती सूखी ।
      नोट: मोतियों को अधिक सुखाने के परिणामस्वरूप उपज कम हो सकती है।
  2. DNase पाचन
    1. DNase पाचन मास्टर मिश्रण (कुल = 22 माइक्रोन, DNase बफर के 2.2 μL के साथ, DNase के 2 μL, और RNase मुक्त पानी के 17.8 माइक्रोन) तैयार करें।
    2. कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके DNAse पाचन मास्टर मिश्रण (20 μL) में मोतियों को फिर से खर्च करें। मोतियों से आरएनए को एल्यूट करने के लिए 3 मिनट के लिए आरटी में ट्यूब (एस) को इनक्यूबेट करें।
    3. मोतियों को पकड़ने के लिए एक चुंबक रैक पर ट्यूब (एस) रखें, जब तक कि तरल स्पष्ट न हो जाए, और ध्यान से 20 माइक्रोन सुपरनटैंट को एक साफ ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. ट्यूब (एस) को सुपरनेटेंट के साथ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: आरएनए एल्यूशन, विखंडन, और भड़काना मास्टर घोला जा सकता है (धारा 4.3 के लिए) तैयार करने पर विचार करें, क्योंकि DNase पाचन सफाई के बाद रिएजेंट्स को सीधे आवश्यकता होती है।
    5. 4.1.6-4.1.9 का पालन करके 2.2x मनका आधारित सफाई प्रदर्शन करें।
  3. आरएनए संवशन, विखंडन, और भड़काना
    1. टुकड़ा, प्राइम और एल्यूट बफर (1x) मास्टर मिक्स को 11 माइक्रोन ऑफ विट, प्राइम और एल्यूट बफर (2x) और 11 माइक्रोन ऑफ आरएनएसई-फ्री वॉटर के साथ तैयार करें ।
    2. अच्छी तरह से ऊपर और नीचे कई पाइपिंग द्वारा विखंडन, प्रधानमंत्री और Elute बफर (1x) के 22 μL में शुद्ध, DNase इलाज आरएनए के साथ मोतियों को फिर से खर्च करें ।
    3. मनका एस से आरएनए को एल्यूट करने के लिए 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेटकरें, फिर तरल स्पष्ट होने तक मोतियों को पकड़ने के लिए ट्यूब (एस) को चुंबक पर रखें।
    4. ध्यान से एक ट्यूब (एस) में सुपरनिटेंट के 20 माइक्रोन स्थानांतरित करें। मोतियों के साथ ट्यूब (एस) त्यागें।
      नोट: यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है, क्योंकि नमूनों को ≤24 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    5. एक थर्मोसाइकिलर में ट्यूब (ओं) रखें और विखंडन को बाहर निकालें और 6 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर भड़काना। जिसके परिणामस्वरूप लगभग 200-300 बीपी लंबे टुकड़े होते हैं।
      नोट: 100-200 बीपी के टुकड़ों के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए इनक्यूबेट। आंशिक रूप से अवक्रमित आरएनए का उपयोग करते समय, गिरावट की गंभीरता के आधार पर 85 डिग्री सेल्सियस पर 1-6 मिनट के बीच टुकड़ा।
    6. ट्यूब (एस) को बर्फ पर रखें और पहले स्ट्रैंड संश्लेषण के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
  4. पहला स्ट्रैंड संश्लेषण
    1. पहले स्ट्रैंड सिंथेसिस मास्टर मिक्स (कुल = 12 माइक्रोन, पहले स्ट्रैंड संश्लेषण बफर के 11 माइक्रोन और KAPA स्क्रिप्ट के 1 माइक्रोन के साथ) तैयार करें।
    2. थर्मोसाइकिलर पर पीसीआर रिएक्शन प्रोग्राम सेट करें: 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस; 15 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस; 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस; 4 डिग्री सेल्सियस हमेशा के लिए।
    3. बर्फ पर, पहले स्ट्रैंड संश्लेषण मास्टर मिक्स के 10 माइक्रोन के साथ खंडित प्राइमेड आरएनए के 20 माइक्रोन को मिलाएं। ट्यूब (एस) बर्फ पर रखें, धीरे से प्रतिक्रिया को कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    4. ट्यूब (एस) को पूर्व-प्रोग्राम किए गए थर्मोसाइकिलर में रखें और कार्यक्रम शुरू करें।
  5. दूसरा स्ट्रैंड संश्लेषण और ए-टेलिंग
    1. बर्फ पर दूसरा स्ट्रैंड संश्लेषण और ए-टेलिंग मास्टर मिक्स (कुल = 33 माइक्रोन, दूसरे स्ट्रैंड संश्लेषण बफर के 31 माइक्रोन और दूसरे स्ट्रैंड संश्लेषण और ए-टेलिंग एंजाइम मिश्रण के 2 माइक्रोन के साथ) तैयार करें।
    2. थर्मोसाइकिलर पर पीसीआर रिएक्शन प्रोग्राम सेट करें: 30 मिनट के लिए 16 डिग्री सेल्सियस; 10 मिनट के लिए 62 डिग्री सेल्सियस; 4 डिग्री सेल्सियस हमेशा के लिए।
    3. दूसरे स्ट्रैंड संश्लेषण और ए-टेलिंग मास्टर मिक्स के 30 माइक्रोन के साथ पहले स्ट्रैंड सिंथेसिस उत्पाद के 30 माइक्रोन को मिलाएं, और बर्फ पर कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    4. ट्यूब (एस) को पूर्व-प्रोग्राम किए गए थर्मोसाइकिलर में रखें और कार्यक्रम शुरू करें।
  6. एडाप्टर लिगेशन और पोस्ट-लिगेशन क्लीनअप
    1. पतला स्टॉक एडाप्टर (NEXTflex डीएनए बारकोड, 25 माइक्रोनएम) 3.57x RNase-मुक्त पानी में 7 μM करने के लिए ।
    2. एडाप्टर लिगाशन मास्टर मिक्स (कुल = 50 माइक्रोन, लिगेशन बफर के 40 माइक्रोन और डीएनए लिगाज़ के 10 माइक्रोल के साथ) तैयार करें।
    3. दूसरे स्ट्रैंड सिंथेसिस उत्पाद के 60 माइक्रोन, एडाप्टर लिगेशन मास्टर मिक्स के 45 माइक्रोन, और पतला एडाप्टर के 5 माइक्रोन मिलाएं। बर्फ पर कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    4. ट्यूबों को 15 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और पहले पोस्ट लिगेशन क्लीनअप के साथ तुरंत जारी रखें।
    5. एडाप्टर-लिगाटेड डीएनए (110 माइक्रोन) और कापा शुद्ध मोतियों (70 माइक्रोन) के संयोजन से 0.63x मनका-आधारित सफाई करें, फिर डीएनए मिश्रण में मोतियों को कई बार ऊपर और नीचे करके अच्छी तरह से पुनर्निर्धारण करें।
    6. कदम दोहराएं 4.1.7-4.1.9।
    7. चुंबक से ट्यूब निकालें। 10 mM Tris HCL (पीएच = 8.0-8.5) के 50 माइक्रोन में मोतियों को अच्छी तरह से फिर से खर्च करें और 2 मिनट के लिए आरटी पर मोतियों को इनक्यूबेट करें।
    8. चुंबक पर प्लेट रखें और तरल स्पष्ट होने तक प्रतीक्षा करें। एक नई ट्यूब के लिए स्पष्ट सुपरनैंट के 50 माइक्रोन स्थानांतरित करें।
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे से कम के लिए सुरक्षित रोक बिंदु।
    9. खूंटी/एनएसीएल समाधान के 35 माइक्रोन के साथ शुद्ध एडाप्टर-लिगाटेड डीएनए के साथ मोतियों की 50 माइक्रोन के संयोजन से 0.7x मनका आधारित सफाई करें। भंवर से अच्छी तरह मिलाएं।
    10. सफाई चरण 4.1.7-4.1.9 प्रदर्शन करें। 10 mM Tris HCL (पीएच = 8.0-8.5) के 20 माइक्रोन में मोतियों को अच्छी तरह से फिर से खर्च करें, और 2 मिनट के लिए आरटी पर मोतियों को इनक्यूबेट करें।
    11. चुंबक पर प्लेट रखें; जब तक तरल स्पष्ट है रुको। एक नई ट्यूब के लिए स्पष्ट सुपरनैंट के 20 माइक्रोन ट्रांसफर करें और सेक्शन 4.7 पर आगे बढ़ें।
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस या 1 महीने से कम समय में -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह से कम समय के लिए सुरक्षित रोक बिंदु।
  7. पुस्तकालय प्रवर्धन और सफाई
    1. 2x KAPA HiFi HotStart रेडमिक्स के 27.5 माइक्रोन और 10x पुस्तकालय प्रवर्धन प्राइमर मिक्स के 5.5 माइक्रोन के साथ पुस्तकालय प्रवर्धन मास्टर मिक्स (कुल = 33 माइक्रोन) तैयार करें।
    2. निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग कर एक थर्मोसाइकिलर पर पीसीआर प्रतिक्रिया कार्यक्रम स्थापित करें। 45 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; एन चक्र (नीचे नोट देखें) के: 15 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस; 30 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; और हमेशा के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
      नोट: पुस्तकालय प्रवर्धन के लिए चक्र इनपुट सामग्री पर निर्भर करते हैं। इसका अनुमान लगभग इस तरह से लगाया जा सकता है: आरएनए = 25-100 एनजी, एन = 11-15 चक्रों से शुरू; 100-250 एनजी, एन = 9-12 चक्र; 250-500 एनजी, एन = 7-10 चक्र।
    3. प्रवर्धित पुस्तकालय डीएनए (50 माइक्रोन) और कापा शुद्ध मोतियों (40 माइक्रोन) के संयोजन से 0.8x मनका-आधारित सफाई करें, फिर डीएनए मिश्रण में मोतियों को कई बार ऊपर और नीचे करके अच्छी तरह से पुनर्व्यवसाित करें।
    4. सफाई चरण 4.1.7-4.1.9 प्रदर्शन करें। 10 mM Tris HCL (पीएच = 8.0-8.5) के 50 माइक्रोन में मोतियों को अच्छी तरह से फिर से खर्च करें, और 2 मिनट के लिए आरटी पर मोतियों को इनक्यूबेट करें।
    5. एक नई ट्यूब के लिए स्पष्ट सुपरनेटेंट के 50 μL हस्तांतरण और दूसरी पुस्तकालय प्रवर्धन सफाई के लिए आगे बढ़ना।
    6. प्रवर्धित पुस्तकालय डीएनए (50 माइक्रोन) और कापा शुद्ध मोतियों (50 माइक्रोन) के संयोजन से 1x मनका-आधारित सफाई करें, फिर डीएनए मिश्रण में मोतियों को कई बार ऊपर और नीचे करके अच्छी तरह से फिर से खर्च करें।
    7. सफाई चरण 4.1.7-4.1.9 प्रदर्शन करें। 10 एमएम ट्रिस एचसीएल (पीएच = 8.0-8.5) के 22 माइक्रोन में मोतियों को अच्छी तरह से फिर से खर्च करें, और 2 मिनट के लिए आरटी पर मोतियों को इनक्यूबेट करें।
    8. एक नई ट्यूब के लिए स्पष्ट सुपरनिटेंट के 20 माइक्रोन को क्यूबिट और बायोएनालाइजर माप में स्थानांतरित करें।
  8. एकाग्रता और विखंडन आकार
    1. नमूनों की डीएनए सांद्रता को मापें। एक अत्यधिक संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई-आधारित किट (उदाहरण के लिए, डेनोविक्स क्यूबिट, सामग्री की तालिकादेखें), या यदि एकाग्रता 0.5 एनजी/माइक्रोन से नीचे प्रतीत होती है, तो अधिक संवेदनशील क्यूपीसीआर दृष्टिकोण (जैसे, कापा क्वांटिफिकेशन, टेबल ऑफ मैटेरियल्सदेखें) का उपयोग करके फिर से सीमित करें।
    2. उच्च संवेदनशील इलेक्ट्रोफोरेसिस (जैसे, एक बायोएनालाइजर) का उपयोग करके पुस्तकालय के टुकड़े आकार का निर्धारण करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, क्यूपीसीआर द्वारा गुणवत्ता नियंत्रण सीडीएनए के बजाय पतला तैयार पुस्तकालय का उपयोग करके अनुक्रमण (परिशिष्ट) से पहले किया जा सकता है।
  9. अनुक्रमण
    1. अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय भेजें। आरएनए-एसईक्यू अंतर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, प्रति नमूना 10-25 मिलियन के बीच पढ़ता की अनुक्रमण गहराई आम तौर पर पर्याप्त होती है।

5. डेटा प्री-प्रोसेसिंग

  1. गुणवत्ता की जांच Fastq फ़ाइलें
    1. फास्टक्यू फाइलों के भीतर कम गुणवत्ता वाले आधार जोड़े और खाली रीड को हटाने के लिए ट्राइंगलोर16 डाउनलोड करें और इंस्टॉल करें।
      नोट: 1) यहां उल्लिखित अधिकांश सॉफ्टवेयर केवल लिनक्स में काम करता है। यदि विंडोज कंप्यूटर तक सीमित है, तो सॉफ्टवेयर मोबाएक्सटर्म या पुट्टी का उपयोग करके लिनक्स सर्वर पर विश्लेषण चलाना संभव है। ध्यान रखें कि जीनोम इंडेक्सिंग के लिए बहुत सारे रैंडम-एक्सेस मेमोरी (रैम) की आवश्यकता होती है (लगभग 64 जीबी)। 2) एक कोंडा वातावरण में सभी आवश्यक सॉफ्टवेयर स्थापित करने की अत्यधिक सिफारिश की है। इससे आसान सॉफ्टवेयर इंस्टॉलेशन और पैकेज मैनेजमेंट हो सकेगा। कोंडा के बारे में अधिक जानकारी के लिए, यात्रा ।
    2. डेटा के लिए एक निर्देशिका (फ़ोल्डर) बनाएं जैसे फ़ोल्डर 'RNA_seq_KC_diff'। इसे टाइप करके वर्किंग डायरेक्टरी के रूप में सेट करें: "सीडी/होम/यूजर/RNA_seq_KC_diff/" ।
      नोट: फ़ोल्डर संरचना के अवलोकन के लिए, पूरक कोडिंग फ़ाइलों में 'folder_structure.txt' देखें।
    3. विशिष्ट नामों के साथ कार्य निर्देशिका में कई फ़ोल्डर बनाएं: 'फास्टक्यू', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', 'स्क्रिप्ट', और 'मानचित्रण'।
    4. अनुक्रमित डेटा की फास्टा फाइलों को फास्टक्यू फ़ोल्डर में ले जाएं। वैकल्पिक रूप से, आदेश का उपयोग कर नरम लिंक उत्पन्न करें: "एलएन-एस होम/यूजर/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile" डिस्क स्पेस को बचाने के लिए Fastq फ़ाइलों के लिए ।
    5. फास्टक्यू फ़ाइलों पर ट्रिम प्रचुर मात्रा में भागें, कोड के लिए TrimGalore.txt फ़ाइल को बैश में पेस्ट कॉपी करने के लिए देखें। जहां आवश्यक हो, कमांड के भीतर फ़ोल्डर नाम और सेटिंग्स बदलें।
  2. मैपिंग
    1. एक जीनोम डाउनलोड करने के लिए पढ़ता है नक्शा, उदाहरण के लिए, hg38 ensembl रिलीज ९७ (नकाब संस्करण): ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz; और इसी जीन एनोटेशन फाइल: एचजी 38 जीन एनोटेशन एनसेम्बल रिलीज 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. दोनों फाइलों को CRCh38_fasta फोल्डर में स्थानांतरित करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से जीनोम के एक अलग संस्करण का उपयोग करें, उदाहरण के लिए, hg38 के UCSC संस्करण, अगर जीन टीडीएस के बजाय ट्रांसक्रिप्ट IDS के लिए मानचित्रण पसंद किया जाता है ।
    2. स्टार 2.7.117 स्थापितकरें ।
    3. उत्पन्न जीनोम लिपि द्वारा स्टार 2.7.1 का उपयोग करके एक इन-हाउस संदर्भ जीनोम उत्पन्न करें (पूरक कोडिंग फ़ाइलेंदेखें)। पितरों की मात्रा को प्रोसेसर (--runThreadN X) में बदलें। जहां आवश्यक हो इस स्क्रिप्ट में फ़ोल्डर नाम और सेटिंग्स बदलें। इसे कॉपी/पेस्टिंग से बैश में चलाएं ।
    4. विगल फाइलों को सेक करने के लिए बाम फाइल्स और जीज़िप को इंडेक्स करने के लिए1.9 18 samtools स्थापित करें।
    5. ट्रिम प्रचुर मात्रा में मान्य अनुक्रमण को संरेखित करें मानव जीनोम असेंबली hg38 (एनसेम्बल रिलीज 97) को स्टार 2.7.1 का उपयोग करके पढ़ता है और इसके बाद सामटूल और जीज़िप का उपयोग करके अनुक्रमण किया जाता है। यह स्क्रिप्ट map_fastq.txt (पूरक कोडिंग फ़ाइलेंदेखें) का उपयोग करके किया जाना चाहिए। जहां आवश्यक हो इस स्क्रिप्ट में फ़ोल्डर नाम और सेटिंग्स बदलें। इसे बैश में कॉपी/चिपकाकर चलाएं ।
      नोट: स्टार मैपिंग कई आउटपुट फ़ाइलें उत्पन्न करती है, जिनमें एक बाम फ़ाइल, एक विगल फ़ाइल, और * _ReadsPerGene.आउट.टैब नाम की काउंट टेबल पढ़ें, जिसका उपयोग सीधे आर द्वारा Deseq2 के लिए इनपुट के रूप में उपयोग करने के लिए किया जा सकता है।
  3. जीनोम ब्राउज़र विज़ुअलाइज़ेशन
    1. big2bw स्क्रिप्ट19के साथ बिगविग फाइल्स जेनरेट करने के लिए यूसीएससी जीनोम ब्राउजर टूल्स से विगटोबिग स्थापित करें ।
    2. कार्य निर्देशिका में पूरक कोडिंग फाइलों से 'convertBigWigChroms.py' और 'CRCH38_ensembl2UCSC.txt' फ़ाइलों को फ़ोल्डर 'स्क्रिप्ट' में स्थानांतरित करें।
    3. convertBigWigChroms.py को एक क्रियाक्वी (आदेश का उपयोग करके: लिनक्स मशीन पर 'chmod +x लिपियों/कन्वर्टेडबिगवक्रोम्स.py) बनाएं।) ।
    4. स्क्रिप्ट विग 2बीडब्ल्यू.txt (पूरक कोडिंगफ़ाइलें देखें) का उपयोग करके विगल फ़ाइलों से बिगविग फ़ाइलें उत्पन्न करें। इसे कॉपी/पेस्टिंग से बैश में चलाएं ।
    5. यूसीएससी जीनोम ब्राउज़र या एकीकृत जीनोमिक्स व्यूअर (आईजीवी) पर विजुअलाइजेशन के लिए बिगविग फाइल्स को इनपुट करें।

6. आरएनए-एसईक्यू डेटा विश्लेषण

  1. Deseq2 में इनपुट नमूना डेटा
    1. डाउनलोड करें और आरएसट्यूडियो (संस्करण 1.1.456) और आर (संस्करण 3.6) स्थापित करें।
    2. सभी आवश्यक आर पैकेज स्थापित करें (पूरक कोडिंग फ़ाइलें देखें)।
      नोट: सभी प्रोग्रामिंग कोड और आउटपुट दिखाने वाली विस्तृत आर-मार्कडाउन फ़ाइल के लिए, संलग्न फ़ाइलों को देखें: "RNA_seq_kc_differentiation_wt.html" और "RNA_seq_kc_differentiation_patient.html"। सभी चरणों का एक सामान्य विवरण नीचे शामिल है।
    3. ReadsPerGene.out.tab फ़ाइलों से एक गिनती तालिका उत्पन्न करें।
    4. एक नमूना डेटा फ़ाइल लिखें, जिसमें सभी फाइलनाम, भेदभाव का दिन और अन्य प्रासंगिक नमूना डेटा शामिल हैं। उदाहरण के लिए नमूना फ़ाइल के लिए, पूरक कोडिंग फ़ाइलोंमें "sample_data_example.csv" देखें।
    5. गिनती और नमूना डेटा दोनों युक्त Deseq220 वस्तु उत्पन्न करने के लिए गिनती तालिका और नमूना डेटा का उपयोग करें।
  2. जीन अभिव्यक्ति सामान्यीकरण, नमूना दूरी और पीसीए
    1. Deseq2 ऑब्जेक्ट में गिनती तालिका को सामान्य करें, या तो Deseq2 आरएलडी, या vst सामान्यीकरण का उपयोग करके। आरएलडी सामान्यीकरण पसंद किया जाता है, लेकिन कई नमूनों के साथ, वी एसटी सामान्यीकरण बहुत तेज है।
    2. आर में"जिला"समारोह का उपयोग करके सामान्यीकृत पढ़ी गई गणना तीव्रता के आधार पर प्लॉट नमूना दूरी और बाद में नमूना दूरी के आधार पर"एचसीलस्ट"क्लस्टरिंग का प्रदर्शन करना। हीटमैप पैकेज का उपयोग करके ही प्लॉट करें।
    3. Deseq2 के plotPCA समारोह का उपयोग कर सामान्यीकृत पढ़ें गिनती तीव्रता का एक पीसीए भूखंड उत्पन्न करें।
      नोट: पीसीए अन्वेषणात्मक डेटा विश्लेषण में एक उपकरण के रूप में कार्य करता है और विभिन्न नमूनों के बीच दूरी और संबंधितता की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. अंतर/अत्यधिक चर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण
    1. Deseq2 परिणाम समारोह का उपयोग कर या तो अंतर जीन की गणना करें। हालांकि, कई टाइमपॉइंट्स पर परिवर्तनों का आकलन करते समय, जिनमें जोड़ीवार तुलना लागू नहीं होती है, अत्यधिक चर जीन का उपयोग करें। इस मामले में, rowVars समारोह के साथ विभिन्न समय बिंदुओं से नमूनों के बीच विचरण पर आदेश के माध्यम से शीर्ष 500 अत्यधिक चर जीन निकालें।
      नोट: हमारे विश्लेषण में, नियंत्रण नमूनों के लिए, शीर्ष ५०० अत्यधिक चर जीन (भेदभाव के दिनों में उनके सामांय तीव्रता के उच्चतम मानक विचलन के साथ जीन) आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया । हालांकि, रोगग्रस्त बनाम नियंत्रण विश्लेषण के लिए समय के साथ रोग और स्वस्थ नियंत्रण के बीच जीन व्यक्त की गई एक कटऑफ के रूप में 1 x10-4 के एक कई परीक्षण सही पी मूल्य का उपयोग कर Deseq2 द्वारा गणना की गई । एक और संभव फ़िल्टरिंग कदम एक निश्चित गुना परिवर्तन कटऑफ से कम बदलने वाले अंतर जीन को बाहर करना है।
    2. विभिन्न अभिव्यक्ति पैटर्न द्वारा उन्हें क्लस्टर करने के लिए अंतर या अत्यधिक चर जीन पर kmeans क्लस्टरिंग प्रदर्शन करते हैं।
    3. जई के पैकेज का उपयोग करके हीटमैप में अंतर या अत्यधिक परिवर्तनीय जीन की कल्पना करें। हीटमैप में प्लॉट की गई तीव्रता औसत मूल्य घटाया के साथ Deseq2 सामान्यीकृत तीव्रता है।
  4. जीन ओंटोलॉजी (GO) एनोटेशन एनरिचमेंट विश्लेषण
    1. एक ही नमूने में 10 से अधिक मामलों के साथ सभी जीन लेने के द्वारा व्यक्त पृष्ठभूमि जीन की एक सूची उत्पन्न करें ।
    2. GOrilla21जैसे ऑनलाइन उपकरणों का उपयोग करके जाओ विश्लेषण करें । समूहों में अंतर/अत्यधिक चर जीन की सूचियों का उपयोग "जीन सूची" के रूप में करें, और तुलना के लिए पृष्ठभूमि के रूप में पृष्ठभूमि जीन ।
      नोट: अधिक उन्नत आर-उपयोगकर्ता गो-टर्म संवर्धन विश्लेषण को स्वचालित करने के लिए पैकेज क्लस्टरप्रोफिलर22 का उपयोग कर सकते हैं।

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Representative Results

सामान्य केराटिनोसाइट भेदभाव और आरएनए-सेक्यू विश्लेषण
इस प्रयोग में, पांच व्यक्तियों से प्राप्त केराटिनोसाइट लाइनों का उपयोग भेदभाव और आरएनए-सेक्यू विश्लेषण के लिए किया गया था। चित्रा 1 भेदभाव और आरएनए-एसईक्यू विश्लेषण परिणामों की प्रयोगात्मक प्रक्रिया को संक्षेप में प्रस्तुत करता है। विवर्तन के दौरान सामान्य केराटिनोसाइट्स और सेल आकृति विज्ञान परिवर्तनों की इन विट्रो विक्टो विक्टिशन प्रक्रियाओं का अवलोकन चित्र 1 एमें दर्शाया गया है । सिद्धांत घटक विश्लेषण (पीसीए) से पता चला है कि भेदभाव के दौर से गुजर रहे keratinocytes जुड़ा हुआ था, लेकिन अलग समग्र जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल(चित्रा 1B)। अत्यधिक चर जीन को केमियन द्वारा भेदभाव(चित्रा 1C)के दौरान जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता और पैटर्न की कल्पना करने के लिए संकुलित किया गया था।

जीन के प्रत्येक क्लस्टर का प्रतिनिधित्व केराटिनोसिटे विभेदन हॉलमार्क जीन (उदाहरण के लिए, प्रसार के लिए KRT5, जल्दी और मध्य भेदभाव के लिए KRT10, औरवीएल/LOR/FLG देर से भेदभाव के लिए) द्वारा किया गया था । जीन ऑन्टोलॉजी (जीओ) अत्यधिक चर जीन समूहों(चित्रा 1 सी)के एनोटेशन विश्लेषण ने इन जीन समूहों (उदाहरण के लिए, भेदभाव के मध्य चरणों में केराटिनाइजेशन; और एपिडर्मल सेल भेदभाव, केराटिनोसासाइट भेदभाव, और देर चरणों में पेप्टाइड क्रॉस-लिंकिंग) के जीन कार्यों में स्पष्ट अंतर दिखाया; चित्रा 1D)। कई भेदभाव मार्कर की प्रोटीन अभिव्यक्ति पश्चिमी दाग(चित्रा 1E)द्वारा मापा गया ।

P63 उत्परिवर्ती केराटिनोसाइट भेदभाव और आरएनए-सेक्यू विश्लेषण:
दूसरे प्रयोग में, सेल आकृति विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति मतभेदों की तुलना स्वस्थ नियंत्रण से केराटिनोसाइट्स और p63 म्यूटेशन (म्यूटेंट R204W, R279H, और R304W) ले जाने वाले रोगियों से प्राप्त तीन लाइनों के बीच की गई थी। चित्रा 2A भेदभाव प्रक्रियाओं और सेल आकृति विज्ञान परिवर्तन का अवलोकन दिखाता है। उत्परिवर्ती केराटिनोसाइट्स पकवान की सतह पर सपाट रहे और 7 दिन पर नियंत्रण केराटिनोसाइट्स के रूप में भीड़ या ओवरलैप विकास नहीं हो गए।

पीसीए विश्लेषण में, नियंत्रण कोशिका लाइनों ने चित्रा 1Bकी तुलना में स्पष्ट रूप से भेदभाव पैटर्न का पालन किया। हालांकि, भेदभाव के दौरान उत्परिवर्ती कोशिकाओं की जीन अभिव्यक्ति का पैटर्न काफी हद तक प्रसार/अविभेदित कोशिकाओं के समान रहता है । तीन उत्परिवर्ती लाइनों में, R279 नमूनों को कुछ हद तक PC1 और PC2 के साथ स्थानांतरित कर दिया, यह दर्शाता है कि इसका भेदभाव R204W और R304W की तुलना में कम बिगड़ा हुआ था।

क्लस्टरिंग विश्लेषण(चित्रा 2सी)में, नियंत्रण कोशिकाओं में जीन को अवर्णनीय (क्लस्टर 1) R204W और R279W में आंशिक रूप से डाउनरेगुनेर किया गया था, लेकिन R304W में उनकी जीन अभिव्यक्ति में काफी बदलाव नहीं आया । ये जीन कोशिका प्रसार में भूमिकाएं निभाते हैं, जैसा कि गो एनोटेशन(चित्रा 2D)द्वारा दिखाया गया है। क्लस्टर 2(चित्रा 2सी)में, जीन को पहले प्रेरित किया गया था और बाद में नियंत्रण कोशिकाओं में डाउनरेगुएक था। इन जीनों की संभावना केराटिनोसिटे भेदभाव में शामिल हैं, क्योंकि एपिडर्मल भेदभाव और केराटिनाइजेशन कार्य इस क्लस्टर जीन(चित्रा 2 डी)के लिए अत्यधिक समृद्ध थे। इन जीन R204W और R304W में प्रेरित नहीं थे, जबकि R279H कोशिकाओं में, इन जीन प्रेरित किया गया, लेकिन नियंत्रण कोशिकाओं के रूप में ज्यादा के रूप में नीचे विनियमित नहीं ।

क्लस्टर 3 में जीन केवल नियंत्रण कोशिकाओं(चित्रा 2D)में भेदभाव के अंत में प्रेरित किया गया । इसके अनुरूप, इन जीनों की एपिडर्मिस की बाहरी सबसे परत में भूमिका हो सकती है, क्योंकि उन्हें बाहरी उत्तेजनाओं और सूजन(चित्रा 2डी)के प्रति उत्तरदायी दिखाया गया है। इन जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न में तीनों उत्परिवर्ती कोशिका रेखाओं में ज्यादा बदलाव नहीं आया। नियंत्रण और उत्परिवर्ती कोशिकाओं के बीच जीन अभिव्यक्ति पैटर्न में दिखाई अंतर प्रदर्शित करता है कि उत्परिवर्ती कोशिकाओं को इन विट्रो भेदभाव मॉडल में ठीक से अंतर नहीं कर सकते ।

Figure 1
चित्रा 1: केराटिनोसाइट भेदभाव और विश्लेषण। (क) केराटिनोसिटे विभेदन प्रोटोकॉल और सेल आकृति विज्ञान का अवलोकन। स्केल बार = 100 माइक्रोन. (बी) नियंत्रण केराटिनोसाइट्स में अंतर करने का सिद्धांत घटक विश्लेषण। (ग) केराटिनोसिट भेदभाव के दौरान शीर्ष ५०० अत्यधिक चर जीन का हीटमैप । जीन को केमियन क्लस्टरिंग का उपयोग करके तीन समूहों में संकुल किया जाता है। प्रत्येक जीन क्लस्टर के लिए प्रतिनिधि भेदभाव मार्कर जीन पक्ष में इंगित कर रहे हैं । (घ) सभी व्यक्त जीनों (जीटी/10 की गणना) की पृष्ठभूमि की तुलना में अत्यधिक परिवर्तनीय जीन समूहों में जीनों के लिए अतिप्रतिनिधित्व कार्यों का शब्द संवर्धन विश्लेषण करें । संवर्धन परीक्षण के लिए GOrilla का उपयोग किया गया था। (ङ) विभेदन के दौरान केराटिनोसिटे विभेदन मार्कर का पश्चिमी दाग । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: नियंत्रण और p63 उत्परिवर्ती keratinocytes की तुलना। (क) केराटिनोसिट विभेदन प्रोटोकॉल और नियंत्रण की कोशिका आकृति विज्ञान और p63 उत्परिवर्ती केराटिनोसाइट्स का अवलोकन । स्केल = 100 माइक्रोन( बी) अंतर नियंत्रण और रोगी (R204W, R279H और R304W) keratinocytes के सिद्धांत घटक विश्लेषण। (ग) नियंत्रण और उत्परिवर्ती केराटिनोसाइट्स के बीच अंतर जीन का हीटमैप । जीन को केमियन क्लस्टरिंग का उपयोग करके तीन समूहों में संकुल किया जाता है। प्रत्येक जीन क्लस्टर के लिए प्रतिनिधि भेदभाव मार्कर जीन इंगित किए जाते हैं। (घ) सभी व्यक्त जीनों (जीटी/10 की गणना) की पृष्ठभूमि की तुलना में अत्यधिक परिवर्तनीय जीन समूहों में जीनों के लिए अतिप्रतिनिधित्व कार्यों का शब्द संवर्धन विश्लेषण करें । संवर्धन परीक्षण के लिए GOrilla का उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

केजीएम घटक भंडार मध्यम आयतन
केबीएम 500 एमएल
पेन/स्ट्रेप 100,000 यूनिट/एमएल 100 यूनिट/एमएल 5 एमएल
बीपीई ~ 13 मिलीग्राम/एमएल 0.4% 2 एमएल
इथेनॉलमाइन 0.1 मीटर 0.1 mm 500 माइक्रोल
ओ-फॉस्फोथेनलमाइन 0.1 मीटर 0.1 mm 500 माइक्रोल
हाइड्रोकॉर्टिसोन 0.5 मिलीग्राम/एमएल 0.5 माइक्रोग्राम/एमएल 500 माइक्रोल
इनसुलिन 5 मिलीग्राम/एमएल 5 μg/mL 500 माइक्रोल
ईजीएफ 10 μg/एमएल 10 एनजी/एमएल 500 माइक्रोल

तालिका 1. केजीएम-प्रो मीडियम सप्लीमेंट।

केजीएम घटक भंडार मध्यम आयतन
केबीएम 500 एमएल
पेन/स्ट्रेप 100,000 यूनिट/एमएल 100 यूनिट/एमएल 5 एमएल
इथेनॉलमाइन 0.1 मीटर 0.1 mm 500 माइक्रोल
ओ-फॉस्फोथेनलमाइन 0.1 मीटर 0.1 mm 500 माइक्रोल

तालिका 2. केजीएम-डिफ मीडियम सप्लीमेंट।

पूरक कोडिंग फ़ाइलें: Folder_structure.txt; Generate_genome.txt; Map_fastq.txt; RNA_seq_kc_differentiation_patient.html; RNA_seq_kc_differentiation_wt.html; Sample_data_example.csv; ट्रिमगलोर.txt; और Wig2bw.txt। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह काम आरएनए-सेक्यू विश्लेषणों का उपयोग करके मानव केराटिनोसिटे भेदभाव और बाद में लक्षण वर्णन को प्रेरित करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। वर्तमान साहित्य में, मानव केराटिनोसिटे भेदभाव पर कई अध्ययन दो अन्य तरीकों का उपयोग करते हैं, जिसमें उच्च कैल्शियम एकाग्रता या सीरम के साथ भेदभाव2,3,23को प्रेरित करने के तरीकों के रूप में होता है। एक पिछली रिपोर्ट ध्यान से इन तीन अलग तरीकों3 की तुलना में और पता चला है कि इन तरीकों keratinocyte भेदभाव के अलग जीव विज्ञान का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । इसी रिपोर्ट में, लेखकों ने दिखाया कि सीरम द्वारा प्रेरित विभेदित कोशिकाओं में उच्च प्रसार क्षमता होती है और व्यक्त जीन जैसे केआरटी16 और स्कल्प/पीआई 3 जो सोरायसिस त्वचा में व्यक्त किए जाते हैं, लेकिन सामान्य एपिडर्मिस में नहीं, और इसलिए सीरम-प्रेरित विभेदण मॉडल का उपयोग सोरायसिस का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है । इसके विपरीत, संपर्क अवरोध प्लस विकास कारक बहिष्कार की विधि KRT1 और KRT10 को प्रेरित कर सकती है, जो सामान्य रूप से एपिडर्मिस में व्यक्त किए जाते हैं और सामान्य केराटिनोसाइट भेदभाव के समान होते हैं। उच्च कैल्शियम प्रेरण एक जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल को जन्म देता है जो सीरम प्रेरण और संपर्क अवरोध के बीच होता है, कम से कम विशिष्ट विधि के रूप में। भेदभाव के दौरान आरएनए-एसईक्यू विश्लेषणों का उपयोग करने वाले विश्लेषणों ने पुष्टि की कि संपर्क अवरोध के साथ-साथ विकास कारक अपवर्जन की विधि के परिणामस्वरूप इसी तरह के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ विभेदित केराटिनोसाइट्स में परिणाम होता है, जैसे कि एपिडर्मल भेदभाव के लिए अपेक्षित (उदाहरण के लिए, जल्दी विभेदन प्रेरण में कोशिकाओं, KRT1 और KRT10 में KRT5, और देर से भेदभाव में लोर और एफएलजी; चित्रा 1C)।

इन निष्कर्षों से पता चलता है कि यह भेदभाव तकनीक केराटिनोसिटे भेदभाव का अध्ययन करने के लिए एक आसान उपयोग और विश्वसनीय तरीका है। इसके अलावा, p63 उत्परिवर्ती केराटिनोसाइट्स से प्राप्त केराटिनोसाइट्स पर यह काम यह भी दर्शाता है कि रोगग्रस्त परिस्थितियों में प्रभावित केराटिनोसिटे भेदभाव का अध्ययन करने के लिए विधि का उपयोग किया जा सकता है। इस इन विट्रो भेदभाव दृष्टिकोण में, लोन्ज़ा से खरीदे गए केजीएम का उपयोग किया जाता है, क्योंकि यह माध्यम लगातार परिणाम देता है। सिद्धांत रूप में, थर्मो फिशर साइंटिफिक से केराटिनोसाइट सीरम-मुक्त माध्यम (केएसएफएम) जैसी समान संरचना के साथ अन्य एपिडर्मल माध्यम भी उपयुक्त है, हालांकि इसका परीक्षण करने की आवश्यकता है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस विधि की कुछ सीमाएं हैं। चूंकि यह संपर्क अवरोध पर आधारित है, इसलिए कोशिका घनत्व की उदारता की आवश्यकता होती है। p63 उत्परिवर्ती केराटिनोसाइट्स के साथ हमारे प्रयोगों में, कोशिकाओं को नरमी तक पहुंचने के लिए सुनिश्चित करने के लिए एक उच्च प्रारंभिक सीडिंग घनत्व आवश्यक हो गया है। इसके अलावा, जब कोशिकाएं एक ही गति के साथ नहीं बढ़ती हैं, तो कभी-कभी अलग-अलग दिनों में भेदभाव को प्रेरित किया जाना चाहिए। प्रयोग स्थापित करते समय इन बातों को ध्यान में रखा जाना चाहिए । प्रायोगिक सेटिंग्स में जहां कोशिकाओं को एक ही समय में प्रेरित करने की आवश्यकता होती है, अन्य भेदभाव विधियों पर विचार किया जाना चाहिए, जिसमें सीरम का जोड़, कैल्शियम की उच्च सांद्रता, और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर्स2,3का अवरोध शामिल है। फिर भी, सभी इन विट्रो भेदभाव विधियों में पेशेवरों और विपक्षों होते हैं, क्योंकि वे शायद आंशिक विभेदन प्रेरण संकेतों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो वीवो त्वचा विकास2में मौजूद हैं।

एक व्यापक आणविक विश्लेषण जो इन विभिन्न विधियों की तुलना करता है वह अत्यधिक जानकारीपूर्ण होगा और जैविक प्रक्रियाओं पर विभिन्न अध्ययनों के लिए सबसे उपयुक्त विधि के विकल्प को निर्देश दे सकता है। इसके अलावा, ट्रांसपोसिक स्तर पर मापा परिवर्तनों को मान्य करना अत्यधिक सलाह दी जाती है, उदाहरण के लिए, पश्चिमी ब्लॉटिंग या प्रोटेओमिक विश्लेषणों के माध्यम से। इसके अलावा, इन विट्रो डेटा सावधानी के साथ इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और इन मॉडलों से निष्कर्ष vivo में मान्य किया जाना चाहिए, अधिमानतः मानव त्वचा के विकास में ।

आरएनए निष्कर्षण और आरएनए-सेक्यू पुस्तकालय तैयार करने के बुनियादी सिद्धांतों को पहले24 , 25,26,27,28मेंअच्छीतरहसे वर्णित किया गया है । इस प्रोटोकॉल में, आरएनए निष्कर्षण और आरएनए-सेक्यू पुस्तकालय तैयारी प्रक्रियाएं व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किटों के कार्यप्रवाह पर आधारित हैं। सिद्धांत रूप में, आरएनए निष्कर्षण के लिए विभिन्न तरीकों का आरएनए-एसईक्यू विश्लेषणों पर बड़ा प्रभाव नहीं होना चाहिए यदि आरएनए की गुणवत्ता अच्छी है। ऐसे मामलों में जहां आरएनए की गुणवत्ता खराब है (यानी, जब आरएनए को फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों से निकाला जाता है), आरएनए-एसईक्यू अभी भी किया जा सकता है; हालांकि, आरएनए विखंडन कदम समायोजित किया जाना चाहिए । आरएनए-एसईक्यू पुस्तकालय तैयारी में रिबोसोमल आरएनए (आरएनए) हटाने से लेकर सीक्वेंसी के लिए सीडीएनए लाइब्रेरी निर्माण तक शामिल हैं। प्रमुख प्रक्रियाएं विभिन्न किटों का उपयोग करके, या व्यक्तिगत एंजाइमों और घर के बने बफ़र्स का उपयोग करके29,30, 31,32द्वारा की जा सकती हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, यदि आरएनए-एसईक्यू विश्लेषण विभिन्न बुनियादी सिद्धांतों (उदाहरण के लिए, या तो राइबोसोमल आरएनए की कमी या पॉलीट ओलिगोस को संकरण द्वारा पॉलीए एम आरएनए संवर्धन) का उपयोग करके किया जाता है, तो आरएनए-एसईक्यू विश्लेषणों का परिणाम अलग हो सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल मानव, माउस और चूहे आरएनए के लिए डीएनए ओलिगोस के संकरण द्वारा रिबोसोमल आरएनए हटाने का उपयोग करता है। विभिन्न प्रजातियों के साथ काम करते समय, एक वैकल्पिक ओलिगो सेट को नियोजित किया जाना चाहिए।

उत्पन्न पुस्तकालय का अनुक्रमण या तो टुकड़ों के दोनों सिरों (युग्मित अंत) या टुकड़े के एक छोर (एकल छोर) पर किया जा सकता है। सामान्य तौर पर, युग्मित अंत अनुक्रमण से मापेनबिलिटी में काफी सुधार होता है और ट्रांसक्रिप्ट वेरिएंट के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करता है। हालांकि, अपेक्षाकृत सरल अंतर जीन विश्लेषण के लिए जैसा कि यहां वर्णित है, एकल अंत अनुक्रमण भी पर्याप्त जानकारी प्रदान कर सकता है।

डेटा विश्लेषण के महत्वपूर्ण कदम के लिए, फास्टक्यू फ़ाइलों की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक अपेक्षाकृत सरल विधि का वर्णन किया गया है, इसके बाद मानचित्रण जीनोम को पढ़ता है। भले ही प्रदान किए गए बैश कोड में आदर्श स्केलेबिलिटी नहीं है, लेकिन इसमें पारदर्शिता का लाभ है। सॉफ्टवेयर का चुनाव, जो कदम यह प्रदर्शन करता है, और डेटा पूर्वप्रसंस्करण के दौरान इस्तेमाल जीनोम के संस्करण सभी nontrivial कदम है कि अच्छी तरह से प्रलेखित किया जाना चाहिए, जो पुनरावृत्ति के लिए आवश्यक है ।

अधिक उन्नत उपयोगकर्ताओं के लिए, एक स्वचालित पाइपलाइन का उपयोग फास्टक्यू फाइल गुणवत्ता की जांच, एडाप्टर ट्रिमिंग और मैपिंग के चरणों को करने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए कवच स्नेकमेक वर्कफ्लो33 या वैन हीरिंगन लैब34से 'आरएनए-सेक़' स्नेकमेक वर्कफ्लो। हालांकि, ये पूरी तरह से स्वचालित पाइपलाइनें कम पारदर्शी और बदलने के लिए अधिक कठिन हैं । इन उपकरणों का उपयोग करते समय, इन स्वचालित पाइपलाइनों के भीतर कार्यों को समझना महत्वपूर्ण है। अंत में, प्रोटोकॉल में समय के साथ चर जीन अभिव्यक्ति पर जोर देने के साथ आरएनए-एसईक्यू डेटा विश्लेषण शामिल है। कई टाइमपॉइंट्स जैसे विभेदन के साथ प्रक्रियाओं को देखते समय वेरिएबल जीन एक्सप्रेशन को पेयरवाइज अंतर परीक्षण पर पसंद किया जाता है। अंत में, यह विश्लेषण पाइपलाइन आरएनसीक्यू डेटा के जैव सूचना विश्लेषण के लिए प्रासंगिक उपकरण पेश करती है। इसमें ऐसे उपकरण होते हैं जो सामान्य और रोगग्रस्त दोनों स्थितियों में केराटिनोसिटे भेदभाव का अच्छी तरह से आकलन कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) द्वारा समर्थित किया गया था । (NWO/ALW/ओपन प्रतियोगिता/ALWOP ३७६, H.Z., J.G.A.S.); राबोद विश्वविद्यालय फैलोशिप (एच जेड); और चीनी छात्रवृत्ति परिषद अनुदान 201406330059 (जेक्यू) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioanalyzer 2100 Agilent G2929BA
Bovine pituitary extract (BPE) Lonza Part of the bulletKit
CFX96 Real-Time system Bio-Rad qPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537
Epidermal Growth Factor (EGF) Lonza Part of the bulletKit
Ethanolamine >= 98% Sigma-Aldrich E9508
High Sensitivity DNA chips Agilent 5067-4626
Hydrocortison Lonza Part of the bulletKit
Insulin Lonza Part of the bulletKit
iQ SYBR Green Kit BioRad 170-8886
iScript cDNA synthesis Bio rad 1708890
KAPA Library Quant Kit Roche 07960255001 Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase Roche KK8540 RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Nanodrop deNovix DS-11 FX (model) Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24 Illumnia NOVA-514103 6 bp long primers
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
RNA Pico Chip Agilent 5067-1513

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References

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जेनेटिक्स अंक 159 मानव प्राथमिक केराटिनोसाइट्स 2डी जलमग्न संस्कृति इन विट्रो विभेदन आरएनए-सेक्यू बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण p63
आरएनए-सेक्यू विश्लेषण द्वारा मानव प्राथमिक केराटिनोसाइट्स के इन विट्रो भेदभाव का लक्षण वर्णन
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Smits, J. G. A., Qu, J., Niehues, H., Zhou, H. Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis. J. Vis. Exp. (159), e60905, doi:10.3791/60905 (2020).

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