Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Karakterisering av In Vitro Differentiering av mänskliga primära keratinocyter genom RNA-Seq Analys

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/60905
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, 3Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands
* These authors contributed equally

Summary

Presenteras här är en stegvis förfarande för in vitro-differentiering av mänskliga primära keratinocyter genom kontakt hämning följt av karakterisering på molekylär nivå genom RNA-seq analys.

Abstract

Human primära keratinocyter används ofta som in vitro-modeller för studier på epidermal differentiering och relaterade sjukdomar. Metoder har rapporterats för in vitro-differentiering av keratinocyter odlade i tvådimensionella (2D) nedsänkta seder med hjälp av olika induktionsförhållanden. Beskrivs här är ett förfarande för 2D in vitro keratinocyte differentiering metod genom kontakt hämning och efterföljande molekylär karakterisering av RNA-seq. I korthet odlas keratinocyter i definierat keratinocyter medium kompletteras med tillväxtfaktorer tills de är helt konfluenta. Differentiering framkallas av nära kontakter mellan keratinocyterna och stimuleras ytterligare genom att tillväxtfaktorer i mediet utesluts. Med hjälp av RNA-seq analyser, det visas att både 1) differentierade keratinocyter uppvisar distinkta molekylära signaturer under differentiering och 2) den dynamiska genen uttrycksmönstret liknar till stor del celler under epidermal stratifiering. När det gäller jämförelse med normala keratinocyter differentiering, keratinocyter redovisade mutationer av transkriptionsfaktorn p63 uppvisar ändrade morfologi och molekylära signaturer, överensstämmer med deras differentiering defekter. Sammanfattningsvis, detta protokoll detaljer stegen för 2D in vitro keratinocyte differentiering och dess molekylära karakterisering, med betoning på bioinformatisk analys av RNA-seq data. Eftersom RNA-utvinning och RNA-seq-förfaranden har varit väldokumenterade, är det inte i fokus för detta protokoll. Det experimentella förfarandet av in vitro keratinocyte differentiering och bioinformatisk analys pipeline kan användas för att studera molekylära händelser under epidermal differentiering i friska och sjuka keratinocyter.

Introduction

Mänskliga primära keratinocyter som härrör från den mänskliga huden används ofta som en cellulär modell för att studera biologi epidermis1,2,3,4. Stratifieringen av epidermis kan modelleras genom keratinocyte differentiering, antingen i en 2D nedsänkt monolayer mode eller 3D luft-lyft organotypic modell2,3,5,6,7. Även om 3D-modeller har blivit allt viktigare att bedöma den epidermala strukturen och funktionen, används 2D-differentieringsmodeller fortfarande i stor utsträckning, på grund av deras bekvämlighet och möjligheten att generera ett stort antal celler för analyser.

Olika villkor har tillämpats för inducerande keratinocyter differentiering i 2D, inklusive tillsats av serum, hög koncentration av kalcium, lägre temperatur och hämning av epidermal tillväxtfaktor receptorer2,3. Var och en av dessa metoder har validerats av ett antal keratinocyte differentieringsmarkörgener och visat sig vara effektiva vid bedömning av keratinocyte differentiering, även under patologiska förhållanden. Dessa induktionsförhållanden uppvisar emellertid också skillnader i deras differentieringseffektivitet och kinetik när specifika paneler av markörgenerundersöks 2,3.

En av dessa metoder innebär keratinocyte kontakt hämning och utarmning av tillväxtfaktorer i odlingsmediet8. Det har visat sig att keratinocyter kan differentiera spontant när celler når full densitet.  Om tillväxtfaktorer i odlingsmediet exkluderas kan differentieringen ytterligare förstärkas. Metoden som kombinerar kontakthämning och utarmning av tillväxtfaktorer har visat sig generera differentierade keratinocyter med genuttrycksmönster som liknar den normala stratifierade epidermis när man använder flera epidermala markörer3, vilket tyder på att denna modell är lämplig för att studera normal keratinocyter differentiering. Nyligen har två omfattande genuttryck analyser av keratinocyte differentiering med hjälp av denna modell rapporterats9,10. Forskare validerade denna modell på molekylär nivå och visade att den kan användas för att studera normal och sjuka keratinocyter differentiering.

Detta protokoll beskriver förfarandet för in vitro-differentieringsmetoden och molekylär analys av differentierade celler med hjälp av RNA-seq. Det illustrerar också karakterisering av transkriptomet av celler på differentiering dag 0 (spridning skede), dag 2, dag 4, och dag 7 (tidigt, mitten, och sen differentiering, respektive). Det visas att differentierade keratinocyter visa genuttryck mönster som till stor del liknar celler under epidermal stratifiering. För att undersöka om denna metod kan användas för att studera hudpatologi, applicerade vi samma experimentella och analyspipeline för att undersöka keratinocyter som bär på mutationer av transkriptionsfaktorn p63 som härrör från patienter med ectrodactyly, ektodermala displasi och läpp-/gomspalt (EEG)syndrom 11,12. Detta protokoll fokuserar på in vitro-differentiering av keratinocyter samt efterföljande bioinformatisk analys av RNA-seq. Andra steg i det kompletta förfarandet såsom RNA extraktion, RNA-seq provberedning och bibliotek konstruktion, är väl dokumenterade och kan lätt följas, särskilt när du använder många vanligen används kommersiella kit. Därför beskrivs dessa steg bara kortfattat i protokollet. Uppgifterna visar att denna pipeline är lämplig för att studera molekylära händelser under epidermal differentiering i friska och sjuka keratinocyter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Huden tarmbiopsier togs från bålen av friska frivilliga eller patienter med p63 mutationer, att ställa in den primära keratinocyte kultur. Alla förfaranden avseende upprättandet av primära keratinocyter för människa godkändes av den etiska kommittén vid Radboud University Nijmegen Medical Centre ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen"). Informerat samtycke erhölls.

1. Human primär keratinocyte differentiering genom kontakthämning

  1. Förbered keratinocyter tillväxtmedium (KGM) från Keratinocyte Basal Medium (Table of Materials) när det behövs.
  2. Gör 500 mL proliferation medium med hjälp av färdigberedda lager (KGM-pro; se tabell 1).
  3. Gör 500 mL differentieringsmedium (KGM-dif; se tabell 2).
    OBS: KGM med kosttillskott kan hållas vid 4 °C i två veckor. För längre förvaring kan den alikvotas och förvaras vid -20°C.
  4. Frö primära keratinocyter i densiteten 5,0–20 x 103 celler/cm2, beroende på cellproliferativ kapacitet. Lägg till tillräckligt KGM-pro medium för att täcka celler.
    OBS: 1) Uppgifter om regelbunden cellkultur inom KGM-medium finns på webbplatsen för Lonza13. 2) Såddensiteten bör testas för varje cellinje. Till exempel kan en normal primär keratinocyte linje sås vid en densitet på 5,0 x 103 celler/cm2, medan en linje som bär på mutationer i transkriptionsfaktorn p63 som är mindre proliferativ bör sås vid en densitet på 20 x 103 celler/cm2. 3) Beroende på den experimentella inrättas, flera rätter eller brunnar av celler bör sås att tillåta insamling av prover på olika differentiering dagar i repliker.
  5. Uppdatera celler med KGM-pro-mediet i två dagar efter sådd (sådd på dag 0, uppfriskande för1:e gången på dag 3). Efteråt, uppdatera med KGM-pro medium varannan dag. Kontrollera celler regelbundet, åtminstone varannan dag.
  6. Inducera celldifferentiering när celler är mer än 90% konfluenta genom att ändra mediet till KGM-dif. Dagen för byte av medium till KGM-dif definieras som differentieringsdag 0. Samla celler för ytterligare RNA-analyser genom att först tvätta 2x med DPBS, efteråt lägga i lysbufferten (från en RNA-extraktionssats).
    OBS: Med den ovan nämnda sådddensiteten ska celler nå konfluensi inom 7–10 dagar. Celler kan sås med en högre initial densitet för att nå konfluency tidigare. Om celler inte är proliferativa, längre väntan kan inte ge upphov till helt konfluenta celler. En högre såddtäthet kan krävas.
  7. Uppdatera celler med KGM-dif-mediet varje dag och samla in celler på differentiering dag 2, 4. och 7 för ytterligare RNA-utvinning.

2. RNA-utvinning

  1. Isolera totalt RNA. Detta kan utföras med hjälp av en kommersiell RNA-isoleringssats (såsom Zymo Quick-RNA MicroPrep RNA), eller med hjälp av fenol14. Ett isoleringskit som innehåller en DNAse-behandling rekommenderas dock starkt för RNA-seq-prover för att förhindra DNA-kontaminering och fenol. Ett exempel på en kommersiell RNA-isoleringssats ges i materialförteckningen.
  2. Mät RNA-koncentration med en spektrometer. Både DNA och RNA har en absorptionstopp på 260 nm.
    OBS: 1) Förhållandet mellan absorbanserna vid 260 nm och 280 nm används för att bedöma RNA:s renhet. Ett förhållande på omkring 2,0 är allmänt accepterat som "rent" RNA. Om förhållandet är väsentligt lägre än 2,0, kan provet vara kontaminerat med föroreningar som absorberar vid 280 nm såsom proteiner, fenoler eller andra ämnen. 2) Förhållandet mellan absorbanserna vid 260 nm och 230 nm mäter nukleinsyrerenhet. En kvot mellan 2,0 och 2,2 förväntas. Om förhållandet är väsentligt lägre kan provet vara förorenat med föroreningar som absorberar vid 230 nm såsom EDTA, etanol eller andra ämnen.

3. RNA kvalitetskontroll

  1. Kör RNA antingen på ett bioanalyzer RNA Pico-chip för att validera RNA Integrity Number (RIN) kvantitativt, eller på en gel för ett kvalitativt mått. I allmänhet är en RIN på minst åtta mycket tillrådligt. Vid utvinning av RNA från vävnader kan dock RIN vara lägre.
    OBS: Valfritt kan kvalitetskontroll utföras av qPCR på RNA-materialet.

4. RNA-seq bibliotek förberedelse

OBS: RNA-seq-biblioteksberedningen utförs ofta med ett kommersiellt kit eller under kommersiella inställningar. Det beskrivna protokollet är anpassat från ett kommersiellt kit, KAPA RNA HyperPrep Kit med RiboErase (Illumina), med en kort beskrivning av alla nödvändiga steg: rRNA utarmning med oligo hybridisering till mänskliga ribosomala RNAs, RNA fragmentering, första-strand syntes, andra-strand syntes och A-tailing, och sanering efter varje steg15. Andra beredningssatser för bibliotek kan också användas för detta ändamål. Det rekommenderas att utföra detta steg med hjälp av en kommersiellt tillgänglig kit, eftersom kvaliteten på genererade cDNA bibliotek är ofta mer konsekvent. 2) Följande steg beskrivs för 1x biblioteksberedning. Om du förbereder flera prover, gör masterblandningar med 10% extra volym.

  1. Oligo-hybridisering och rRNA-utarmning
    1. Förbered oligo hybridisering master mix (totalt = 11 μL, med 4,4 μL hybridiseringsbuffert, 4,4 μL hybridiserings oligos och 2,2 μL RNase-fritt vatten) och utarmningsmästarblandning (totalt = 5,5 μL, med 3,3 μL utarmningsbuffert och 2,2 μL RNase H).
    2. Ställ in PCR-reaktionsprogrammet på en termocyklerare: 95 °C i 2 min; ramp ned till 45 °C vid -0,1 °C/s, 45 °C-paus, 45 °C i 30 min; 4 °C för evigt.
      OBS: Överväg att börja med dubbla mängden RNA än nödvändigt för förstärkning. I det första försöket använder du en halv del av beloppet för att fortsätta med följande steg. Detta för att se till att det fortfarande finns material att upprepa dessa steg med ett annat antal cykler (se steg 4.7.2), om cyklerna av förstärkning visar sig vara otillräckliga eller överförstärkt.
    3. Använd mellan 25 ng och 1 μg av totalt RNA i 10 μL RNAsfritt vatten, tillsätt 10 μL oligo hybridisering master mix. Placera prov i den förprogrammerade termocyklaren och starta programmet.
    4. När programmet når paussteget vid 45 °C, tillsätt 5 μL av depletionsmästarmix till 20 μL hybridiseringsreaktionen utan att ta bort den från termocyklaren. Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner flera gånger.
    5. Återuppta programmet för termocykler för att fortsätta med utarmningssteget (45 °C i 30 min).
      OBS: 1) Sätt pärlorna för utarmning av RRNA (t.ex. KAPA rena pärlor) vid rumstemperatur (RT) under utarmningssteget för nästa del av protokollet. 2) Överväg att förbereda DNase digestion master mix (för avsnitt 4.2), eftersom reagenserna behövs direkt efter rRNA-saneringsrensningen.
    6. Utför en 2,2x pärlbaserad KAPA Pure Beads cleanup: kombinera RNA-mixen (25 μL) och KAPA Pure Beads (55 μL), genom att grundligt resuspend pärlorna i RNA mix genom pipettering upp och ner flera gånger.
    7. Inkubera vid RT i 5 min för att tillåta RNA-bindning till pärlorna, och placera röret(ar) på en magnet rack för att fånga pärlorna tills vätskan är klar, och försiktigt ta bort och kassera 60 μL av supernatant.
    8. Håll röret/röret på magneten, tvätta 2x med 200 μL av 80% etanol genom att inkubera pärlorna med etanolen för ≥30 s och kassera etanolen. Försök att ta bort all kvarvarande etanol utan att störa pärlorna efter den andra tvätten.
    9. Torka pärlorna vid RT i 3–5 min eller tills all etanol har avdunstat.
      OBS: Övertorkning av pärlorna kan resultera i minskad avkastning.
  2. DNase matsmältning
    1. Förbered DNase digestion master mix (totalt = 22 μL, med 2,2 μL DNase buffert, 2 μL DNase, och 17,8 μL RNase-fritt vatten) .
    2. Resuspend pärlorna i DNAse digestion master mix (20 μL) genom pipettering upp och ner flera gånger. Inkubera röret(ar) vid RT i 3 min för att elera RNA av pärlorna.
    3. Placera röret(ar) på en magnet rack för att fånga pärlorna, tills vätskan är klar, och försiktigt överföra 20 μL supernatant i ett rent rör.
    4. Inkubera röret/röret med supernatant vid 37 °C i 30 min.
      OBS: Överväg att förbereda RNA-elution, fragmentering och priming master mixar (för avsnitt 4.3), eftersom reagenserna direkt behövs efter DNase digestion cleanup.
    5. Utför en 2,2x pärlbaserad rensning genom att följa 4.1.6–4.1.9.
  3. RNA eluering, fragmentering, och priming
    1. Förbered Fragment, Prime och Elute Buffert (1x) master mix med 11 μL fragment, Prime och Elute Buffert (2x) och 11 μL av RNase-fritt vatten.
    2. Grundligt resuspend pärlorna med renat, DNase-behandlat RNA i 22 μL fragmentering, Prime och Elute Buffert (1x) genom pipettering upp och ner flera gånger.
    3. Inkubera i rumstemperatur i 3 min för att elera RNA avpärlorna och placera sedan tuben/ar) på en magnet för att fånga upp pärlorna tills vätskan är klar.
    4. Överför försiktigt 20 μL supernatant till ett rör(ar). Kassera röret/röret med pärlor.
      OBS: Detta är en säker stopppunkt, eftersom proverna kan förvaras vid -20 °C i ≤24 h.
    5. Placera röret/röret i en termocyklare och utför fragmenteringen och priming vid 94 °C i 6 min. Resulterande i ungefär 200–300 bp långa fragment.
      OBS: Inkubera i 8 min vid 94 °C för 100–200 bp-fragment. Vid användning av delvis försämrat RNA, fragmentera mellan 1–6 min vid 85 °C beroende på hur allvarlig nedbrytningen är.
    6. Placera röret(ar) på is och fortsätt omedelbart till första strängsyntesen.
  4. Första strandsyntesen
    1. Förbered första strängen syntes master mix (totalt = 12 μL, med 11 μL av första strängen syntesbuffert och 1 μL kapa skriften).
    2. Ställ in PCR-reaktionsprogrammet på en termocyklare: 25 °C i 10 min; 42 °C i 15 min; 70 °C i 15 min; 4 °C för evigt.
    3. På is, kombinera 20 μL fragmenterad primade RNA med 10 μL första sträng syntes master mix. Håll röret(n) på is, blanda noggrant genom att försiktigt pipettera reaktionen upp och ner flera gånger.
    4. Placera tuben/arna i den förprogrammerade termocyklaren och starta programmet.
  5. Understödja strandar syntes och A-tailing
    1. Förbered understödja strandar syntesen och A-tailing ledar- blandning på is (slutsumma = μL 33, med μL 31 av understöder strandar syntesbufferten och 2 μL av understöder strandar syntes & A-tailingenzymblandning).
    2. Ställ in PCR-reaktionsprogrammet på en termocyklerare: 16 °C i 30 min; 62 °C i 10 min; 4 °C för evigt.
    3. Kombinera 30 μL av första strängsyntesprodukten med 30 μL av andra strängsyntes och A-tailing master mix, och blanda noggrant genom pipettering upp och ner flera gånger på is.
    4. Placera tuben/arna i den förprogrammerade termocyklaren och starta programmet.
  6. Adapter ligering och efter ligering sanering
    1. Späd lageradaptrar (NEXTflex DNA-streckkoder, 25 μM) 3,57x i RNase-fritt vatten till 7 μM.
    2. Förbered adapter ligation master mix (totalt = 50 μL, med 40 μL av ligatur buffert och 10 μL av DNA-ligase).
    3. Kombinera 60 μL av andra strängsyntesprodukt, 45 μL adapterligering master mix, och 5 μL av utspädda adaptrar. Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner flera gånger på is.
    4. Inkubera rören vid 20 °C i 15 min och fortsätt omedelbart med första inlägget ligering sanering.
    5. Utför en 0,63 x pärlbaserad sanering genom att kombinera adapter-ligated DNA (110 μL) och KAPA rena pärlor (70 μL), sedan grundligt resuspend pärlorna i DNA-mix genom pipettering upp och ner flera gånger.
    6. Upprepa steg 4.1.7–4.1.9.
    7. Ta bort rören från magneten. Grundligt resuspend pärlorna i 50 μL av 10 mM Tris HCL (pH = 8.0–8.5) och inkubera pärlorna vid RT i 2 min.
    8. Placera plattan på magneten och vänta tills vätskan är klar. Överför 50 μL av den klara supernatanten till ett nytt rör.
      OBS: Säker stopppunkt under mindre än 24 h vid 4 °C.
    9. Utför en 0,7x pärlbaserad sanering genom att kombinera 50 μL pärlor med renat adapter-ligated DNA med 35 μL PEG/NaCL-lösning. Blanda noggrant genom att virvelning.
    10. Utför rensningssteg 4.1.7–4.1.9. Grundligt resuspend pärlorna i 20 μL av 10 mM Tris HCL (pH = 8.0–8.5), och inkubera pärlorna på RT i 2 min.
    11. Placera plattan på magneten; vänta tills vätskan är klar. Överför 20 μL av den klara supernatanten till ett nytt rör och fortsätt till avsnitt 4.7.
      OBS: Säker stopppunkt under mindre än 1 vecka vid 4 °C eller mindre än 1 månad vid -20 °C.
  7. Bibliotekets förstärkning och rensning
    1. Förbered biblioteksförstärkningsstudsblandning (totalt = 33 μL, med 27,5 μL 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix och 5,5 μL av 10x biblioteksförstärkningsgrundermix).
    2. Ställ in PCR-reaktionsprogrammet på en termocyklare med hjälp av följande parametrar. 98 °C för 45 s, N cykler (se anmärkningen nedan) på: 98 °C för 15 s; 60 °C för 30 s; 72 °C för 30 s, 72 °C i 1 min, och 4 °C för alltid.
      OBS: Cyklerna för biblioteksförstärkningen beror på ingångsmaterialet. Det kan grovt uppskattas som sådant: med början i RNA = 25–100 ng, N = 11–15 cykler; 100–250 ng, N = 9–12 cykler; 250–500 ng, N = 7–10 cykler.
    3. Utför en 0,8x pärlbaserad sanering genom att kombinera förstärkt biblioteks-DNA (50 μL) och KAPA rena pärlor (40 μL), sedan noggrant resuspend pärlorna i DNA-mixen genom pipettering upp och ner flera gånger.
    4. Utför rensningssteg 4.1.7–4.1.9. Grundligt resuspend pärlorna i 50 μL av 10 mM Tris HCL (pH = 8.0–8.5), och inkubera pärlorna på RT för 2 min.
    5. Överför 50 μL av den klara supernatanten till ett nytt rör och fortsätt till den andra biblioteksförstärkningsrensningen.
    6. Utför en 1x bead-baserad sanering genom att kombinera förstärkt biblioteks-DNA (50 μL) och KAPA rena pärlor (50 μL), sedan noggrant resuspend pärlorna i DNA-mixen genom pipettering upp och ner flera gånger.
    7. Utför rensningssteg 4.1.7–4.1.9. Grundligt resuspend pärlorna i 22 μL av 10 mM Tris HCL (pH = 8.0–8.5), och inkubera pärlorna vid RT i 2 min.
    8. Överför 20 μL av den klara supernatanten till ett nytt rör fortsätter till Qbit- och bioanalyzermätningar.
  8. Koncentration och fragmenteringsstorlek
    1. Mät DNA-koncentrationer av proverna. Med hjälp av en mycket känslig fluorescerande färgämnesbaserad sats (t.ex. Denovix Qbit, se Tabell över material), eller om koncentrationen verkar ligga under 0,5 ng/μL, requantify med hjälp av en känsligare qPCR-metod (t.ex. Kappa Kvantifiering, se Tabell över material).
    2. Bestäm bibliotekets fragmentstorlek, med hjälp av högkänslig elektrofores (t.ex. en bioanalyzer).
      OBS: Valfritt kan kvalitetskontroll genom qPCR utföras före sekvensering (Tillägg) med hjälp av ett utspädt förberett bibliotek istället för cDNA.
  9. Sekvensering
    1. Skicka biblioteket för sekvensering. För RNA-seq differentialgenuttrycksanalys är ett sekvenseringsdjup av avläsningar mellan 10–25 miljoner per prov i allmänhet tillräckligt.

5. Förbehandling av uppgifter

  1. Kvalitetskontroll Fastq filer
    1. Ladda ner och installera Trimgalore16 för att ta bort baspar med låg kvalitet och tomma läsningar inom Fastq-filerna.
      OBS: 1) De flesta programvara som nämns här fungerar bara i Linux. Om den är begränsad till en Windows-dator, är det möjligt att köra analyser på en Linux-server med hjälp av programvaran MobaXterm eller Putty. Tänk på att för genom indexering en hel del random-access minne (RAM) krävs (runt 64 GB). 2) Installera all nödvändig programvara i en conda miljö rekommenderas starkt. Detta kommer att möjliggöra enkel installation av programvara och pakethantering. Mer information om conda finns på .
    2. Skapa en katalog (mapp) för data t.ex RNA_seq_KC_diff. Ange detta som arbetskatalogen genom att skriva: "cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/".
      OBS: För en översikt över mappstrukturen, se 'folder_structure.txt' i de kompletterande kodningsfilerna.
    3. Skapa flera mappar i arbetskatalogen med de specifika namnen: 'Fastq', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', 'scripts' och 'Mapping'.
    4. Flytta fast-filerna för de sekvenserade datan i fastq-mappen. Alternativt generera mjuka länkar med kommandot: "ln –s home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile" till Fastq-filerna för att spara diskutrymme.
    5. Kör Trim galore på Fastq-filerna, se TrimGalore.txt för koden för att kopiera klistra in i bash. Ändra mappnamn och inställningar inom kommandot där det behövs.
  2. Mappning
    1. Ladda ner ett genom för att kartlägga läsningarna till, t.ex., hg38 ensembl release 97 (omaskerad version): ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz ; och motsvarande genanteckningsfil: hg 38 genannotation ensembl release 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. Överför båda filerna till CRCh38_fasta mappen.
      OBS: Alternativt använda en annan version av genomet, till exempel, UCSC-versionen av hg38, om mappning till avskrift id snarare än gen-ID är att föredra.
    2. Installera STAR 2.7.117.
    3. Generera ett in-house referensgenom med hjälp av STAR 2.7.1 av den generera genomet skriptet (se Kompletterande Coding Files). Ändra mängden trådar till vad processer har (--runThreadN X). Ändra mappnamn och inställningar i det här skriptet där det behövs. Kör den genom att kopiera / klistra in bash.
    4. Installera samtools 1,918 för indexering av bam-filer och gzip för att komprimera den vicka filer.
    5. Anpassa Trim Galore validerade sekvensering läser till den mänskliga genomet montering hg38 (ensembl release 97) med hjälp av STAR 2.7.1 följt av indexering med hjälp av samtools och gzip. Detta bör utföras med hjälp av skriptet map_fastq.txt (se Kompletterande Coding Files). Ändra mappnamn och inställningar i det här skriptet där det behövs. Kör det genom att kopiera / klistra in i bash.
      OBS: STAR-mappning genererar flera utdatafiler, inklusive en bam-fil, en vicka fil, och läsa räknar tabell med namnet * _ReadsPerGene.out.tab, som direkt kan användas hopknäckt av R för att använda som indata för Deseq2.
  3. Genom webbläsare visualisering
    1. Installera wigToBigWig från UCSC genomet webbläsare verktyg för att generera bigwig filer med big2bwskriptet 19.
    2. Överför filerna 'convertBigWigChroms.py' och 'CRCH38_ensembl2UCSC.txt' från de kompletterande kodningsfilerna till en mapp 'scripts' i arbetskatalogen.
    3. Gör convertBigWigChroms.py körbar (med kommandot: 'chmod +x scripts/convertBigWigChroms.py' på en Linux-maskin).
    4. Generera bigWig filer från Den Wiggle filer, med hjälp av skriptet wig2bw.txt (se Kompletterande Coding Files). Kör den genom att kopiera / klistra in bash.
    5. Mata in BigWig-filerna på UCSC-genomläsaren eller IGV (Integrative Genomics Viewer) för visualisering.

6. RNA-seq dataanalys

  1. Mata in exempeldata i Deseq2
    1. Ladda ner och installera Rstudio (version 1.1.456) och R (version 3.6).
    2. Installera alla nödvändiga R-paket (se Kompletterande kodningsfiler).
      OBS: För en detaljerad R-markdown fil som visar all programmeringskod och utdata, se de bifogade filerna: "RNA_seq_kc_differentiation_wt.html" och "RNA_seq_kc_differentiation_patient.html". En allmän beskrivning av alla steg ingår nedan.
    3. Generera en räkningstabell från filerna ReadsPerGene.out.tab.
    4. Skriv en exempeldatafil, som innehåller alla filnamn, differentieringsdagen och andra relevanta exempeldata. Ett exempel på exempelfil finns i "sample_data_example.csv" i de kompletterande kodningsfilerna.
    5. Använd antalstabellen och exempeldata för att generera ett Deseq220-objekt som innehåller både de uppraktiva och exempeldata.
  2. Gene uttryck normalisering, prov avstånd och PCA
    1. Normalisera räknetabellen i Deseq2-objektet, med antingen Deseq2 rld eller VST-normalisering. Rld normalisering är att föredra, men med många prover, är VST normalisering mycket snabbare.
    2. Plotprovavstånd baserat på de normaliserade läsantalsintensiteterna med funktionen "dist" i R och därefter utföra "hclust" klustring baserat på provavstånd. Rita upp själva värmekartan med hjälp av pheatmap-paketet.
    3. Generera en PCA-plot av de normaliserade läsantalsintensiteterna med hjälp av funktionen plotPCA i Deseq2.
      OBS: PCA fungerar som ett verktyg i explorativ dataanalys och kan användas för att visualisera avstånd och släktlighet mellan olika prover.
  3. Differentiell/mycket variabel genuttrycksanalys
    1. Beräkna antingen differentialgenerna med hjälp av Deseq2 resultatfunktionen. Vid bedömning av förändringar över flera tidspunkter där jämförelser mellan parvis inte är tillämpliga, använd dock mycket varierande gener. I detta fall extrahera de översta 500 mycket varierande gener via beställning på variansen mellan prover från olika tidpunkter med rowVars-funktionen.
      OBS: För kontrollproverna användes i vår analys de 500 högst varierande generna (de gener som har den högsta standardavvikelsen av deras normaliserade intensitet över olika dagar av differentiering) för vidare analys. Men för den sjuka vs kontroll analys differentially uttryckt gener mellan sjukdom och friska kontroller över tiden beräknades av Deseq2 med hjälp av en flera tester korrigeras p-värde av 1 x 10-4 som en cutoff. Ett annat möjligt filtreringssteg är att utesluta differentiella gener som ändrar sig mindre än en viss vikändringsavskur.
    2. Utför kmeans klustring på differentialen eller mycket variabel gener till klustring dem av olika uttryck mönster.
    3. Visualisera differentiella eller mycket varierande gener i en heatmap med hjälp av pheatmap-paketet. Intensiteten som ritas i heatmapen är deseq2 normaliserade intensiteten med medianvärdet subtraheras.
  4. Gene Ontology (GO) anrikningsanalys
    1. Generera en lista över uttryckta bakgrundsgener genom att ta alla gener med mer än 10 räknas i ett enda prov.
    2. Utför GO-analys med hjälp av onlineverktyg som GOrilla21. Använd listorna över de differentiella/mycket varierande generna i kluster som "genlista", och bakgrundsgenerna som bakgrund för jämförelse.
      OBS: Mer avancerade R-användare kan använda paketkluster22 för att automatisera Go-term enrichment analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Normal keratinocyte differentiering och RNA-seq-analys
I detta experiment, keratinocyte linjer som härrör från fem individer användes för differentiering och RNA-seq analyser. Figur 1 sammanfattar det experimentella förfarandet för differentiering och RNA-seq analysresultat. En översikt av in vitro differentieringsprocedurer av normala keratinocyter och cellmorfologiförändringar under differentiering illustreras i figur 1A. Principkomponentanalys (PCA) visade att keratinocyter som genomgick differentiering hade kopplat ihop men distinkta övergripandegenuttrycksprofiler ( figur 1B). Mycket varierande gener var klustrade av kmeans att visualisera genuttryck dynamik och mönster under differentiering (Figur 1C).

Varje kluster av gener representerades av generna keratinocyter särskiljningsstämpeln (t.ex., KRT5 för spridning, KRT1 och KRT10 för tidig och mitten av differentiering, och IVL/LOR/FLG för sen differentiering). Gen ontologi (GO) annotering analys av mycket varierande genkluster (Figur 1C) visade en tydlig skillnad i genfunktioner av dessa genkluster (t.ex., keratinization i mitten stadier av differentiering; och epidermal cell differentiering, keratinocyte differentiering, och peptid korsbindning i de sena stadierna; Bild 1D). Proteinuttryck av flera differentieringsmarkörer mättes genom western blotting (Figur 1E).

P63 mutant keratinocyte differentiering och RNA-seq analys:
I det andra experimentet jämfördes cellmorfologi och genuttryck skillnader mellan keratinocyter från friska kontroller och tre linjer som härrör från patienter som bär p63 mutationer (mutanter R204W, R279H och R304W). Bild 2A visar en översikt över differentieringsprocedurer och cellmorfologiförändringar. Mutant keratinocyter förblev platt på ytan av skålen och inte blivit trångt eller överlappar tillväxt som kontroll keratinocyter dag 7.

I PCA-analys följde kontrollcellslinjerna tydligt ett differentieringsmönster, jämfört med figur 1B. Mönstret för gen uttryck för mutanta celler under differentiering vistelser i stort sett liknar dem i prolifererande/odifferentierade celler. Bland de tre mutant linjer, differentiera R279 prover flyttas längs PC1 och PC2 i viss utsträckning, vilket tyder på att dess differentiering var mindre nedsatt, jämfört med R204W och R304W.

I klustringsanalysen (Figur 2C) var gener nedreglerade i kontrollceller (kluster 1) delvis nedreglerade i R204W och R279W, men deras genuttryck ändrades inte drastiskt i R304W. Dessa gener spelar sannolikt roller i cellproliferation, vilket framgår av GO-annotering (Figur 2D). I kluster 2 (Figur 2C) inducerades först gener och därefter nedreglerade i kontrollceller. Dessa gener är sannolikt involverade i keratinocyte differentiering, som epidermal differentiering och keratinisering funktioner var högt berikade för detta kluster gener (Figur 2D). Dessa gener inducerades inte i R204W och R304W, medan i R279H celler, dessa gener inducerades men inte nedreglerade så mycket som kontrollceller.

Gener i kluster 3 inducerades först i slutet av differentiering i kontrollceller (Figur 2D). I överensstämmelse med detta kan dessa gener ha en roll i det ytterstaste lagret av epidermis, eftersom de har visat sig vara lyhörda för yttre stimuli och inflammation (Figur 2D). Uttrycket mönster av dessa gener inte förändras mycket i alla tre mutanta cellinjer. De synliga skillnaderna i genuttrycksmönster mellan kontroll och mutantceller visar att mutanta celler inte kan differentiera sig ordentligt i dessa in vitro-differentieringsmodeller.

Figure 1
Figur 1: Keratinocyte differentiering och analys. (A) Översikt över protokollet keratinocyte differentiering och cell morfologi. Skala bar = 100 μm. (B) Principkomponentanalys av differentiering av kontrollkeratinocyter. (C) Heatmap av de 500 högst varierande gener under keratinocyte differentiering. Gener är klustrade i tre kluster med hjälp av kmean klustring. Representativa differentieringsmarkörgener för varje genkluster indikeras på sidan. (D) GO term anrikning analys av överrepresenterade funktioner för gener i de mycket variabla genkluster, jämfört med en bakgrund av alla uttryckta gener (räknas >10). GOrilla användes för anrikningstestet. (E) Västra blot av keratinocyte differentiering markörer under differentiering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Jämförelse mellan kontroll och p63 mutanta keratinocyter. (A) Översikt av keratinocyter differentiering protokollet och cell morfologi av kontroll och p63 mutanta keratinocyter. Skala = 100 μm. (B) Principkomponentanalys av differentieringskontroll och patient (R204W, R279H & R304W) keratinocyter. (C) Heatmap av differentialgener mellan kontroll och mutanta keratinocyter. Gener är klustrade i tre kluster med hjälp av kmean klustring. Representativa differentieringsmarkörgener för varje genkluster indikeras. (D) GO term anrikning analys av överrepresenterade funktioner för gener i de mycket variabla genkluster, jämfört med en bakgrund av alla uttryckta gener (räknas >10). GOrilla användes för anrikningstestet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

KGM-komponent Lager Medium Volym
KBM 500 mL
Penna/Strep 100 000 enheter/mL 100 enheter/mL 5 mL
BPE ~13 mg/mL 0.4% 2 mL
Etanolamin 0,1 M 0,1 mM 500 μL
o-fosfoetanolamin 0,1 M 0,1 mM 500 μL
Hydrokortison 0,5 mg/mL 0,5 μg/mL 500 μL
Insulin 5 mg/mL 5 μg/mL 500 μL
Egf 10 μg/mL 10 ng/mL 500 μL

Tabell 1. KGM-pro medium kosttillskott.

KGM-komponent Lager Medium Volym
KBM 500 mL
Penna/Strep 100 000 enheter/mL 100 enheter/mL 5 mL
Etanolamin 0,1 M 0,1 mM 500 μL
o-fosfoetanolamin 0,1 M 0,1 mM 500 μL

Tabell 2. KGM-diff medelstora kosttillskott.

Kompletterande Kodning Filer: Folder_structure.txt; Generate_genome.txt; Map_fastq.txt; RNA_seq_kc_differentiation_patient.html; RNA_seq_kc_differentiation_wt.html; Sample_data_example.csv; TrimGalore.txt; och Wig2bw.txt. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta arbete beskriver en metod för att inducera human keratinocyte differentiering och efterföljande karakterisering med hjälp av RNA-seq analyser. I den aktuella litteraturen används i många studier om human keratinocyte differentiering två andra metoder, med en hög kalciumkoncentration eller med serum som metoder för att inducera differentiering2,3,23. En tidigare rapport noggrant jämfört dessa tre olika metoder3 och visade att dessa metoder kan representera distinkta biologi keratinocyter differentiering. I denna samma rapport visade författarna att differentierade celler som inducerats av serum har hög proliferativ potential och expressgener som KRT16 och SKALP/ PI3 som uttrycks i psoriasishuden men inte i normal epidermis, och att därför seruminducerad differentieringsmodell kan användas för att studera psoriasis. Däremot kan metoden för kontakthämning plus tillväxtfaktoruteslutning inducera KRT1 och KRT10, som normalt uttrycks i epidermis och liknar normal keratinocyte differentiering. Hög kalciuminduktion ger upphov till en genuttrycksprofil som ligger mellan seruminduktion och kontakthämning, som den minst specifika metoden. De analyser som använder RNA- seq-analyser under differentiering bekräftade att metoden för kontakthämning plus tillväxtfaktoruteslutning resulterar i differentierade keratinocyter med liknande genuttrycksprofiler som de som förväntas för epidermal differentiering (t.ex. KRT5 i prolifererande celler, KRT1 och KRT10 i tidig differentieringsinduktion samt LOR och FLG i sen differentiering; Bild 1C).

Dessa resultat visar att denna differentiering teknik är en lätt att använda och tillförlitlig metod för att studera keratinocyter differentiering. Vidare visar detta arbete på keratinocyter som härrör från p63 mutanta keratinocyter också att metoden kan användas för att studera drabbade keratinocyter differentiering under sjuka förhållanden. I denna in vitro differentiering tillvägagångssätt, KGM köpt från Lonza används, eftersom detta medium ger konsekventa resultat. I princip är även andra epidermala medium med liknande sammansättning såsom keratinocyte serum-free medium (KSFM) från Thermo Fisher Scientific sannolikt lämplig, även om detta måste testas.

Det bör noteras att denna metod har vissa begränsningar. Eftersom det är baserat på kontakthämning krävs sammanflödet av celltäthet. I våra experiment med p63 mutanta keratinocyter, en högre inledande sådd densitet har varit nödvändigt att säkerställa celler för att nå confluency. Dessutom, när celler inte växer med samma hastighet, differentiering ibland måste framkallas på olika dagar. Dessa överväganden bör beaktas vid inrättandet av experiment. I experimentella miljöer där celler behöver induceras samtidigt bör andra differentieringsmetoder övervägas, inklusive tillsats av serum, höga koncentrationer av kalcium, och hämning av epidermal tillväxtfaktorreceptorer2,3. Ändå har alla in vitro differentieringsmetoder för-och nackdelar, eftersom de förmodligen representerar partiell differentiering induktion signaler som finns under in vivo hud utveckling2.

En omfattande molekylär analys som jämför dessa olika metoder kommer att vara mycket informativ och kan instruera valet av metod som är mest lämplig för olika studier om biologiska processer. Dessutom rekommenderas att validera förändringar som mäts på transkriptomisk nivå, till exempel via western blotting eller proteomiska analyser. Vidare bör in vitro-data användas med försiktighet, och slutsatser från dessa modeller bör valideras in vivo, helst i mänsklig hudutveckling.

Grundläggande principer för RNA extraktion och RNA-seq bibliotek förberedelse har väl beskrivitstidigare 24,25,26,27,28. I detta protokoll är RNA-utvinning och RNA-seq bibliotek förberedelseförfaranden baserade på arbetsflöden av kommersiellt tillgängliga kit. I princip bör olika metoder för RNA-extraktion inte ha något större inflytande på RNA-seq-analyser om RNA-kvaliteten är god. I de fall där RNA-kvaliteten är dålig (dvs. när RNA extraheras formalin-fast paraffin-inbäddade vävnader), RNA-seq kan fortfarande utföras; dock bör RNA-fragmenteringssteget justeras. RNA-seq-biblioteksberedningen täcker från borttagning av ribosomal RNA (rRNA) till cDNA-bibliotekskonstruktionen för sekvensering. De större procedurerna kan utföras genom att använda olika kit, eller använda enskilda enzymer och hemgjorda buffertar29,30,31,32. Det bör noteras att, om RNA-seq-analys utförs med hjälp av olika grundläggande principer (t.ex. kan antingen ribosomal RNA-utarmning eller polyA mRNA-anrikning genom hybridisering till polyT oligos), resultatet av RNA-seq-analyser skilja sig åt. Vidare, protokollet utnyttjar ribosomal RNA borttagning av hybridisering av DNA oligos till människa, mus, och råtta rRNA. Vid arbete med olika arter bör ett alternativt oligo-set anställas.

Sekvensering av det genererade biblioteket kan utföras antingen på båda ändarna av fragmenten (parade änden) eller i ena änden av fragmentet (enda änden). I allmänhet, parade slutet sekvensering förbättrar kraftigt mappability och ger mer information om avskrift varianter. Men för en relativt enkel differentiell genanalys som beskrivs här, kan enstaka slutet sekvensering också ge tillräcklig information.

För det viktiga steget av dataanalys beskrivs en relativt enkel metod för kvalitetskontroll av fastq-filerna, följt av kartläggningsläsningar till genomet. Även om den tillhandahållna bash-koden inte har idealisk skalbarhet, har den fördelen av genomskinlighet. Valet av programvara, vilka steg den utför, och version av genomet som används under dataförbehandling är alla icke-triviala steg som bör vara väldokumenterade, vilket är viktigt för repeterbarheten.

För mer avancerade användare kan en automatiserad pipeline användas för att utföra stegen i fastQ filkvalitetskontroll, adaptertrimning och kartläggning, t.ex. Dessa helt automatiserade rörledningar är dock mindre öppna och svårare att ändra. När du använder dessa verktyg är det viktigt att förstå funktionerna inom dessa automatiserade rörledningar. Slutligen innehåller protokollet RNA-seq dataanalys med tonvikt på variabel genuttryck över tiden. Variabel genuttryck är att föredra över pairwise differentiell testning när man tittar på processer med flera tidspunkter, till exempel differentiering. Sammanfattningsvis införs denna analyspipeline relevanta verktyg för bioinformatisk analys av RNAseq-data. Den innehåller verktyg som grundligt kan bedöma keratinocyter differentiering, både under normala och sjuka förhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av Nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Radboud University stipendium (H.Z.); och kinesiska stipendierådet bevilja 201406330059 (J.Q.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioanalyzer 2100 Agilent G2929BA
Bovine pituitary extract (BPE) Lonza Part of the bulletKit
CFX96 Real-Time system Bio-Rad qPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537
Epidermal Growth Factor (EGF) Lonza Part of the bulletKit
Ethanolamine >= 98% Sigma-Aldrich E9508
High Sensitivity DNA chips Agilent 5067-4626
Hydrocortison Lonza Part of the bulletKit
Insulin Lonza Part of the bulletKit
iQ SYBR Green Kit BioRad 170-8886
iScript cDNA synthesis Bio rad 1708890
KAPA Library Quant Kit Roche 07960255001 Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase Roche KK8540 RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Nanodrop deNovix DS-11 FX (model) Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24 Illumnia NOVA-514103 6 bp long primers
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
RNA Pico Chip Agilent 5067-1513

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
  2. Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
  3. Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
  4. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  5. Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
  6. Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
  7. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
  8. Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
  9. Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
  10. Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
  11. Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
  12. Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2200-2207 (2011).
  13. KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit. , Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019).
  14. Doyle, K. aM. Protocols and applications guide. , Promega Corporation. Madison. (1996).
  15. Roche. Hyperprep Kit. , Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019).
  16. Felix Krueger. TrimGalore. , Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019).
  17. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Ryan, D. Convert chromosome names in a bigWig file. , Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019).
  20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  21. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
  22. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  23. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
  24. Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
  25. Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
  26. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  27. Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
  28. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
  29. Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
  30. Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
  31. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
  32. Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
  33. Soneson, C. ARMOR. , Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019).
  34. Sande, S. F. snakemake-workflows. , Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019).

Tags

Genetik humana primära keratinocyter 2D-nedsänkningskultur in vitro-differentiering RNA-seq bioinformatikanalys p63
Karakterisering av In Vitro Differentiering av mänskliga primära keratinocyter genom RNA-Seq Analys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smits, J. G. A., Qu, J., Niehues,… More

Smits, J. G. A., Qu, J., Niehues, H., Zhou, H. Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis. J. Vis. Exp. (159), e60905, doi:10.3791/60905 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter