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Biochemistry

प्रोटीन के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण के साथ सेलुलर प्रोटीन की विशेषता

Published: March 11, 2020 doi: 10.3791/60911
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Maryland Baltimore, 2AIT Bioscience

Summary

यहां, हम प्रोटीन (आईसी-एफपीओपी) के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण को प्रोटीन फुटप्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन संरचना और इंटरैक्शन साइटों की विशेषता रखते हैं।

Abstract

प्रोटीन (एफपीओपी) का फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण प्रोटीन संरचना और बातचीत की विशेषता के लिए उपयोग की जाने वाली एक हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी प्रोटीन पदचिह्न विधि है। FPOP हाइड्रोक्साइल कणों का उत्पादन हाइड्रोजन पेरोक्साइड को फोटोयुक्त करने के लिए 248 एनएम एक्सीमर लेजर का उपयोग करता है। ये कण 20 अमीनो एसिड में से 19 के विलायक उजागर साइड चेन को संशोधित करते हैं। हाल ही में, इस विधि का उपयोग लाइव कोशिकाओं (आईसी-एफपीओ) में उनके मूल वातावरण में प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया गया है। कोशिकाओं में प्रोटीन का अध्ययन अंतरआणविक भीड़ और विभिन्न प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए होता है जो इन विट्रो अध्ययनों के लिए बाधित होते हैं। आईसी-एफपीओ के दौरान सेल एग्रीग्रेशन और क्लोजिंग को कम करने के लिए एक कस्टम सिंगल सेल फ्लो सिस्टम डिजाइन किया गया था। यह प्रवाह प्रणाली व्यक्तिगत रूप से एक्सीमर लेजर पिछले कोशिकाओं को केंद्रित करती है, इस प्रकार लगातार विकिरण सुनिश्चित करती है। एक क्रिस्टल संरचना से गणना प्रोटीन की विलायक पहुंच के लिए FPOP से उत्पादित ऑक्सीकरण की सीमा की तुलना करके, आईसी-FPOP प्रोटीन की विलायक सुलभ साइड चेन की सटीक जांच कर सकता है।

Introduction

हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग (एचआरपीएफ) एक ऐसी विधि है जो हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स से उत्पादित सहसंयोजक संशोधनों के माध्यम से प्रोटीन की विलायक पहुंच की जांच करती है। जब प्रोटीन संरचना या प्रोटीन इंटरैक्शन बदलते हैं, तो यह अमीनो एसिड के विलायक एक्सपोजर को बदल देगा, इस प्रकार अवशेषों के संशोधन की सीमा में फेरबदल करेगा। एचआरपीएफ के साथ प्रोटीन इंटरैक्शन1,2,,3 और प्रोटीन प्रसंरचना परिवर्तन,4,,5,,6 को सफलतापूर्वक विट्रो में पूछताछ की गई है । ऐसे कई तरीके हैं जो एचआरपीएफ प्रयोगों के लिए हाइड्रोक्सिल कण उत्पन्न करते हैं, एक प्रोटीन (एफपीओपी) का तेजी से फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण है। एफपीओ को 2005 में हैम्बली और ग्रॉस द्वारा विकसित किया गया था और हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2)7के फोटोलिसिस के माध्यम से हाइड्रोक्सिल कणों का उत्पादन करने के लिए 248 एनएम एक्सीमर लेजर का उपयोग करता है।

हाल ही में, एस्पिनो एट अल ने लाइव कोशिकाओं में प्रोटीन संरचना की जांच करने के लिए एफपीओ के उपयोग को बढ़ाया, एक विधि जिसे इन-सेल एफपीओ (आईसी-एफपीओ)8कहा जाता है। इन विट्रो अध्ययनों के विपरीत, विभिन्न प्रोटीन इंटरैक्शन के साथ आणविक भीड़ के लिए कोशिकाओं में प्रोटीन का अध्ययन करना जो संभावित रूप से संरचना को प्रभावित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटेम वाइड स्ट्रक्चरल बायोलॉजी करने के लिए एक बार में कई प्रणालियों की संरचनात्मक जानकारी प्रदान करने वाले पूर्ण प्रोटेम का एक स्नैपशॉट प्रदान करने का लाभ प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, यह तकनीक प्रोटीन के लिए आदर्श है जो झिल्ली प्रोटीन की तरह विट्रो का अध्ययन करना मुश्किल है।

आईसी-एफपीओ के प्रारंभिक अध्ययनों ने प्रोटीन बहुतायत और सेलुलर स्थानीयकरण में शामिल 105 प्रोटीन की सफलतापूर्वक जांच की। आईसी-एफपीओ विधि में सुधार करने के लिए, रिनास एट अल ने एकल सेल प्रवाह9के लिए एक माइक्रोफ्लो सिस्टम विकसित किया। मूल प्रवाह प्रणाली की वृद्धि सेल एकत्रीकरण को सीमित करता है और विकिरण के लिए उपलब्ध उपलब्ध एच2ओ2 को बढ़ाता है। प्रारंभिक प्रवाह प्रणाली में, सिलिका ट्यूबिंग में झुरमुट कोशिकाओं के परिणामस्वरूप मोजे और असमान विकिरण हुआ। एक म्यान बफर हाइड्रोडायनामिक रूप से दो धाराओं का समावेश कोशिकाओं को केंद्रित करता है, जिससे उन्हें लेजर के पिछले व्यक्तिगत रूप से प्रवाहित करने की अनुमति मिलती है। एच2ओ2 के लिए एक अलग सिरिंज का समावेश प्रतिकूल प्रभावों के बिना उच्च एच2ओ2 सांद्रता की अनुमति देने वाले अधिक नियंत्रित और अनुकूलनीय एक्सपोजर समय को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, ऊष्मायन समय को सीमित करने से एंडोजेनस कैटालास द्वारा एच2ओ2 के टूटने की सीमा होती है। इस नए प्रवाह प्रणाली को शामिल करके, एक FPOP संशोधन के साथ प्रोटीन की पता लगाया संख्या 13 गुना वृद्धि हुई है, इस प्रकार इस विधि की क्षमताओं का विस्तार करने के लिए रहने वाले कोशिकाओं में प्रोटीन की एक भीड़ की जांच । इस प्रोटोकॉल में आईसी-एफपीओ प्रवाह प्रणाली की असेंबली पर ध्यान केंद्रित करते हुए एक सामान्य आईसी-एफपीओ प्रयोग का वर्णन किया गया है।

Protocol

1. आईसी-एफपीओ फ्लो सिस्टम स्थापित करें

  1. प्रवाह प्रणाली की असेंबली शुरू करने के लिए, एक दरार पत्थर का उपयोग करके जुड़े सिलिका को आकार में काट लें। आईसी-एफपीओओपी फ्लो सिस्टम के लिए 450 माइक्रोन और आउटर व्यास (ओडी) के इनर व्यास (आईडी) के साथ चार 12 सेमी और एक 17 सेमी फ्यूज्ड सिलिका की आवश्यकता होती है, जिसमें 75 माइक्रोन की आईडी और 360 माइक्रोन की आईडी होती है। , और अंत में 150 माइक्रोन की आईडी और 360 माइक्रोन की एक ओडी के साथ दो 57 सेमी।
    नोट: सिलिका ट्यूबिंग काटते समय, धीरे-धीरे पॉलीइमिड कोटिंग को कुरेदलें, और सबसे साफ कट पाने के लिए मोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए जांच करें कि यह एक सीधी कटौती है (यह कोई रुकावट या लीक रूप सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है)।
  2. सुपर फ्लैक्स नट तिरछी झांकना 1/4-28 फ्लैट-बॉटम के साथ 360 माइक्रोन ओडी सिलिका ट्यूबिंग और 0.027 "आईडी एक्स 1/16" के लिए नैनो-टाइट आस्तीन (0.0155" आईडी एक्स 1/16 " ओडी का उपयोग करके 15 कनेक्शन स्थापित करें Tefzel (ETFE), 1/4-28 फ्लैट नीचे, 1/16 के लिए "OD । निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार कनेक्शन का निर्माण करें(चित्रा 1)।
  3. एक 500 माइक्रोन सिरिंज में 6 छोटे बेलनाकार मैग्नेट रखें। इस सिरिंज को बफर के साथ अन्य 500 माइक्रोन सिरिंज और दो 5 मिलीएल सिरिंज के साथ भरें और हवा निकालें। सिरिंज पंप पर स्थिति के रूप में चित्रा 2एपर दिखाया गया है ।
    नोट: 5 mL सिरिंज 500 μL सिरिंज से बड़े हैं, तो एक स्पेसर के लिए जगह में एक साथ सभी सिरिंज कसने की जरूरत है(चित्रा 2बी)।
  4. सिरिंज पंप डाट कस इतना है कि सेल सिरिंज लगभग ५० μL छोड़ दिया है जब मोटर स्टालों । यह चुंबकीय उभारकों के लिए जगह छोड़ देंगे। (चित्रा 2सी-डी)।
    सावधानी: यदि सिरिंज पंप मैग्नेट पर दबाव डालता है, तो वे सिरिंज को जाम कर देंगे और सिरिंज को तोड़ने का कारण बन सकते हैं।
  5. एक लूयर एडाप्टर का उपयोग करना, प्रत्येक सिरिंज के लिए एक मैनुअल वाल्व कनेक्ट। फिगर 3में दिखाए गए सिलिका ट्यूबिंग को इकट्ठा करें ।
    नोट: कोशिकाओं के साथ लाइन धागा + एच2ओ2 दूसरी तरफ पार के माध्यम से सभी तरह से । इसके बाद इसे 450 माइक्रोन आईडी सिलिका ट्यूबिंग में डालें। 5 मिलीआर सिरिंज में म्यान बफ़र्स कोशिकाओं और एच2ओ2की तुलना में तेज दर से बह रहे होंगे । दोनों तरफ म्यान बफ़र्स के साथ, कोशिकाओं को विकिरण के लिए एक ही लाइन में हाइड्रोडायनामिक रूप से केंद्रित किया जाएगा।
  6. लेजर के बगल में स्थिति प्रवाह प्रणाली। एक लाइटर का उपयोग करना, लेजर विकिरण के लिए एक खिड़की बनाने के लिए 450 माइक्रोन आईडी ट्यूबिंग पर सिलिका कोटिंग को जला दें।
  7. छह मैग्नेट युक्त सेल सिरिंज के ऊपर एक चुंबकीय उभारा रखें।
  8. किसी भी लीक के लिए सिस्टम को फ्लश करने और परीक्षण करने के लिए सिस्टम के माध्यम से १,०८३.३ μL/मिन प्रवाह बफर की अंतिम प्रवाह दर के लिए ४९२.४ μL/मिन के लिए सिरिंज पंप सेट करें ।
  9. एक उत्तल लेंस का उपयोग करसिलिका ट्यूबिंग पर एक्सीमर लेजर ध्यान केंद्रित करें। एक बार ध्यान केंद्रित करने के बाद, सिलिका ट्यूबिंग के पीछे कागज का एक छोटा सा टुकड़ा रखकर विकिरण खिड़की का परीक्षण करें और लेजर को चालू करें। विकिरण से जला क्षेत्र को मापें। शून्य का एक अपवर्जन अंश प्राप्त करने के लिए विकिरण खिड़की और प्रवाह दर का उपयोग करके आवश्यक लेजर आवृत्ति की गणना करें।
    नोट: आईसी-एफपीओ प्रयोग के लिए अनुशंसित लेजर ऊर्जा ‧120 एमजे है। 2.58 मिमी की विकिरण खिड़की और 1083.3 माइक्रोन/मिन की प्रवाह दर के साथ 0 का अपवर्जन अंश प्राप्त करने के लिए, आवृत्ति 44 होना चाहिए। नीचे समीकरण है कि लेजर आवृत्ति की गणना करने के लिए आवश्यक है अगर विकिरण खिड़की, प्रवाह दर, और बहिष्कार अंश जाना जाता है ।

    जहां डब्ल्यू एनएल में वॉल्यूम है, एक्स एमएम में लेजर स्पॉट चौड़ाई है, वाई माइक्रोन में सिलिका ट्यूबिंग आईडी है, वी माइक्रोन में कुल मात्रा है, बी अपवर्जन अंश है, एक μL/मिनट में प्रवाह दर है, और एफ हर्ट्ज में आवृत्ति है ।

2. शमन और एच2ओ2 बनाओ

  1. 100 एमएम एन-टेर्ट-बुटिल-अल्फा-फिनाइलनिट्रोन (पीबीएन) और 100 एमएम एन, एन-डाइमेथिलथिओरेया (डीएमटीयू) युक्त शमन बनाएं। Aliquot प्रत्येक नमूने के लिए बुझाने के 11 mL एक 50 mL शंकुट्यूब में।
  2. तनु एच2ओ2 से 200 एमएम। प्रत्येक नमूने के लिए एच2ओ2के 500 माइक्रोन की आवश्यकता होती है।
    नोट: बुझाने के दिन पहले बनाया जा सकता है और प्रकाश से संरक्षित, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। एच2ओ2 को प्रयोग के दिन ताजा किया जाना चाहिए।

3. कोशिकाओं को इकट्ठा करें

  1. एक T175 फ्लास्क में कोशिकाओं के बारे में 70-90% प्रवाह के लिए वृद्धि हुई है ।
  2. मीडिया निकालें और बफर के साथ कुल्ला।
    नोट: उपयोग करने के लिए विशिष्ट बफ़र्स सेल संस्कृति ग्रेड डुल्बेकको के फॉस्फेट-बफरेड लवण (डीपीबीएस) या हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएस) हैं।
  3. या तो ट्राइप्सिन-EDTA या एक स्क्रैपर के साथ उपयोग कर कोशिकाओं को अलग करें।
  4. एक बार बफर के 10 mL में अलग फिर से निलंबित और कोशिकाओं की गिनती ।
  5. नीचे स्पिन, बफर और ट्रिप्सिन-EDTA को हटा दें, और 2 x 106 कोशिकाओं/mL बनाने के लिए फिर से निलंबित करें ।
  6. अलीकोट प्रति नमूना कोशिकाओं का 500 माइक्रोन।
    नोट: प्रत्येक स्थिति के लिए, कम से कम 3 लेजर नमूने बनाएं, और 3 कोई लेजर नियंत्रण नहीं।

4. आईसी-एफपीओ का प्रदर्शन

  1. बफर के साथ दो 5 मिलीएल सिरिंज भरें, कोशिकाओं के साथ मैग्नेट युक्त 500 माइक्रोन सिरिंज, और एच2ओ2के साथ अंतिम 500 माइक्रोन सिरिंज। चुंबकीय उभारा चालू करें।
  2. डिमेथिल सल्फासऑक्साइड (DMSO) के 220 μL में स्पाइक को बुझाने के एक एलिकोट में, धीरे-धीरे मिश्रण, और विकिरणित नमूनों को इकट्ठा करने के लिए प्रवाह प्रणाली के पीछे रखें। डीएमएसओ के अलावा एंडोजेनस मेथिओनीन सल्फास ऑक्साइड अपडक्ता को बाधित करेगा।
  3. लेजर चालू करें, 7 एस का इंतजार करें, और फिर प्रवाह प्रणाली चालू करें।
  4. एक बार नमूना बहने खत्म हो जाने के बाद, लेजर को बंद कर दें, और धीरे-धीरे एकत्र नमूने के साथ शमन मिलाएं। चरण 4.5 और 4.6 के दौरान इसे साइड में रखें।
  5. बफर के साथ सभी चार सीरिंज भरें कोशिकाओं में निलंबित कर रहे है और यह प्रवाह प्रणाली के माध्यम से प्रवाह ।
  6. सिस्टम फ्लशिंग खत्म होने के बाद, चरण 4.1 और 4.2 दोहराएं। विकिरण के बिना प्रवाह शुरू करें। यह कोशिकाओं में पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण के लिए खाते में कोई लेजर नियंत्रण नहीं है।
  7. जबकि अगला नमूना चल रहा है, 5 मिन के लिए 450-800 x ग्राम पर पिछले नमूने को स्पिन करें, सॉल्वेंट को हटा दें, और रेडियोइम्यूनोप्रिसिपेटेशन परख (रिपा) बफर जैसे सेल लाइसिस बफर के 100 माइक्रोन में फिर से निलंबित करें।
  8. नमूने को माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज करें।
  9. जब सभी नमूने चलने समाप्त हो गए हैं, सफाई के लिए प्रवाह प्रणाली को अलग करें। इस्तेमाल सिलिका ट्यूबिंग को त्यागें और 50% पानी में 1 घंटे के लिए सोनिकिंग करके अन्य सभी कनेक्शन साफ करें: 50% मेथनॉल। निर्माता के निर्देशों के अनुसार सीरिंज साफ करें।

5. डाइजेस्ट

  1. पूरी कोशिका को पचाएं। 10 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूने और गर्मी विगलन द्वारा शुरू करें।
  2. गर्म होने के बाद बर्फ पर लाइसेट को 15 मिन के लिए ठंडा करें।
  3. डीएनए और आरएनए पचाने के लिए न्यूकलीज की 25 इकाइयां जोड़ें और 15 मिन के लिए कमरे में शीतोष्ण में इनक्यूबेट करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए 16,000 x ग्राम पर टेबल-टॉप अपकेंद्री का उपयोग करके स्पिन नमूने।
  5. अधिनेता को एकत्र करें और इसे एक साफ माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. प्रोटीन परख किट का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता की जांच करें।
  7. एक साफ माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब के लिए नमूना के 20-100 μg हस्तांतरण और १०० μL के लिए ले आओ ।
  8. 45 मिन के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर 20 एमएम डिथियोथ्रेरियोटोल (डीटीटी) के साथ नमूनों को कम करें।
  9. कमरे के तापमान पर 15 न्यूनतम के लिए नमूनों को ठंडा करें।
  10. प्रकाश से संरक्षित 20 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर 20 एमएम iodoacetamide (आईएए) के साथ Alkylate ।
  11. एक1:4 अनुपात प्रोटीन: एसीटोन पर पूर्व ठंडा एसीटोन जोड़ें । नमूने मिलाएं और रात भर -20 डिग्री सेल्सियस में रखें।
  12. अगली सुबह 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 16,000 x ग्राम पर स्पिन नमूने लिए।
  13. अधिष्णकत निकालें और 90% पूर्व ठंडा एसीटोन के 50 माइक्रोन जोड़ें। नमूने मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 16,000 x ग्राम पर स्पिन करें।
  14. एसीटोन निकालें और ऊपर को कवर करने वाले लिंट फ्री वाइप के साथ माइक्रोसेंड्रिफ्यूज की टोपियां खोलकर नमूनों को सूखने दें। नमूनों के सूखजाने के बाद, 10 एमएम ट्रिस बफर पीएच 8 के साथ प्रोटीन पैलेट को फिर से निलंबित करें।
  15. 10 m Tris बफर पीएच 8 के 40 μL में ट्राइप्सिन के 20 μg को फिर से निलंबित करें। 2 μg ट्रिप्सिन जोड़ें (द्रव्यमान: 1 ट्रिप्सिन का द्रव्यमान अनुपात: 50 नमूना)। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट के नमूने।
  16. अगली सुबह पेप्टाइड परख का उपयोग करपेस्पेइड एकाग्रता की जांच करें। पेप्टाइड परख के लिए नमूने को हटा दिए जाने के बाद, नमूनों में फोरमिक एसिड जोड़कर ट्राइप्सिन पाचन को बुझाएं (अंतिम एकाग्रता 5% लौमिक एसिड है)।
  17. एक बार अंतिम पेप्टाइड एकाग्रता निर्धारित हो जाने के बाद, प्रत्येक नमूने के 10 μg को एक साफ माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब पर स्थानांतरित करें। यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक नमूने की समान मात्रा का विश्लेषण किया जाता है। वैक्यूम अपकेंद्री का उपयोग करके नमूना सुखालें। एक बार सूखे बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री ग्रेड 0.1% फोरमिक एसिड के 20 μL के साथ फिर से निलंबित। नमूने ऑटोसैंपलर शीशियों में स्थानांतरित करें।

6. लिक्विड क्रोमेटोग्राफी-टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री

  1. FPOP संशोधनों को स्थानीयकृत करने के लिए एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण का उपयोग करपचाने वाली कोशिका लाइसेट का विश्लेषण करें।
  2. पानी (ए) में 0.1% फोरिक एसिड और एसीटोनिट्रिल (बी) में 0.1% फोरमिक एसिड के मोबाइल चरणों का उपयोग करें।
  3. 180 माइक्रोन x 20 मिमी C18 (5 μm और 100 Å) ट्रैपिंग कॉलम पर नमूना के 0.5 μg लोड और 15 मिमी के लिए 99% (ए) और 1% (बी) के साथ नमूना धोएं।
  4. एक 75 μm x 30 सेमी C18 (5 μm और 125 Å) विश्लेषणात्मक कॉलम का उपयोग करना, 0.300 μL/एक मिन के लिए 3% (बी) से शुरू तो 1-2 मिन से 10% (बी) के लिए रैंप की प्रवाह दर के साथ विश्लेषणात्मक जुदाई विधि चलाते हैं। अगला रैंप 2-100 मिन से 45% (बी) तक फिर 100-110 मिन से 100% (बी) । 110-115 मिन से 100% (बी) पर पकड़ कर कॉलम को साफ करें । 115-116 min से 3% (बी) से नीचे रैंप और 116-130m से 3% (बी) पर पकड़ कर कॉलम को फिर से कंडीशन करें ।
  5. एमएस अधिग्रहण विधि निर्धारित करें ताकि 375-1500 की एम/जेड स्कैन रेंज के साथ 60,000 का संकल्प लिया जा सके। 50 एमएस के अधिकतम इंजेक्शन समय के साथ स्वचालित लाभ नियंत्रण (एजीसी) लक्ष्य को 5.0 x 105 तक सेट करें।
  6. एमएस अधिग्रहण के दौरान, 1.2 मीटर/z की एक अलगाव खिड़की और 4 एस के चक्र समय के साथ डेटा निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) के माध्यम से अलगाव के लिए 2-6 चार्ज राज्यों के साथ अग्रदूत आयनों का चयन करें । 32% तक सामान्यीकृत ऊर्जा सेट के साथ एचसीडी सक्रियण के लिए 5.0 x 104 की तीव्रता सीमा के साथ पेप्टाइड्स का चयन करें। 60 एस के लिए 1 एमएस/एमएस अधिग्रहण के बाद पेप्टाइड्स को बाहर करें। 5.0 x 104 के एजीसी लक्ष्य और 35 एमएस के अधिकतम इंजेक्शन समय के साथ एमएस/एमएस संकल्प को 15,000 तक सेट करें।

7. डेटा प्रोसेसिंग

  1. एक प्रासंगिक प्रोटीन डेटाबेस और प्रासंगिक डाइजेस्ट एंजाइम के खिलाफ एक उपलब्ध प्रोटीन विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर रॉ फ़ाइलों को खोजें। यहां स्विस-प्रोट होमो सेपियंस डाटाबेस और ट्राइप्सिन का इस्तेमाल करें।
  2. 350 से 5,000 डीए और 10 पीपीएम की सामूहिक सहनशीलता के बीच खोज करने के लिए अग्रदूत द्रव्यमान सेट करें। 6 से 144 अवशेषों के बीच पेप्टाइड लंबाई के साथ सबसे अधिक 1 चूक दरार साइट पर हो सकता है। ये सीमाएं डेटाबेस खोज की सुविधा प्रदान करती हैं।
  3. एक स्थिर संशोधन के रूप में कार्बामिडोमथाइल (+57.021) के साथ 0.02 डीए के लिए टुकड़ा आयनों अधिकतम जन सहिष्णुता सेट करें और एक गतिशील संशोधन के रूप में 17 अमीनो एसिड से सभी एफपीओ संशोधन(चित्रा 4 एफपीओ संशोधनों का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन विश्लेषण कार्यप्रवाह का एक उदाहरण है)।
    नोट: सेरीन और थ्रेनोइन पर FPOP संशोधनहाइड्रोक्सिल कट्टरपंथियों के साथ उनकी कम प्रतिक्रियाशीलता के कारण खोज में शामिल नहीं हैं।
  4. 1% और 5% की झूठी खोज दर के साथ एक डिकोय डेटाबेस के साथ खोजें।
  5. एक बार फाइलें एफपीओ संशोधन की सीमा की गणना करने के लिए खोज समाप्त हो जाती हैं। ओपन प्रोटेम डिस्कवर 2.2, निर्यात अनुक्रम, संशोधन स्थान, प्रोटीन परिग्रहण, स्पेक्ट्रम फ़ाइल, अग्रदूत बहुतायत, और प्रतिधारण समय जानकारी। समीकरण 4 से संशोधन की सीमा की गणना करें:

    संशोधित ईआईसी क्षेत्र हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी संशोधन के साथ एक विशिष्ट पेप्टाइड का क्रोमेटोग्राफिक क्षेत्र है। ईआईसी क्षेत्र उस विशिष्ट पेप्टाइड के संशोधित और असंशोधित दोनों क्षेत्रों का कुल क्रोमेटोग्राफिक क्षेत्र है। ऑक्सीकरण की सीमा के साथ और विकिरण के बिना नमूनों में गणना की जाती है। नमूना उत्सर्जन विकिरण (नियंत्रण) किसी भी पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण के लिए खाता है जो एच2ओ2 एक्सपोजर से पहले और बाद में कोशिकाओं में मौजूद हो सकता था। एफपीओ विशिष्ट संशोधनों को अलग करने में मदद करने के लिए विकिरण नमूनों से नियंत्रण घटाया जाता है।

Representative Results

आईसी-एफपीओ लाइव कोशिकाओं में प्रोटीन इंटरैक्शन से पूछताछ करने के लिए एक पदचिह्न विधि है। आईसी-एफपीओ प्रवाह प्रणाली में, एच2ओ2 एक्सपोजर समय लगभग 3 एस तक सीमित है, कोशिकाओं के लिए हानिकारक परिणामों के बिना उच्च एच2ओ2 सांद्रता की आवश्यकता है। प्रवाह प्रणाली में म्यान बफर की दो धाराओं को भी शामिल किया गया है, जो कोशिकाओं को समान रूप से विकिरणित करने के9लिए कोशिकाओं के एक प्रवाह का उत्पादन करने वाले ट्यूबिंग के केंद्र में केंद्रित करता है। ऑर्थोगोनल वाईजेड की फ्लोरेसेंस इमेजिंग(चित्र5ए)सेल समाधान (एक TMRM फ्लोरोफोर युक्त) से म्यान बफर (एक फ़ेसीसी फ्लोरोफोर युक्त) का स्पष्ट अलगाव दिखाता है। इस अलगाव पर जोर देने के लिए, चित्रा 5बी और चित्रा 5सी या तो म्यान बफर समाधान या सेल समाधान के तीन आयामी औसत गर्मी नक्शे दिखाते हैं, जो दो समाधानों के न्यूनतम मिश्रण को दर्शाते हैं।

एकल कोशिका प्रवाह प्रणाली के उपयोग से ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित प्रोटीन की संख्या 13 गुना(चित्र 6ए)9तक बढ़ जाती है । इस विधि में, कई सेलुलर डिब्बों में प्रोटीन को झिल्ली प्रोटीन, साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन और नाभिक के भीतर प्रोटीन सबसे प्रचलित8,,9के साथ लेबल किया जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रोटीन को बरकरार कोशिकाओं के भीतर संशोधित किया गया था, एच2ओ2 उपचार और विकिरण(चित्र 6बी)8के बाद सेलरॉक्स उपचारित कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवियां की गई थीं। लेबलिंग प्रक्रिया में कोशिकाओं की स्थिरता आगे आईसी-FPOP की प्रभावकारिता की पुष्टि करने के लिए अपने मूल सेलुलर वातावरण में प्रोटीन की जांच । टैंडेम-मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके, इन संशोधनों को प्रोटीन पर विशिष्ट अमीनो एसिड के लिए स्थानीयकृत किया जा सकता है। चित्रा 7 एक संशोधन का प्रतिनिधित्व करता है जो आईसी-एफपीओ के दौरान अपने निकाले गए आयन क्रोमेटोग्राम के साथ होता है। निकाले गए आयन क्रोमेटोग्राम में देखी गई पारी संशोधित पेप्टाइड में ऑक्सीडाइज्ड मेथिओनीन के कारण हाइड्रोफोबीसिटी में परिवर्तन का अनुवाद करती है।

यह परीक्षण करने के लिए कि क्या एफपीओ संशोधन कोशिकाओं के अंदर सॉल्वेंट एक्सेसिबिलिटी की जांच करते हैं, इन-सेल लेबल वाले ऐक्टिन की तुलना इन विट्रो फुटप्रिंटिंग अध्ययन और ऐक्टिन(चित्रा 8)8की विभिन्न क्रिस्टल संरचनाओं दोनों से की गई थी। इन-सेल लेबल ऐक्टिन का प्रतिनिधित्व चित्रा 8में किया गया हैएक गुआन एट अल द्वारा इन विट्रो अध्ययन से ऑक्सीकरण की तुलनीय सीमा से पता चलता है10 (चित्रा 8बी),समापन ऐक्टिन में इन-सेल और इन विट्रो अध्ययन दोनों के लिए समान विलायक पहुंच है। आईसी-एफपीओ की पुष्टि करने के लिए ऐक्टिन की विलायक पहुंच की जांच कर रहा था, एफपीओ संशोधनों की सीमा की तुलना दो ऐक्टिन क्रिस्टल संरचनाओं(चित्रा 8सी)से गणना किए गए लेबल वाले अवशेषों की विलायक पहुंच से की गई थी । यह सहसंबंध दर्शाता है कि आईसी-एफपीओ मोनोमेरिक प्रोटीन की विलायक पहुंच की जांच करता है।

Figure 1
चित्रा 1: कैसे ठीक से ferules का निर्माण करने के लिए । (क)कसने से पहले फर्रूल्स, सिलिका ट्यूबिंग और आस्तीन को एक साथ रखें। (ख)सभी घटकों को एक साथ कस लें । (ग)अंतिम उत्पाद एक फेरूल का उत्पादन करेगा जिसे आस्तीन पर कड़ा कर दिया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आईसी-एफपीओ प्रवाह प्रणाली की स्थापना। (ए)लेजर के बगल में स्थित पूरी तरह से इकट्ठे आईसी-एफपीओ प्रवाह प्रणाली की छवि। (ख)एक स्पेसर का उदाहरण ५०० μL सिरिंज के बाहरी व्यास को बढ़ाने के लिए सफलतापूर्वक नीचे सभी सिरिंज एक साथ कस ने की जरूरत है । (ग)प्रतिनिधि चित्र चुंबकीय उभारकों के लिए आवश्यक स्थान दिखारहे हैं । (D)सिरिंज को तोड़ने के बिना सिरिंज पंप को स्टाल करने के लिए डाट आवश्यक हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: आईसी-एफपीओपी के लिए विकसित प्रवाह प्रणाली की योजनाबद्ध। नीली रेखाएं 450 माइक्रोन आईडी और 670 माइक्रोन ओडी के साथ सिलिका ट्यूबिंग का प्रतिनिधित्व करती हैं, लाल रेखाओं में 150 माइक्रोन आईडी और 360 माइक्रोन ओडी होती है, और नारंगी रेखाओं में 75 माइक्रोन आईडी और 360 माइक्रोन ओडी होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रोटीन विश्लेषण सॉफ्टवेयर FPOP संशोधनों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया । प्रत्येक नोड में खोजे गए संबंधित संशोधनों के साथ एक विशिष्ट कार्यप्रवाह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एकल सेल प्रवाह प्रणाली हाइड्रोडायनामिक रूप से कोशिकाओं को एक ही धारा में केंद्रित करती है। (A)ऑर्थोगोनल वाईजेड स्टैक ने म्यान बफर (ग्रीन, फिथ फ्लोरोफोर) से घिरे सेलुलर एनालाइट (लाल, टीएमआरएम फ्लोरोफोर) के 3डी फोकसिंग को दर्शाते हुए । म्यान बफर(बी)और सेलुलर एनालाइट(सी)का त्रि-आयामी औसत तीव्रता गर्मी नक्शा। कम तीव्रता नीले और उच्चतम लाल(बी-सी)हैं । इस आंकड़े को रिनास एट अल से संशोधित किया गया है9कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: आईसी-एफपीओ फ्लो सिस्टम का उपयोग सेवन कोशिकाओं में एफपीओ संशोधित प्रोटीन को काफी बढ़ाता है। (A)प्रवाह प्रणाली के साथ और बिना पहचाने गए ऑक्सीडाइज्ड प्रोटीन की तुलना। प्रवाह प्रणाली १३९१ FPOP संशोधित प्रोटीन की पहचान की, जबकि केवल १०५ प्रोटीन ५८ संशोधित प्रोटीन के ओवरलैप के साथ कोई प्रवाह प्रणाली के साथ की पहचान की गई । इस आंकड़े को रिनास एट अल से संशोधित किया गया है9 (बी)सेल्रॉक्स की फ्लोरेसेंस इमेजिंग आईसी-एफपीओपी शो के बाद कोशिकाएं ऑक्सीडेटिव लेबलिंग के बाद अभी भी बरकरार हैं । कोशिकाओं को 665 एनएम पर ओलंपस फ्लूओव्यू FV1000 एमपीई मल्टीफोर्न माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। दिखाया गया छवि एक टुकड़ा है। इस आंकड़े को एस्पिनो एट अल से संशोधित किया गया है।8कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: आईसी-एफपीओ के दौरान होने वाले टैंडेम एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा के उदाहरण । उत्पाद आयन (एमएस/एमएस) एक(ए)असंशोधित पेप्टाइड का स्पेक्ट्रा, और उस पेप्टाइड पर पाए जाने वाले अवशेषों एम8 पर पाया गया एक(बी)ऑक्सीकरण। एक प्रतिनिधि ईआईसी(सी)असंशोधित पेप्टाइड और(डी)संशोधित पेप्टाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: आईसी-एफपीओ प्रोटीन की विलायक पहुंच की जांच करने में प्रभावी है। (A)ऐक्टिन से 9 ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित पेप्टाइड्स के लिए संशोधन की सीमा। मान औसत प्लस और माइनस मानक विचलन (एन = 3) के रूप में दिखाए जाते हैं। (ख)गुआन एट अल से सिंक्रोट्रॉन रेडियोलिसिस द्वारा विट्रो में ऑक्सीकृत ऐक्टिन पेप्टाइड्स का संशोधन10 (सी)एसएएसए के साथ अवशेष एफपीओ संशोधनों का सहसंबंध (त्रिकोण, धराशायी प्रवृत्ति रेखा) और ओपन (सर्कल, सॉलिड ट्रेंड लाइन) ऐक्टिन के राज्यों में एसएएसए के साथ अवशेष ों के संशोधन । इस आंकड़े को एस्पिनो एट अल से संशोधित किया गया है।8कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्रोटीन संरचना और प्रोटीन-लिगामेंट परिसरों को पूरी कोशिकाओं या कोशिका ओं में एक प्रोटेम-वाइड तरीके से अध्ययन करने के लिए कई बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित तकनीकविकसित की गई है। इन तकनीकों में ऑक्सीकरण (एसपीरॉक्स), थर्मल प्रोटेम प्रोफाइलिंग (टीपीपी), केमिकल क्रॉस-लिंकिंग (एक्सएल-एमएस), और हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग (एचआरपीएफ) की दर से प्रोटीन की स्थिरता तक सीमित नहीं हैं। प्रत्येक तकनीक में एक-दूसरे की तुलना में अद्वितीय सीमाएं और फायदे होते हैं, जिनकी बड़े पैमाने पर12की समीक्षा की गई है। इनमें से प्रत्येक विधियों का उपयोग प्रोटीन संरचना को स्पष्ट करने और अंततः जटिल सेलुलर वातावरण के भीतर कार्य करने के लिए प्रोटेम वाइड स्ट्रक्चरल बायोलॉजी के लिए किया गया है। आईसी-एफपीओ एक एचआरपीएफ तकनीक है जो अमीनो एसिड की सॉल्वेंट उजागर साइड चेन को संशोधित करने के लिए हाइड्रोक्सिल कणों का उपयोग करती है, जो व्यवहार्य कोशिकाओं13के भीतर प्रोटीन संरचना और प्रोटीन-लिगांड इंटरैक्शन की जांच करती है। आईसी-एफपीओ लाइव कोशिकाओं में प्रारंभिक एचआरपीएफ में सुधार है जिसने मिनट टाइमस्केल14पर कण उत्पन्न करने के लिए फेन्टन रसायन विज्ञान का उपयोग किया। इस अध्ययन में, बफर की पीएच या आयनिक ताकत को कम करने के जवाब में एक अभिन्न झिल्ली प्रोटीन में संरचनात्मक परिवर्तन सफलतापूर्वक प्रोटीन भर में अच्छे ऑक्सीकरण कवरेज के साथ विशेषता थी। फेंटन रसायन विज्ञान की तुलना में, आईसी-एफपीओ बहुत तेज है, माइक्रोसेकंड टाइमस्केल पर प्रोटीन को संशोधित करता है, इस प्रकार देशी प्रोटीन संरचना का अध्ययन करने में सक्षम होता है।

आईसी-एफपीओ के लिए एक महत्वपूर्ण परीक्षण एच2ओ2के संपर्क में आने के बाद कोशिकाओं की व्यवहार्यता की पुष्टि करना है। 40 सेमी मिक्सिंग लाइन का उपयोग करके, कोशिकाओं को विकिरण से पहले लगभग 3 एस के लिए एच2ओ2 में इनक्यूबेटेड किया जाता है। इस बार इस सिलिका ट्यूबिंग की लंबाई बदलकर एडजस्ट किया जा सकता है। यह उल्लेखनीय है कि यद्यपि कोशिका व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए ट्राइपैन ब्लू का उपयोग एच2ओ2 ऊष्मायन के बाद कोशिकाओं की अखंडता को निरंतर बनाता है, कोशिकाओं को एच2ओ2के साथ बातचीत करने वाले सिग्नलिंग मार्गों को प्रभावित करने वाले तनाव में होने की संभावना हो सकती है। सौभाग्य से, प्रोटीन संश्लेषण की तुलना में कम ऊष्मायन समय तेज होता है जो मौजूद प्रोटीन एच2ओ2द्वारा प्रेरित नहीं होता है।

अगला महत्वपूर्ण कदम प्रवाह प्रणाली की उचित असेंबली की पुष्टि करना है । एक बार इकट्ठे होने के बाद, सुनिश्चित करें कि वांछित बफर के साथ सिस्टम को फ्लश करने के बाद कोई लीक मौजूद नहीं है। यदि लीक मौजूद हैं, तो सुनिश्चित करें कि सिलिका ट्यूबिंग को ठीक से काटा गया था और एक बार कड़ा करने के बाद उचित मुहर लगाने के लिए फेरूल के खिलाफ फ्लश किया जाता है। सभी भागहाथ-कड़ा हैं, इसलिए कोई उपकरण आवश्यक नहीं है। प्रत्येक आईसी-एफपीओ प्रयोग के दौरान, सुनिश्चित करें कि सेल सिरिंज में चुंबकीय उभारक गति में बने रहें। यह छोटा आंदोलन उन कोशिकाओं की संख्या को सीमित करता है जो सिरिंज के नीचे बसते हैं लेकिन कोशिकाओं को कतरनी करने के लिए पर्याप्त कठोर नहीं है। एक रन के बाद, सिरिंज में लगभग 50 माइक्रोन कोशिकाएं बची हैं। अगले प्रयोग तक ले जाने वाली कोशिकाओं की संख्या को सीमित करने के लिए हमेशा इसे एक रिंसिंग स्टेप के साथ पतला करना सुनिश्चित करें। यदि कई सेल उपचारों की तुलना की जा रही है तो नए सिरे से सेल सिरिंज का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। परीक्षण की जा रही कोशिकाओं के लिए एक उपयुक्त बफर का चयन करना भी महत्वपूर्ण है। कुछ बफ़र्स हाइड्रोक्सिल रेडिकल रेडिकल को बुझाते हैं जिससे प्रोटीन पर कम संशोधन होते हैं। Xu एट अल से पता चला है कि कुछ आमतौर पर इस्तेमाल बफ़र्स हाइड्रोक्साइल कट्टरपंथी जीवनकाल11कम । डीपीबीएस और एचबीएसएस आईसी-एफपीओ प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले आम बफ़र्स हैं।

आईसी-एफपीओ के बाद, आवश्यक मापदंडों के आधार पर पाचन प्रोटोकॉल का अनुकूलन करें। चूंकि एफपीओ अपरिवर्तनीय सहसंयोजक संशोधनों का उत्पादन करता है, इसलिए लेबलिंग कवरेज खोने के बिना पूरी तरह से पाचन और सफाई के लिए पर्याप्त समय उपलब्ध है। हमेशा प्रोटीन एकाग्रता का परीक्षण और सामान्य करें ताकि समान पेप्टाइड सांद्रता को मिलकर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए लोड किया जा सके। अंत में, ध्यान रखें कि आईसी-एफपीओ के साथ मिलकर इम्यूनोप्रिसिप्रिशन नहीं किया जा सकता है। यदि कोई एफपीओ संशोधन बातचीत के क्षेत्र को लक्षित करता है तो एंटीबॉडी की आत्मीयता कम हो जाएगी। FPOP संशोधनों की पहचान बढ़ाने में मदद करने के लिए, 2डी-क्रोमेटोग्राफिक पृथक्करण कदमों ने15का पता लगाया ऑक्सीडाइज्ड पेप्टाइड्स की संख्या को तीन गुना से अधिक दिखाया है ।

किसी भी FPOP प्रयोग की एक चुनौती संभावित ऑक्सीकरण उत्पादों के कारण डेटा विश्लेषण का जटिल स्तर है जो उत्पन्न हो सकता है। यह इन-सेल या इन विट्रो दोनों के लिए सच है लेकिन सेल लाइसेट्स का विश्लेषण करने की अतिरिक्त जटिलता के साथ काफी बढ़ जाता है। आईसी-एफपीओ के आगे अनुकूलन के साथ उच्च संशोधन कवरेज के साथ अधिक प्रोटीन उत्पन्न हो रहे हैं, इस प्रकार तेजी से विश्लेषण को और अधिक दुरूह बना रहे हैं। एक ही आईसी-एफपीओ प्रयोग से उत्पन्न डेटा की कतरनी मात्रा मैनुअल सत्यापन के उपयोग को सीमित करती है जिससे शोधकर्ताओं को सॉफ्टवेयर पर अधिक भरोसा करना पड़ता है। इसके कारण, रिनास एट अल ने प्रोटेम डिस्कवर (पीडी)16का उपयोग करके एचआरपीएफ के लिए एक क्वांटिटेशन रणनीति विकसित की। यह विधि एक स्प्रेडशीट में मात्रात्मक मंच के साथ संयुक्त पीडी पर एक बहु-खोज नोड कार्यप्रवाह का उपयोग करती है। आईसी-एफपीओ प्लेटफॉर्म पर आगे सुधार बढ़ ते हुए प्रजनन क्षमता और मात्रा सटीकता के साथ-साथ एफपीओ संशोधनों के साथ पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या बढ़ाने के लिए चल रहे हैं।

Disclosures

लिसा जोंस कोशिकाओं पेटेंट के लिए प्रवाह विधानसभा पर एक आविष्कारक है (प्रकाशन संख्या: २०१८००७९९९८) ।

Acknowledgments

इस काम को एलएमजे के लिए एनएसएफ करियर अवार्ड (एमसीबी1701692) ने सपोर्ट किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A any brand is sufficient
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock SGE Analytical Science 008760
50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22 any brand is sufficient
500 µL SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models Fisher Scientific SG-00723
Acetone, HPLC Grade Fisher Scientific A929-4 4 L quantity is not necessary
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS120-500
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg Waters 186007496
ACQUITY UPLC M-Class System Waters ACQUITY UPLC M-Class System
Aluminum Foil Fisher Scientific 01-213-100 any brand is sufficient
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material Phenomenex 04A-4299
Centrifuge Eppendorf 022625501
Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Dithiothreiotol (DTT) AmericanBio AB00490-00005
DMSO, Anhydrous Invitrogen D12345
EX350 excimer laser GAM Laser EX350 excimer laser
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID IDEX Health & Science 1548L
Formic Acid, LC/MS Grade Fisher Scientific A117-50
HV3-2 VALVE Hamilton 86728
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H325-100 any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Iodoacetamide (IAA) ACROS Organics 122270050
Legato 210 syringe pump KD Scientific 788212 Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene IDEX Health & Science P-618L
Methanol, LC/MS Grade Fisher Scientific A454SK-4 4 L quantity is not necessary
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002436
N,N'-Dimethylthiourea (DMTU) ACROS Organics 116891000
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x 1.6" IDEX Health & Science F-242X
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" IDEX Health & Science F-246
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) ACROS Organics 177350250
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
PE50-C pyroelectric energy meter Ophir Optronics 7Z02936
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Scientific 23275
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific A53225
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Scientific 90058
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis Fisher Scientific 88702
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32" Molex 1068680064 any capillary tubing cutter is sufficient
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP150350 Polymicro Technologies 1068150024
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 µm, Outer Diameter 670 µm, TSP450670 Polymicro Technologies 1068150025
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP075375 Polymicro Technologies 1068150019
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific P382-500
Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software) Thermo Scientific OPTON-30799
Rotary Magnetic Tumble Stirrer V&P Scientific, Inc. VP 710D3
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps V&P Scientific, Inc. VP 710D3-4
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD IDEX Health & Science P-259X
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD IDEX Health & Science P-255X
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick V&P Scientific, Inc. VP 722F
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Fisher Scientific PI89900
Tris Base Fisher Scientific BP152-500
Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK Fisher Scientific 05-700-182
Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK Fisher Scientific 05-700-178
UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses THORLABS LA4052
V&P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000 V&P Scientific, Inc. VP724F
VHP MicroTight Union for 360µm OD IDEX Health & Science UH-436
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS118-500
Water, LC/MS Grade Fisher Scientific W6-4

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References

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Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins. J. Vis. Exp. (157), e60911, doi:10.3791/60911 (2020).

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