Summary
ここでは、細胞内でのタンパク質の高速光化学酸化(IC-FPOP)と呼ぶタンパク質フットプリント技術を用いて、生細胞におけるタンパク質構造および相互作用部位を特徴付ける。
Abstract
タンパク質の高速光化学酸化(FPOP)は、タンパク質の構造と相互作用を特徴付けるために使用されるヒドロキシルラジカルタンパク質のフットプリント法です。FPOPは、ヒドロキシルラジカルを生成する過酸化水素を光分解するために248 nmエキシマレーザーを使用しています。これらのラジカルは、20個のアミノ酸のうち19個の側鎖を露出した溶媒を酸化的に修飾する。最近では、この方法は、生きた細胞(IC-FPOP)で、その生きた環境におけるタンパク質相互作用を研究するために用いられている。細胞内のタンパク質の研究は、分子間の群れとインビトロ研究のために破壊される様々なタンパク質相互作用を占めています。カスタム単一セルフローシステムは、IC-FPOP中の細胞凝集および詰まりを低減するように設計されました。このフローシステムは、エキシマレーザーを越えて細胞を個別に焦点を当て、一貫した照射を保証します。結晶構造から計算したFPOPから生成される酸化の程度とタンパク質の溶媒のアクセシビリティを比較することにより、IC-FPOPは、タンパク質の溶媒アクセス可能な側鎖を正確にプローブすることができます。
Introduction
ヒドロキシルラジカルプロテインフットプリント(HRPF)は、ヒドロキシルラジカルから生成された共有修飾を通じてタンパク質の溶媒アクセシビリティをプローブする方法です。タンパク質の構造やタンパク質の相互作用が変化すると、アミノ酸の溶媒曝露が変化し、残留物の修飾の程度が変化します。HRPFでは、タンパク質相互作用11、2、32,3およびタンパク質立体構造変化4,4、5、6,6がインビトロで正常に尋問された。HRPF実験用のヒドロキシルラジカルを生成する方法はいくつかありますが、1つはタンパク質の光化学酸化(FPOP)が速いものです。FPOPは、2005年にハンブレイとグロスによって開発され、過酸化水素(H2O2)7の光分解を介してヒドロキシルラジカルを生成するために2482nmエ7キシマーレーザーを利用しています。2
近年、Espinoらは、生きた細胞におけるタンパク質構造をプローブするFPOPの使用を拡張し、細胞内FPOP(IC-FPOP)88と呼ぶ方法。インビトロ研究とは対照的に、細胞内のタンパク質の研究は、構造に影響を与える可能性のある様々なタンパク質相互作用と共に分子群集を占めています。さらに、完全なプロテオームのスナップショットを提供する利点を提示する潜在的にプロテオーム広い構造生物学を実行するために、多数のシステムの構造情報を提供する可能性があります。さらに、この技術は、膜タンパク質のようなインビトロで研究が困難なタンパク質に最適です。
IC-FPOPの最初の研究は、タンパク質の豊富さと細胞の局在に及ぶ105個のタンパク質の調査に成功しました。IC-FPOP法を改良するために、Rinasらは単一細胞フロー9用のマイクロフローシステムを開発した。元のフローシステムの強化は細胞の凝集を制限し、照射に利用2できるH2O2を増加させる。初期流動システムでは、シリカチューブに凝集した細胞は、詰まりや不均一な照射を生じさせた。シースバッファーの 2 つのストリームの組み込み流体力学的に細胞を集中させ、レーザーを通り過ぎて個別に流れる。H2O2用の別のシリンジを組み込2むことで、より制御可能で最適化可能な露光時間が可能になり、副作用を伴わずに高いH2O2濃度を可能にします。2また、インキュベーション時間を制限すると、内因性カタラーゼによるH2O2の分解が制限される。2この新しいフローシステムを組み込むことで、FPOP改変を伴うタンパク質の検出数は13倍に増加し、この方法の能力を拡大し、生細胞内の多数のタンパク質を探査する能力を拡大した。このプロトコルでは、IC-FPOPフローシステムの組み立てに焦点を当てた一般的なIC-FPOP実験について説明する。
Protocol
1. IC-FPOP フローシステムの設定
- 流れシステムの組み立てを開始するには、切断石を使用して融合したシリカをサイズに切ります。IC-FPOPフローシステムは、内径(ID)450μm、外径(OD)670μm、24cm、40cm、ID75μm、OD360 μmの4つの12cmと17cmの融合シリカが必要です。、そして最後に150 μmのIDおよび360 μmのODの2つの57 cm。
注:シリカチューブを切断するときは、ポリイミドコーティングを静かに削り取り、最もきれいなカットを得るために曲げます。それがまっすぐなカットであることを確認してください(これは、ブロックや漏れフォームを確認するために必要です)。 - ナノタイトなスリーブ(0.0155"ID X 1/16"OD 360 μm ODシリカチューブ用)と0.027"ID X 1/16"OD 670 μm ODシリカチューブを使用して15接続を設定し、スーパーフラレンスナットPEEK 1/4-28フラットボトム1/16"ODと超大相場フェルレ テフゼル(ETFE)、1/4-28フラットボトム、1/16"OD。製造元のプロトコルに従って接続を構築します (図 1)。
- 500 μL シリンジ 1 個に小さな円筒形のマグネットを6個入れる。このシリンジに、別の500 μLシリンジと2本の5 mLシリンジをバッファーで充填し、空気を取り除く。図2Aに示すように、シリンジポンプ上の位置。
注意:5 mLのシリンジは500μLのシリンジより大きいので、すべてのシリンジを同時に締めるスペーサーが必要です(図2B)。 - モーターが失速したときにセルシリンジが約50μL残るように、シリンジポンプストッパーを締めます。これは磁気スターラーのための余地を残します。(図 2C-D)
注意:注射器ポンプが磁石に圧力をかけると、注射器が詰まり、注射器が破損する可能性があります。 - Luer アダプターを使用して、手動バルブを各シリンジに接続します。図3に示すようにシリカチューブを組み立てます。
メモ:セル+ H2O2を使用して、十字を通って反対側まで行を通します。その後、450 μm ID シリカチューブに挿入します。5 mL シリンジ内のシースバッファーは、細胞およびH2 O2よりも速い速度で2流れます。両側のシースバッファーを使用すると、細胞は、照射のための単一のラインに流体力学的に集中されます。 - レーザーの横の位置流れシステム。ライターを使用して、450 μm ID チューブのシリカコーティングを焼き払い、レーザー照射用の窓を作ります。
- 6つの磁石を含むセルシリンジの上に磁気攪拌機を置きます。
- シリンジポンプを492.4 μL/minに設定し、最終流量1,083.3 μL/minをシステム内のフローバッファに3回設定して、システムをフラッシュし、漏れがないかテストします。
- 凸レンズを使用して、エキシマレーザーをシリカチューブに焦点を当てます。焦点を合わせると、シリカチューブの後ろに小さな紙を置いて照射窓をテストし、レーザーをオンにします。照射から焼けた領域を測定します。照射窓と流量を使用して必要なレーザー周波数を計算し、ゼロの除外分を得ます。
注: IC-FPOP 実験で推奨されるレーザーエネルギーは 120 mJ 以上です。照射窓が2.58mm、流量が1083.3 μL/minの除外分率0を取得するには、周波数を44にする必要があります。照射窓、流量、排除分がわかっている場合にレーザー周波数を計算するために必要な式を以下に示します。
ここで、wはnLの体積、xはμmのレーザースポット幅、yはμmのレーザー・スポットID、vはμLの総体積、bは除外分数、aはμL/minの流量、fはHzの周波数である。
2. クエンチとH2O2を作る
- 100 mM N-tert-ブチルアルファフェニルニトロン(PBN)と100 mM N,N'-ジメチルチオウラ(DMTU)を含むクエンチを作ります。アリコート11 mLの各サンプルのクエンチを50 mL円錐管に入れ。
- 希釈H2O2〜200mM.22各サンプルは、500 μL の H 2 O2を必要とします。
注:クエンチは前日に行われ、光から保護された一晩4°Cで保管することができます。H2O2は実験の日に新鮮にする必要があります。2
3. セルを収集する
- T175フラスコの細胞を約70~90%の合流まで成長させます。
- メディアを取り外し、バッファですすいします。
注:使用する典型的なバッファーは、セル培養グレードのDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)またはハンクのバランス塩溶液(HBSS)です。 - トリプシンEDTAまたはスクレーパーを使用してセルを取り外します。
- 一度脱離したバッファの10 mLで再中断し、セルをカウントします。
- スピンダウンし、バッファーとトリプシン-EDTAを取り外し、再中断して2 x 106セル/mLを作ります。
- アリコート1サンプル当たりの細胞の500μL。
注:各条件に対して、最低3つのレーザーサンプルと3つのレーザーコントロールを作ってください。
4. IC-FPOPの実行
- 2つの5 mLシリンジをバッファー、磁石を含む500 μLシリンジをセルで充填し、最後の500 μLシリンジをH2O2で充填します。磁気スターラーをオンにします。
- 220 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)のスパイクをクエンチの1アリコートに、穏やかに混合し、照射されたサンプルを収集するためにフローシステムの後ろに置きます。DMSOの添加は、内因性メチオニンスルホキシド還元剤を阻害します.
- レーザーをオンにし、7 s待ってから、フローシステムをオンにします。
- サンプルの流れが終わったら、レーザーをオフにして、集めたサンプルと軽くクエンチを混ぜます。ステップ 4.5 および 4.6 の間に、これを横に置きます。
- セルが懸濁しているバッファーで 4 つのシリンジをすべて満たし、フロー システムを通してフローします。
- システムのフラッシュが完了したら、手順 4.1 と 4.2 を繰り返します。照射せずに流れを開始します。これは、細胞内のバックグラウンド酸化を考慮したレーザー制御ではありません。
- 次のサンプルが実行されている間、前のサンプルを450-800 x gで5分間回転させ、溶媒を取り除き、放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファーのような細胞溶解バッファーの100 μLで再懸濁します。
- サンプルをマイクロ遠心チューブに移し、液体窒素でフリーズします。
- すべてのサンプルの実行が終了したら、フローシステムを分解してクリーニングします。使用したシリカチューブを捨て、50%の水で1時間超音波処理することによって他のすべての接続をきれいにする:50%メタノール。メーカーの指示に従って注射器を清掃してください。
5. ダイジェスト
- 細胞全体のライセートを消化します。サンプルを解凍し、95 °Cで10分間加熱します。
- 加熱後、氷の上で15分間、ライセートを冷やします。
- DNAとRNAを消化するためにヌクレアーゼを25単位加え、室内温帯で15分間インキュベートします。
- 4°Cで10分間16,000 x gの卓上遠心分離機を使用してサンプルをスピンします。
- 上清を集め、きれいなマイクロ遠心チューブに移します。
- タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を確認します。
- 20~100 μgのサンプルをクリーンマイクロ遠心チューブに移し、100 μLにします。
- 20 mM ジチオトレオトール (DTT) を 50 °Cで 45 分間低減します。
- 室温でサンプルを15分間冷却します。
- アルキル酸と20 mMヨードアセトアセトアミド(IAA)を室温で20分間、光から保護。
- 1:4比タンパク質で予冷アセトンを加える: アセトン.サンプルを混合し、一晩で -20 °Cに置きます。
- 翌朝、4°Cで10分間16,000 x gでサンプルを回す。
- 上清を取り除き、90%前チルドアセトンの50μLを加えます。サンプルを混合し、4 °Cで5分間16,000 x gでスピンダウンします。
- アセトンを取り除き、マイクロ遠心分離機のキャップを上を覆う糸くずフリーワイプで開いたままにしてサンプルを乾燥させます。サンプルを乾燥させた後、10 mM TrisバッファーpH8でタンパク質ペレットを再懸濁する。
- トリプシン20 μgを40 μLの10 mM TrisバッファpH 8で再懸濁します。トリプシンを2μg加えます(質量:質量比1トリプシン:50サンプル)。一晩で37°Cでサンプルをインキュベートする。
- 翌朝、ペプチドアッセイを用いてペプチド濃度を確認する。ペプチドアッセイ用にサンプルを除去した後、サンプルにギ酸を加えてトリプシン消化をクエンチします(最終濃度は5%のギ酸です)。
- 最終的なペプチド濃度が決定されたら、各サンプルの10 μgをクリーンマイクロ遠心分離チューブに移します。これにより、各サンプルの同じ量が分析されます。真空遠心分離機を使用してサンプルを乾燥させます。乾燥すると、20 μLの質量分析グレード 0.1% ギ酸で再懸濁します。オートサンプラーバイアルにサンプルを転送します。
6. 液体クロマトグラフィータンデム質量分析
- FPOPの改変を局所化するために、LC-MS/MS分析を用いて消化された細胞のライセートを分析する。
- 水中(A)で0.1%のギ酸、アセトニトリル(B)で0.1%のギ酸の移動相を使用してください。
- サンプルを180 μm x 20 mm C18 (5 μm および 100 Å) のトラッピングカラムに 0.5 μg 積み込み、サンプルを 99%(A)、1%(B)で 15 分間洗浄します。
- 75 μm x 30 cm C18 (5 μm および 125 Å) 分析カラムを使用して、1 分の 3% (B) から 0.300 μL/min の流量で分析分離法を実行し、1 ~ 2 分から 10% (B) までランプします。次のランプは2-100分から45%(B)、100-110分から100%(B)にし、110-115分から100%(B)に保持してカラムを清掃します。
- M/z スキャン範囲が 375 ~ 1500 の MS 取得方法の解像度が 60,000 に設定されるようにします。自動ゲイン制御 (AGC) ターゲットを 5.0 x 105に設定し、最大射出時間は 50 ミリ秒に設定します。
- MS取得中に、1.2 m/zの分離ウィンドウとサイクル時間が4秒のデータ依存取得(DDA)を介して単離する電荷状態2~6の前駆イオンを選択し、HCD活性化に対して強度しきい値5.0 x 104のペプチドを選択し、正規化エネルギーを32%に設定します。60 sの1 MS/MS取得後にペプチドを除外し、AGCターゲットを5.0 x 104、最大射出時間を35 msで15,000に設定します。
7. データ処理
- 関連するタンパク質データベースと関連する消化酵素に対して利用可能なタンパク質分析ソフトウェア上のRAWファイルを検索します。ここでは、スイスプロトホモサピエンスデータベースとトリプシンを使用します。
- 350 ~ 5,000 Da の範囲で検索し、質量許容値を 10 ppm にする前駆体質量を設定します。6〜144残基の間のペプチド長を有する切断部位を最大1個見逃すことができます。これらの制限により、データベースの検索が容易になります。
- 動的修飾として17アミノ酸からのFPOP修飾と静的修飾としてカルバミドメチル(+57.021)を有するフラグメントイオンの最大質量許容範囲を0.02Daに設定します(図4はFPOP修飾を検出するために使用されるタンパク質分析ワークフローの一例です)。
注:セリンとスレオニンのFPOPの変更は、ヒドロキシルラジカルとの反応性が低いため、検索には含まれていません。 - 誤検出率が 1% と 5% のおとりデータベースで検索します。
- ファイルの検索が終了すると、FPOP の変更の範囲が計算されます。Open Proteome Discoverer 2.2、エクスポートシーケンス、変更場所、タンパク質の受動、スペクトルファイル、前駆体の豊富さ、保持時間情報。数式 4 から修正の範囲を計算します。
EIC領域改変は、ヒドロキシルラジカル修飾を有する特定のペプチドのクロマトグラフィー領域である。EIC領域は、その特定のペプチドの改変領域と未修飾領域の両方のクロマトグラフィー領域です。酸化の程度は、照射の有無にかかわらずサンプルで計算されます。サンプルの省略照射(対照)は、H2 O2曝露の前後に細胞内に存在する可能性のある任意のバックグラウンド酸化2を占める。コントロールは、FPOP固有の変更を分離するのに役立つ照射サンプルから差し引かれます。
Representative Results
IC-FPOPは、生細胞におけるタンパク質相互作用を問い合うフットプリント法である。IC-FPOPフローシステムにおいて、H2O2露2光時間はおよそ3sに制限され、細胞に有害な影響を及ぼすことなく高いH2O2濃度を保証する。2フローシステムはまた、2つのシースバッファーの流れを組み込み、流体力学的に細胞をチューブの中心に集着し、均一に照射される単一のフローの細胞を生成する(図5)9。9直交YZ積層画像の蛍光画像(図5A)は、シースバッファー(FITCフルオロフォアを含む)を細胞溶液(TMRM蛍光色素を含む)から明確に分離することを示す。この分離を強調するために、図5BBおよび図5Cは、シースバッファー溶液または細胞溶液のいずれかの3次元平均ヒートマップを示し、2つの溶液の混合を最小限にすることを示す。
単一細胞流動システムの使用により、酸化的に改変されたタンパク質の数が13倍に増加する(図6A)9。Aこの方法では、多くの細胞区画のタンパク質は、膜タンパク質、細胞質タンパク質、および核内のタンパク質が最も普及している88,99で標識される。タンパク質が無傷の細胞内で確実に改変されるように、CellROX処理細胞の蛍光画像を、H2O2処理および照射後に行った(2図6B)8。8標識プロセス全体の細胞の安定性は、ネイティブの細胞環境でタンパク質をプローブするIC-FPOPの有効性をさらに確認します。タンデム質量分析を使用することにより、これらの修飾は、タンパク質上の特定のアミノ酸に局在させることができます。図7は、抽出されたイオンクロマトグラムとともにIC-FPOP中に起こる改変を表しています。抽出されたイオンクロマトグラムで観察されたシフトは、改変ペプチド中の酸化メチオニンによって引き起こされる疎水性の変化に変換されます。
FPOP修飾が細胞内でのプローブ溶媒の入手可能性を検査するために、インビトロフットプリント試験とアクチンの各種結晶構造の両方と比較したインセル標識アクチン(図8)8。8図8に示されるインセル標識アクチンは、Guan et10(図8B)によるインビトロ研究からの酸化の同等の程度を示し、終点アクチンは、インセルおよびインビトロ研究の両方に対して同様の溶媒アクセシビリティを有する。IC-FPOPがアクチンの溶媒アクセス性を調査した更なる確認のために、FPOP修飾の程度を、2つのアクチン結晶構造から計算された標識残基の溶媒アクセス性と比較した(図8C)。この相関は、IC-FPOPが単量体タンパク質の溶媒アクセス性を十分にプローブすることを示す。
図1:feruleを正しく構築する方法(A)フェルール、シリカチューブ、スリーブを一緒に入れ、締め付けします。(B)すべてのコンポーネントを締めます。(C)最終製品は、袖に締め付けられていたフェルールを生成します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:IC-FPOPフローシステムの設定(A) レーザーの横に配置された完全に組み立てられたIC-FPOPフローシステムの画像。(B) 500 μLシリンジの外径を大きくして、すべてのシリンジを一緒に締め付けるのに必要なスペーサーの例。(C)磁気スターラーに必要なスペースを示す代表的な写真。(D)ストッパーは、注射器を壊すことなく、シリンジポンプを失速させる必要があります。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3 IC-FPOP用に開発されたフローシステムの概略図青い線は450 μm IDおよび670 μm ODのシリカ管を表し、赤い線は150 μm IDおよび360 μm ODを有し、オレンジラインは75 μm IDおよび360 μm ODを有する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:FPOPの変化を検出するために使用されるタンパク質分析ソフトウェア。各ノードで検索された対応する変更を含む一般的なワークフロー。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:単一細胞流動システムは、流体力学的に細胞を単一の流れに集中させる。(A)シースバッファー(緑色、FITCフルオロフォア)に囲まれた細胞検体(赤、TMRMフルオロフォア)の3D集光を示す直交YZスタック。シースバッファーの三次元平均強度ヒートマップ(B)と細胞分析物(C)。低い強度は青で、最も高い赤(B-C)です。この図はRinasらから変更されています9この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:IC-FPOPフローシステムの利用は、インチに含まれるFPOP修飾タンパク質を大幅に増加させます。(A) 流動系の有無にかかわらず同定された酸化タンパク質の比較。フローシステムは1391個のFPOP改変タンパク質を同定し、58個の改変タンパク質が重複するフローシステムを持たないタンパク質はわずか105個同定された。この図は、IC-FPOPが酸化標識後9も細胞がそのまま残っているのを示した後のCellROX処理細胞の蛍光イメージングをRinasら(B)から改変した。細胞を665nmでオリンパスフルオビューFV1000 MPEマルチフォトン顕微鏡を用いて画像化した。画像は単一のスライスです。この図はEspinoらから変更されています8この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: IC-FPOP 中に発生するタンデム MS/MS スペクトルの例(A)非修飾ペプチドの生成イオン(MS/MS)スペクトル、および(B)酸化(B)は、そのペプチドに見られる残基M8に検出された。代表的なEICである(C)非修飾ペプチドおよび(D)変性ペプチド。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:IC-FPOPは、タンパク質の溶媒アクセス性を調するのに有効である。(A) アクチンから9個の酸化的に修飾されたペプチドに対する修飾の程度。値は、平均プラスとマイナスの標準偏差(n = 3)として示されます。(B)Guan et al. al. al. al. al. からの放射光度合致10によりインビトロで酸化されたアクチンペプチドの改変(C)狭い(三角形、破線傾向線)およびオープン(円、実線傾向線)アクチンの状態のSASAとの残留FPOP修飾の相関。Bこの図はEspinoらから変更されています8この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
タンパク質構造とタンパクリガンド複合体を細胞全体または細胞ライセートでプロテオーム全体で研究するために、質量分析法をベースにした技術がいくつか開発されています。これらの技術には、酸化速度(SPROX)、熱プロテオームプロファイリング(TPP)、化学架橋(XL-MS)、ヒドロキシルラジカルプロテインフットプリント(HRPF)からのタンパク質の安定性に限定されないが、これらに限定されない。各技術は、広範囲にレビューされている互いに比べてユニークな制限と利点を持っています12.これらの方法のそれぞれは、タンパク質構造を解明し、最終的に複雑な細胞環境内で機能するために、プロテオーム広い構造生物学に使用されてきました。IC-FPOPは、アミノ酸の露出した側鎖の溶媒を酸化的に修飾するためにヒドロキシルラジカルを利用するHRPF技術であり、生存細胞13内のタンパク質構造およびタンパク質リガンド相互作用をプローブする。IC-FPOPは、フェントン化学を使用して分タイムスケール14でラジカルを生成した生細胞における初期HRPFの改善である。本研究では、バッファーのpHまたはイオン強度の低下に応答して、一体性膜タンパク質の構造変化が、タンパク質全体にわたって良好な酸化カバレッジを有する特徴付けに成功した。フェントン化学と比較して、IC-FPOPはマイクロ秒のタイムスケールでタンパク質を修飾し、ネイティブタンパク質の立体構造を研究することを可能にする、はるかに速いです。
IC-FPOPの重要なテストは、H2 O2への曝露後の細胞の生存率を確認することである。40cmの混合ラインを用いて、細胞は照射前におよそ3sのためにH2O2でインキュベートされる。2この時間は、このシリカチューブの長さを変更することで調整することができる。細胞生存率をテストするためにトリパンブルーを使用することは、H2O2インキュベーション後に細胞の完全性が持続することを示しているが、細胞はH2O2と相互作用するストレス効果シグナル伝達経路下にある可能性がある可能性があることに注目に値する。2幸いなことに、短いインキュベーション時間は、存在するタンパク質がH2O2によって誘導されない自信2を与えるタンパク質合成よりも速い。
次の重要なステップは、フローシステムの適切な組み立てを確認することです。一度組み立てたら、目的のバッファでシステムをフラッシュした後にリークがないことを確認してください。漏水が存在する場合は、シリカチューブが適切に切断され、フェルールに対してフラッシュされ、一度締め付けた適切なシールを作るようにしてください。部品はすべて手締めなので、工具は必要ありません。IC-FPOP実験のたびに、細胞シリンジ内の磁気スターラーが動き続けることを確認してください。この小さな攪拌は、シリンジの底に落ち着くが、細胞を剪断するのに十分なほど過酷ではない細胞の数を制限します。1回の実行後、シリンジに約50μLの細胞が残っています。次の実験に持ち越す細胞の数を制限するために、常にこれをすすいでのステップで希釈してください。複数の細胞治療を比較する場合は、新鮮な細胞注射器を使用することをお勧めします。また、検査対象のセルに適したバッファを選択することも重要です。いくつかの緩衝液は、タンパク質に対するより少ない修飾につながるヒドロキシルラジカルをクエンチする。Xuら. いくつかの一般的に使用されるバッファーは、ヒドロキシルラジカル寿命11を減少することを示しています。DPBSおよびHBSSはIC-FPOPの実験に使用される共通の緩衝剤である。
IC-FPOPに続いて、必要なパラメータに基づいて消化プロトコルを最適化します。FPOP は不可逆的な共有変更を生成するため、ラベリング カバレッジを失うことなく、徹底的な消化とクリーンアップに十分な時間があります。タンデム質量分析のために均一なペプチド濃度がロードされるように、常にタンパク質濃度をテストし、正規化します。最後に、免疫沈降はIC-FPOPと組み合わせて行うことができないことを念頭に置いて下さる。FPOP修飾が相互作用の領域を標的とする場合、抗体の親和性は低下する。FPOP修飾の同定を増加させるために、2D-クロマトグラフィー分離工程は、検出された酸化ペプチドの数を3倍以上に示した15。
FPOP実験の課題は、発生する可能性のある酸化産物による複雑なレベルのデータ分析です。これは、細胞内またはインビトロの両方に当てはまりますが、細胞のライセートを分析する複雑さが増すとともに大幅に増加します。IC-FPOPをさらに最適化すると、より高い修飾カバレッジを持つより多くのタンパク質が生じ、分析がより困難になります。単一の IC-FPOP 実験から生成されるデータのせん断量は、手動検証の使用を制限し、研究者はソフトウェアに大きく依存します。このため、Rinasらはプロテオーム発見者(PD)16を用いてHRPFの定量戦略を開発した。この方法では、スプレッドシート内の定量的プラットフォームと組み合わせたPD上のマルチサーチノードワークフローを利用します。IC-FPOPプラットフォームのさらなる改善は、再現性と定量精度の向上とともに、FPOP改変を伴う同定されたペプチドの数を増やすために進行中です。
Disclosures
リサ・ジョーンズは、セル特許のフローアセンブリの発明者です(出版番号:20180079998)。
Acknowledgments
この作品は、LMJのNSFキャリアアワード(MCB1701692)によって支えられてきました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | any brand is sufficient |
| 500 µL SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ACQUITY UPLC M-Class System | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | 04A-4299 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| EX350 excimer laser | GAM Laser | EX350 excimer laser | |
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Science | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 210 syringe pump | KD Scientific | 788212 | Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Science | P-618L | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N'-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 88702 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32" | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP150350 | Polymicro Technologies | 1068150024 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 µm, Outer Diameter 670 µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150025 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Science | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | PI89900 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-182 | |
| Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-178 | |
| UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses | THORLABS | LA4052 | |
| V&P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000 | V&P Scientific, Inc. | VP724F | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Science | UH-436 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
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- Zhu, Y., et al. Elucidating in vivo structural dynamics in integral membrane protein by hydroxyl radical footprinting. Molecular & Cellular Proteomic. 8 (8), 1999-2010 (1999).
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- Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).
