Summary
Här kännetecknar vi proteinstruktur och interaktionsplatser i levande celler med hjälp av en proteinavtrycksteknik som kallas snabb fotokemisk oxidation av proteiner (IC-FPOP).
Abstract
Snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP) är en hydroxyl radikal protein avtryckmetod som används för att karakterisera proteinstruktur och interaktioner. FPOP använder en 248 nm excimer laser för att photolyze väteperoxid producerar hydroxyl radikaler. Dessa radikaler modifierar oxidativt lösningsmedelexponerade sidokedjor av 19 av de 20 aminosyrorna. Nyligen har denna metod använts i levande celler (IC-FPOP) för att studera proteininteraktioner i sin inhemska miljö. Studien av proteiner i celler står för intermolekylär trängsel och olika proteininteraktioner som störs för in vitro-studier. Ett anpassat system med en cellflöde har utformats för att minska cellaggregering och igensättning under IC-FPOP. Detta flödessystem fokuserar cellerna förbi excimer laser individuellt, vilket säkerställer konsekvent bestrålning. Genom att jämföra omfattningen av oxidation som produceras från FPOP med proteinets lösningsmedelstillgänglighet beräknad från en kristallstruktur kan IC-FPOP noggrant sondera de lösningsmedelstillgängliga sidokedjorna av proteiner.
Introduction
Hydroxyl radikala protein avtryck (HRPF) är en metod som sonderar lösningsmedeltillgängligheten av ett protein genom kovalenta modifieringar som framställs av hydroxylradikaler. När proteinstruktur eller proteininteraktioner förändras kommer det att förändra lösningsmedelsexponeringen av aminosyror, vilket förändrar omfattningen av modifieringen av rester. Med HRPF harproteininteraktionerna 1,,2,,3 och proteinkonformationella förändringar4,,5,6 framgångsrikt förhörts in vitro. Det finns flera metoder som genererar hydroxylradikaler för HRPF-experiment, varav en är snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP). FPOP utvecklades av Hambly och Gross under 2005 och använder en 248 nm excimer laser för att producera hydroxyl radikaler genom fotolys av väteperoxid (H2O2)7.
Nyligen förlängde Espino et al. användningen av FPOP för att sondera proteinstrukturen i levande celler, en metod som kallas i cell FPOP (IC-FPOP)8. I motsats till in vitro-studier, studera proteiner i celler står för molekylär trängsel tillsammans med olika protein interaktioner som potentiellt kan påverka strukturen. Dessutom utgör det fördelen med att ge en ögonblicksbild av den fullständiga proteom som potentiellt ger strukturell information om många system på en gång för att utföra proteom bred strukturbiologi. Dessutom är denna teknik idealisk för proteiner som är svåra att studera in vitro, som membranproteiner.
Inledande studier av IC-FPOP framgångsrikt sonderade 105 proteiner som sträcker sig i protein överflöd och cellulär lokalisering. För att förbättra IC-FPOP-metoden utvecklade Rinas et al. ett mikroflödessystem för encellflöde9. Förbättringen av det ursprungliga flödessystemet begränsar cellaggregering och ökar den tillgängliga H2O2 som är tillgänglig för bestrålning. I det ursprungliga flödessystemet resulterade celler som klumpar i kiselslangen i träskor och ojämn bestrålning. Införlivandet av två strömmar av en skida buffert hydrodynamiskt fokuserar cellerna, så att de kan flöda individuellt förbi lasern. Införlivandet av en separat spruta för H2O2 möjliggör mer kontrollerad och valsabel exponeringstid som möjliggör högre H2O2-koncentrationer utan negativa effekter. Också begränsa inkubationstiden begränsar fördelningen av H2O2 genom endogen katalas. Genom att införliva detta nya flödessystem ökade det upptäckta antalet proteiner med en FPOP-modifiering 13 gånger, vilket utökade kapaciteten hos denna metod för att undersöka en mängd proteiner i levande celler. I detta protokoll beskrivs ett allmänt IC-FPOP-experiment med fokus på sammansättningen av IC-FPOP-flödessystemet.
Protocol
1. Ställ in IC-FPOP flödessystem
- För att börja monteringen av flödessystemet, skär den smält kiseldioxid med en klyvning sten till storlek. IC-FPOP-flödessystemet kräver fyra 12 cm och en 17 cm smält kiseldioxid med en innerdiameter (ID) på 450 μm och ytterdiameter (OD) på 670 μm, två 24 cm och en 40 cm med en ID på 75 μm och en OD på 360 μm , och slutligen två 57 cm med ett ID på 150 μm och en OD på 360 μm.
OBS: När du skär kiseldioxidslangen, skrapa försiktigt bort polyimidbeläggningen och böj för att få det renaste snittet. Kontrollera att det är ett rakt snitt (detta är nödvändigt för att säkerställa inga blockeringar eller läckor form). - Ställ in 15 anslutningar med nanotäta hylsor (0,0155" ID X 1/16" OD för 360 μm OD kiseldioxidslang och 0,027" ID X 1/16" OD för 670 μm OD kiseldioxidslang) med superflangeless mutter PEEK 1/4-28 flat-bottom för 1/16" OD och super flangeless ferrule w/SST ring, ring Tefzel (ETFE), 1/4-28 flat-bottom, för 1/16" OD. Konstruera anslutningar enligt tillverkarens protokoll (figur 1).
- Placera 6 små cylindriska magneter i en 500 μL spruta. Fyll sprutan tillsammans med ytterligare 500 μL spruta och två 5 ml sprutor med buffert och ta bort luft. Placera på sprutpumpen enligt figur 2A.
OBS: 5 ml sprutorna är större än de 500 μL sprutorna, så en distans behövs för att dra åt alla sprutor samtidigt på plats(figur 2B). - Dra åt sprutorpumpproppen så att cellsprutan har ungefär 50 μL kvar när motorn stannar. Detta kommer att lämna utrymme för magnetomrörare. (Figur2C-D).
VARNING: Om sprutpumpen sätter press på magneterna kommer de att störa sprutan och kan leda till att sprutan går sönder. - Anslut en lueradapter med en Luer-adapter till varje spruta. Montera kiselslangen enligt figur 3.
OBS: Trä linjen med cellerna + H2O2 hela vägen genom korset till andra sidan. Sätt sedan in den i 450 μm ID kiseldioxidslangen. Hylsbuffertarna i 5 ml-sprutan kommer att flöda snabbare än cellerna och H2O2. Med hylsbuffertarna på båda sidor kommer cellerna att hydrodynamiskt fokuseras till en enda linje för bestrålning. - Placera flödessystemet bredvid laser. Använd en tändare, bränn bort kiselbeläggningen på 450 μm ID-slangen för att göra ett fönster för laserbestrålning.
- Placera en magnetisk omrörare ovanför cellsprutan som innehåller de sex magneterna.
- Ställ in sprutpumpen på 492,4 μL/min för ett slutligt flöde på 1 083,3 μL/min. Flödesbuffert genom systemet tre gånger för att spola systemet och testa eventuella läckor.
- Fokusera excimerlasern på kiseldioxidslangen med hjälp av en konvex lins. När fokuserad, testa bestrålningsfönstret genom att placera ett litet papper bakom kiselslangen och slå på lasern. Mät regionen som bränns från bestrålningen. Beräkna den nödvändiga laserfrekvensen med hjälp av bestrålningsfönstret och flödeshastigheten för att få en uteslutningsfraktion på noll.
OBS: Den rekommenderade laserenergin för ett IC-FPOP-experiment är ≥120 mJ. För att få en uteslutningsfraktion på 0 med ett bestrålningsfönster på 2,58 mm och ett flöde på 1083,3 μL/min måste frekvensen vara 44. Nedan visas de ekvationer som behövs för att beräkna laserfrekvensen om bestrålningsfönstret, flödeshastigheten och uteslutningsfraktionen är kända.
där w är volymen i nL, x är laserspotbredden i mm, y är kiselslangens ID i μm, v är den totala volymen i μL, b är undantagsfraktionen, a är flödeshastigheten i μL/min och f är frekvensen i Hz.
2. Gör släckning och H2O2
- Gör släckning som innehåller 100 mM N-tert-Butyl-alpha-fenylnitrone (PBN) och 100 mM N, N'-dimetyltiourea (DMTU). Aliquot 11 ml släckning för varje prov i ett 50 mL koniskt rör.
- Späd H2O2 till 200 mM. Varje prov kräver 500 μL H2O2.
OBS: Släckningen kan göras dagen innan och förvaras vid 4 °C över natten, skyddad från ljus. H2O2 bör göras färska experimentdagen.
3. Samla celler
- Odla celler i en T175-kolv till ca 70-90% samfluens.
- Ta bort media och skölj med buffert.
OBS: Typiska buffertar att använda är cellkultur kvalitet Dulbecco s fosfat-buffrad koksalt (DPBS) eller Hanks balanserade saltlösning (HBSS). - Lossa celler med antingen trypsin-EDTA eller med en skrapa.
- När den har lossnat återupphängs i 10 ml buffert och räkna cellerna.
- Snurra nedåt, ta bort bufferten och trypsin-EDTA och återsuspendera för att göra 2 x 106 celler/ml.
- Aliquot 500 μL av cellerna per prov.
OBS: För varje tillstånd, gör minst 3 laserprover och 3 inga laserkontroller.
4. Utföra IC-FPOP
- Fyll de två 5 ml sprutorna med buffert, den 500 μL-sprutan som innehåller magneterna med cellerna och den sista 500 μL-sprutan med H2O2. Sätt på magnetomröraren.
- Spika i 220 μL dimetylsulfoxid (DMSO) till en alikvot av släckning, blanda försiktigt och placera bakom flödessystemet för att samla in bestrålade prover. Tillsatsen av DMSO kommer att hämma endogenmesenmetionin sulfoxid reduktas.
- Slå på laser, vänta 7 s och slå sedan på flödessystemet.
- När provet har flödat stänger du av lasern och blanda försiktigt släckningen med det insamlade provet. Placera detta åt sidan under steg 4.5 och 4.6.
- Fyll alla fyra sprutorna med bufferten cellerna är upphängda i och flöde den genom flödessystemet.
- När systemet har spolats klart upprepar du steg 4.1 och 4.2. Starta flödet utan bestrålning. Detta är ingen laserkontroll för att ta hänsyn till bakgrundsoxidation i cellerna.
- Medan nästa prov körs, snurra ner det föregående provet vid 450-800 x g i 5 min, ta bort lösningsmedlet och återsuspendera i 100 μL av en celllysbuffert som buffert för radioimmunoprecipitationanalys (RIPA).
- Överför provet till ett mikrocentrifugrör och blixtfrys i flytande kväve.
- När alla prover har körts ur, ta isär flödessystemet för rengöring. Kasta den använda kiseldioxid slangen och rengör alla andra anslutningar genom ultraljudsbehandling för 1 h i 50% vatten: 50% metanol. Rengör sprutorna enligt tillverkarens anvisningar.
5. Sammanfattning
- Smält hela cellen lysate. Börja med att tina upp proverna och värm vid 95 °C i 10 min.
- Efter uppvärmning, kyl lylysningen på is i 15 min.
- Lägg till 25 enheter av nuclease att smälta DNA och RNA och inkubera på rummet tempererat i 15 min.
- Spinnprover med en centrifug med bordsskiva vid 16 000 x g i 10 min vid 4 °C.
- Samla supernatanten och överför den till ett rent mikrocentrifugrör.
- Kontrollera proteinkoncentrationen med hjälp av ett proteinanalyskit.
- Överför 20-100 μg prov till ett rent mikrocentrifugrör och för a-100 μL.
- Minska proverna med 20 mM dithiothreiotol (DTT) vid 50 °C i 45 min.
- Kyl proverna i rumstemperatur i 15 min.
- Alkyat med 20 mM iodoacetamide (IAA) vid rumstemperatur i 20 min skyddad från ljus.
- Tillsätt förkyld aceton vid ett 1:4-förhållandesprotein: aceton. Blanda prover och placera i -20 °C över natten.
- Nästa morgon, spin prover på 16.000 x g i 10 min vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och tillsätt 50 μL av 90% förkyld aceton. Blanda prover och snurra ner på 16 000 x g i 5 min vid 4 °C.
- Ta bort aceton och låt proverna torka genom att låta mikrocentrifugens lock öppnas med en luddfri torka som täcker toppen. Efter att proverna har torkat, återsuspend proteinpellet med 10 mM Tris buffert pH 8.
- Återsuspend 20 μg trypsin i 40 μL av 10 mM Tris buffert pH 8. Tillsätt 2 μg trypsin (massa: massförhållande på 1 trypsin: 50 prov). Inkubera prover vid 37 °C över natten.
- Nästa morgon kontrollera peptid koncentrationen med hjälp av en peptid analys. När provet har tagits bort för peptidanalysen, släck trypsinmatsmältningen genom att lägga till myrsyra till proverna (den slutliga koncentrationen är 5% myrsyra).
- När den slutliga peptidkoncentrationen har fastställts överför du 10 μg av varje prov till ett rent mikrocentrifugrör. Detta säkerställer att samma mängd av varje prov analyseras. Torka provet med hjälp av en vakuumcentrifug. När torkad återupphängning med 20 μL masspektrometri grad 0,1% myrsyra. Överför prover till autosampler-flaskor.
6. Flytande kromatografi-Tandem Mass Pektrometri
- För att lokalisera FPOP-ändringar analysera den smälta cellen lysate med LC-MS/MS-analys.
- Använd mobila faser av 0,1% myrsyra i vatten (A) och 0,1% myrsyra i acetonitril (B).
- Ladda 0,5 μg prov på en svällningskolonn på 180 μm x 20 mm C18 (5 μm och 100 Å) och tvätta provet med 99 % (A) och 1 % (B) i 15 min.
- Kör den analytiska separationsmetoden med en analyskolonn på 75 μm x 30 cm C18 (5 μm och 125 Å) med en analysavskiljandemetod med en flödeshastighet på 0,300 μL/min med början på 3 % (B) i en minut och sedan ramp till 10 % (B) från 1-2 min. Nästa ramp till 45% (B) från 2-100 min sedan 100% (B) från 100-110 min. Rengör kolonnen genom att hålla på 100% (B) från 110-115 min. Rekondition kolonnen genom att rampa ner till 3% (B) från 115-116 min och håll vid 3% (B) från 116-130 min.
- Ange ms-förvärvsmetoden så att den har en upplösning på 60 000 med ett m/z-skanningsintervall på 375-1500. Ställ in agc-målet (Automatic Gain Control) till 5,0 x 105 med en maximal injektionstid på 50 ms.
- Under MS förvärvet, välj prekursorjoner med laddningstillstånd 2-6 för isolering via databeroende förvärv (DDA) med en isoleringsruta på 1,2 m/ z och en cykeltid på 4 s. Välj peptider med en intensitetströskel på 5,0 x 104 för HCD-aktivering med en normaliserad energi inställd på 32%. Exkludera peptider efter 1 MS/MS förvärv för 60 s. Ställ in MS/MS-upplösningen till 15 000 med ett AGC-mål på 5,0 x 104 och en maximal injektionstid på 35 ms.
7. Databehandling
- Sök RAW-filer på en tillgänglig programvara proteinanalys mot en relevant proteindatabas och relevant smälta enzym. Här använder du databasen Swiss-Prot Homo Sapiens och trypsin.
- Ställ in prekursormassan för att söka mellan 350 till 5 000 Da och en masstolerans på 10 ppm. Det kan finnas högst 1 missad klyvning snett med en peptidlängd mellan 6 till 144 rester. Dessa begränsningar underlättar databassökning.
- Ställ in fragmentjoner maximal massa tolerans till 0,02 Da med carbamidomethyl (+57.021) som en statisk modifiering och alla FPOP ändringar från 17 aminosyror som en dynamisk modifiering(Figur 4 är ett exempel på proteinanalys arbetsflöde som används för att upptäcka FPOP ändringar).
OBS: FPOP ändringar på serin och treonin ingår inte i sökningen på grund av deras lägre reaktivitet med hydroxyl radikaler. - Sök med en lockbetedatabas med en falsk identifieringshastighet på 1 % och 5 %.
- När filerna är klara med att söka beräknar omfattningen av FPOP-modifiering. Öppna Proteomdiscoverer 2.2, exportsekvens, modifieringsplatser, proteinanslutning, spektrumfil, prekursorförekomst och information om lagringstid. Beräkna omfattningen av modifiering från ekvation 4:
EIC-området som modifierats är det kromatografiska området för en specifik peptid med en hydroxylradikal modifiering. EIC-området är det totala kromatografiska området för både modifierade och oförändrade områden i den specifika peptiden. Oxidationsomfattningen beräknas i proverna med och utan bestrålning. Provet som utelämnar bestrålning (kontroll) står för alla bakgrundsoxidationer som kunde ha förekommit i cellerna före och efter H2O2-exponering. Kontrollerna subtraheras från bestrålningsproverna för att isolera FPOP-specifika modifieringar.
Representative Results
IC-FPOP är en fotavtrycksmetod för att förhöra proteininteraktioner i levande celler. I IC-FPOP-flödessystemet är Exponeringstiden H2O2 begränsad till ungefär 3 s, vilket motiverar högre H2O2-koncentrationer utan skadliga konsekvenser för cellerna. Flödessystemet innehåller också två strömmar av skidbuffert, som hydrodynamiskt fokuserar cellerna till mitten av slangen producerar ett enda flöde av celler som skall vara enhetligt bestrålade (figur 5)9. Fluorescensavbildning av ortogonala YZ staplade bilder(figur 5A) visar en tydlig separation av hylsbufferten (som innehåller en FITC-fluorofobfor) från celllösningen (som innehåller en TMRM-fluorosofi). För att framhäva denna separation visar figur 5B och figur 5C tredimensionella genomsnittliga värmekartor över antingen hylsbuffertlösningen eller celllösningen, vilket illustrerar minimal blandning av de två lösningarna.
Användningen av systemet med encellflöde ökar antalet oxidativt modifierade proteiner med 13 gånger (figur 6A)9. I denna metod, proteiner i många av de cellulära facken är märkta med membran proteiner, cytoplasmatiska proteiner, och proteiner i kärnan är den vanligaste8,9. För att säkerställa att proteiner modifierades i intakta celler utfördes fluorescerande bilder av CellROX-behandlade celler efter H2O2-behandling och bestrålning (figur 6B)8. Stabiliteten hos cellerna under hela märkningsprocessen bekräftar ytterligare effekten av IC-FPOP att sondera proteiner i sin inhemska cellulära miljö. Genom att använda tandem-masspektrometri, dessa ändringar kan lokaliseras till specifika aminosyror på ett protein. Figur 7 representerar en ändring som sker under IC-FPOP tillsammans med dess extraherade jonkrotogram. Den förändring som observerats i det extraherade jonkrotogrammet översätts till förändringen i hydrofobicitet orsakad av den oxiderade metionin i den modifierade peptiden.
För att testa om FPOP modifieringar sond lösningsmedel tillgänglighet inuti cellerna, i cell märkt aktin jämfördes med både en in vitro fotavtryck studie och olika kristall strukturer av aktin (figur 8)8. Den incellade aktin en bild är representerad i figur 8A visar jämförbara oxidationsgrad från in vitro-studien av Guan et al.10 (figur 8B),avslutande aktin har liknande lösningsmedelstillgänglighet för både in-cell- och in vitro-studier. För att ytterligare bekräfta att IC-FPOP undersökte upp lösningsmedelstillgängligheten för aktin jämfördes fpopmodifieringarnas omfattning med hjälp av de märkta restprodukternas tillgänglighet som beräknats från två aktinkristallkonstruktioner (figur 8C). Denna korrelation visar att IC-FPOP sonderlösningstillgängligheten av det monomeriska proteinet väl.
Bild 1: Hur man korrekt konstruera ferules. (A)Placera ferrules, kiseldioxidslangar och hylsa tillsammans innan du drar åt. (B)Dra åt alla komponenter tillsammans. (C)Slutprodukten kommer att producera en ferule som har dragits åt på hylsan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Ställa in IC-FPOP-flödessystem. (A)Bild av ett helt monterat IC-FPOP-flödessystem placerat bredvid lasern. (B)Exempel på en distans som behövs för att öka den yttre diametern på 500 μL-sprutor för att dra åt alla sprutor tillsammans. (C)Representativa bilder som visar det utrymme som krävs för magnetomrörarna. (D)Proppar är nödvändiga för att stalla sprutpumpen utan att sprutorna bryts. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk av flödessystemet som utvecklats för IC-FPOP. Blå linjer representerar kiseldioxidslangmed ett 450 μm ID och 670 μm OD, röda linjer har ett 150 μm ID och 360 μm OD, och orange linjer har ett 75 μm ID och 360 μm OD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Proteinanalys programvara som används för att upptäcka FPOP ändringar. Ett typiskt arbetsflöde med motsvarande ändringar som söks i varje nod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Systemet med encellflöde fokuserar hydrodynamiskt cellerna i en enda ström. (A)Ortogonal YZ stack som illustrerar 3D-fokusering av cellanalyten (röd, TMRM fluorofor) omgiven av hylsbufferten (grön, FITC fluorosofi). Tredimensionell medelintensitetsvärmekarta över hylsbufferten (B)och cellulära analyt (C). Lägre intensiteter är blå och högsta är röda (B-C). Denna siffra har ändrats från Rinas et al.9Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Användningen av IC-FPOP Flow System ökar drastiskt FPOP modifierade proteiner i intagceller. (A)Jämförelse av oxiderade proteiner som identifierats med och utan flödessystemet. Flödessystemet identifierade 1391 FPOP modifierade proteiner medan endast 105 proteiner identifierades utan flödessystem med en överlappning av 58 modifierade proteiner. Denna siffra har modifierats från Rinas et al.9 (B)Fluorescensavbildning av CellROX-behandlade celler efter ATT IC-FPOP visat att cellerna fortfarande är intakta efter oxidativ märkning. Celler avbildades med hjälp av en Olympus Fluoview FV1000 MPE multifotonmikroskop på 665 nm. Bilden som visas är ett enda segment. Denna siffra har ändrats från Espino et al.8Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Exempel på tandemMS/MS-spektra som äger rum under IC-FPOP. Produkt-jon (MS/MS) spektra av en (A) oförändrad peptid, och en (B) oxidation detekteras på rester M8 som finns på peptiden. En representativ EIC av(C)oförändrad peptid och(D)modifierad peptid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: IC-FPOP är effektivt när det gäller att undersöka proteinernas lösningsmedelstillgänglighet. AA) Ändringsomfattning för de 9 oxidativt modifierade peptiderna från aktin. Värden visas som medelvärden plus och minus standardavvikelse (n = 3). (B)Ändring av aktinpeptider oxiderad in vitro av synkrotronradiolys från Guan et al.10 (C)Korrelation av rester FPOP-modifieringar med SASA i den snäva (trianglar, streckad trendlinje) och öppna (cirklar, fast trendlinje) aktningstillstånd. Denna siffra har ändrats från Espino et al.8Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Flera masspektrometribaserade tekniker har utvecklats för att studera proteinstruktur och protein-ligand komplex på ett proteom-brett sätt i hela celler eller celllysmer. Dessa tekniker inkluderar men är inte begränsade till stabilitet av proteiner från oxidationshastighet (SPROX), termisk proteomprofilering (TPP), kemisk tvärbindning (XL-MS) och hydroxylradikalproteinavtryck (HRPF). Varje teknik har unika begränsningar och fördelar jämfört med varandra, som har genomgått omfattande översyn12. Var och en av dessa metoder har använts för proteom bred strukturbiologi för att belysa proteinstruktur och i slutändan fungera inom den komplexa cellulära miljön. IC-FPOP är en HRPF teknik som använder hydroxyl radikaler för att oxidativt modifiera lösningsmedel exponerade sidokedjor av aminosyror, sondering proteinstruktur och protein-ligand interaktioner inom livskraftiga celler13. IC-FPOP är en förbättring av den initiala HRPF i levande celler som använde Fenton kemi för att generera radikaler på minuter tidskala14. I denna studie, strukturella förändringar i ett integrerat membran protein som svar på att sänka pH eller jonisk styrka bufferten framgångsrikt kännetecknas med god oxidation täckning över proteinet. Jämfört med Fenton kemi, IC-FPOP är mycket snabbare, ändra proteiner på mikrosekunden tidsskalan, vilket gör det möjligt för den inhemska proteinkonformationen att studeras.
Ett viktigt test för IC-FPOP är att bekräfta cellernas livskraft efter exponering för H2O2. Med hjälp av en 40 cm blandningslinje ruvas cellerna i H2O2 för ungefär 3 s före bestrålning. Denna gång kan justeras genom att ändra längden på denna kiseldioxid slangar. Det är anmärkningsvärt att även om användningen av trypan blå för att testa cellenlivbarhet visar integriteten hos cellerna upprätthålls efter H2O2 inkubation, kan cellerna potential vara under stresssom påverkar signalering vägar som interagerar med H2O2. Lyckligtvis är den korta inkubationstiden snabbare än proteinsyntesen som ger förtroende de proteiner som finns inte induceras av H2O2.
Nästa viktiga steg är att bekräfta korrekt montering av flödessystemet. När den är monterad, se till att det inte finns några läckor närvarande efter att ha spolat systemet med önskad buffert. Om det finns läckor, se till att kiselslangen skars ordentligt och spolas mot glödregeln för att göra en ordentlig tätning en gång åtdragen. Alla delar är handdragna, så inga verktyg är nödvändiga. Under varje IC-FPOP-experiment ska du se till att de magnetiska omrörarna i cellsprutan förblir i rörelse. Denna lilla agitation begränsar antalet celler som bosätter sig längst ner i sprutan men är inte tillräckligt hård för att skjuva cellerna. Efter en körning finns det ungefär 50 μL celler kvar i sprutan. Se alltid till att späda ut detta med ett sköljsteg för att begränsa antalet celler som förs över till nästa experiment. Det rekommenderas att använda en färsk cellspruta om flera cellbehandlingar jämförs. Det är också viktigt att välja en lämplig buffert för de celler som testas. Vissa buffertar släcker hydroxylradikalen som leder till färre modifieringar på proteiner. Xu et al. har visat att vissa vanliga buffertar minskar hydroxyl radikal livstid11. DPBS och HBSS är vanliga buffertar som används för IC-FPOP-experiment.
Efter IC-FPOP optimerar du matsmältningsprotokollet baserat på de parametrar som behövs. Eftersom FPOP producerar irreversibla kovalenta ändringar, det finns gott om tid för en grundlig matsmältning och sanering utan att förlora märkning täckning. Testa och normalisera alltid proteinkoncentrationen så att enhetliga peptidkoncentrationer laddas för tandemmasspektrometri. Slutligen, tänk på att en immunoprecipitation inte kan utföras tillsammans med IC-FPOP. Om en FPOP-modifiering är inriktad på interaktionsområdet sänks antikroppens affinitet. För att öka identifieringen av FPOP-modifieringar har 2D-kromatografiska separationssteg visat sig mer än tredubbla antalet oxiderade peptider som upptäckts15.
En utmaning av alla FPOP experiment är den komplicerade nivån av dataanalys på grund av eventuella oxidationsprodukter som kan uppstå. Detta gäller både i cell eller in vitro men ökar drastiskt med den extra komplexiteten i att analysera celllysta. Med mer ytterligare optimization av IC-FPOP uppstår mer proteiner med högre ändringtäckningar, således snabbt danande analys mer mödosamt. Skjuvningmängden data som genereras från ett enda IC-FPOP-experiment begränsar användningen av manuell validering som gör att forskare förlitar sig mer på programvara. På grund av detta utvecklade Rinas et al. en kvanteringsstrategi för HRPF med Proteome Discoverer (PD)16. Den här metoden använder ett arbetsflöde för flera sökningar på PD i kombination med en kvantitativ plattform i ett kalkylblad. Ytterligare förbättringar på IC-FPOP-plattformen pågår för att öka antalet identifierade peptider med FPOP-modifieringar tillsammans med ökad reproducerbarhet och kvantierbarhet.
Disclosures
Lisa Jones är uppfinnare på flödesmonteringen för cellspatent (publikationsnummer: 20180079998).
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NSF CAREER Award (MCB1701692) för LMJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | any brand is sufficient |
| 500 µL SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ACQUITY UPLC M-Class System | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | 04A-4299 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| EX350 excimer laser | GAM Laser | EX350 excimer laser | |
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Science | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 210 syringe pump | KD Scientific | 788212 | Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Science | P-618L | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N'-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 88702 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32" | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP150350 | Polymicro Technologies | 1068150024 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 µm, Outer Diameter 670 µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150025 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Science | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | PI89900 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-182 | |
| Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-178 | |
| UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses | THORLABS | LA4052 | |
| V&P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000 | V&P Scientific, Inc. | VP724F | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Science | UH-436 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4. Biochemistry. 50 (38), 8117-8126 (2011).
- Li, Z., et al. High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).
- Zhang, H., Gau, B. C., Jones, L. M., Vidavsky, I., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for comparing structures of protein− ligand complexes: the calmodulin− peptide model system. Analytical Chemistry. 83 (1), 311-318 (2010).
- Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
- Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular & Cellular Proteomic. 2 (10), 1120-1132 (2003).
- Vahidi, S., Stocks, B. B., Liaghati-Mobarhan, Y., Konermann, L. Mapping pH-induced protein structural changes under equilibrium conditions by pulsed oxidative labeling and mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (21), 9124-9130 (2012).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In cell footprinting coupled with mass spectrometry for the structural analysis of proteins in live cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).
- Guan, J. Q., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structural Reorganization of Proteins Revealed by Radiolysis and Mass Spectrometry: G-Actin Solution Structure Is Divalent Cation Dependent. Biochemistry. 42 (41), 11992-12000 (2003).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Kaur, U., et al. Proteome-Wide Structural Biology: An Emerging Field for the Structural Analysis of Proteins on the Proteomic Scale. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3614-3627 (2018).
- Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
- Zhu, Y., et al. Elucidating in vivo structural dynamics in integral membrane protein by hydroxyl radical footprinting. Molecular & Cellular Proteomic. 8 (8), 1999-2010 (1999).
- Rinas, A., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins coupled to multidimensional protein identification technology (MudPIT): expanding footprinting strategies to complex systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
- Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).
