Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) للتحقيق في تطوير جذر Arabidopsis thaliana على مقياس نوع الخلية الخاصة

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/60919
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Plant and Microbial Biology, University of Zurich, 2Biophore - UNIL, 3Laboratory of Cell and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Neuchâtel

Summary

ترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) يوفر إمكانية تشريح البرامج التنموية مع الحد الأدنى من معالجة الأعضاء والأنسجة. ينتج البروتوكول عن الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الخلايا المستهدفة ببروتين فلورسنت أخضر (GFP) يسمى وحدة فرعية من الريبوزيوم. تكشف أدوات التحليل المصب، مثل qRT-PCR أو RNA-seq، عن ملفات تعريف التعبير الخاصة بنوع الأنسجة والخلايا.

Abstract

في هذه المقالة، نعطي تعليمات عملية للحصول على بيانات الترجمة من أنواع مختلفة من الخلايا الجذرية العربية dopsis thaliana عبر ترجمة التنقية تقارب الريبوسر (TRAP) ومتتالية الأمثل إعداد مكتبة منخفضة الإدخال.

كمادة البدء، ونحن توظيف خطوط النبات التي تعبر عن GFP الموسومة بروتين riبومRPL18 بطريقة محددة نوع الخلية عن طريق استخدام المروجين كافية. قبل المناعة واستخراج الحمض النووي الريبي ، يتم تجميد الأنسجة ، مما يحافظ على سلامة الأنسجة ويسمح في الوقت نفسه بتنفيذ دراسات السلسلة الزمنية بدقة زمنية عالية. وتجدر الإشارة إلى أن هياكل جدار الخلية لا تزال سليمة، وهو عيب رئيسي في الإجراءات البديلة مثل الأساليب القائمة على فرز الخلايا المنشطة للفلورسينس والتي تعتمد على الأنسجة المصممة لعزل مجموعات الخلايا المتميزة. بالإضافة إلى ذلك ، لا يلزم تثبيت الأنسجة كما هو الحال في تقنيات التقاط الميكروديزالقسمة بالليزر ، والتي تسمح بالحصول على الحمض النووي الريبي عالي الجودة.

ومع ذلك، فإن أخذ العينات من المجموعات الفرعية للخلايا وعزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالبوليبعض فقط يحد بشدة من غلة الحمض النووي الريبي. ولذلك، من الضروري تطبيق أساليب إعداد المكتبة الحساسة بما فيه الكفاية من أجل الحصول الناجح على البيانات من قبل RNA-seq.

يقدم TRAP أداة مثالية لأبحاث النبات حيث أن العديد من العمليات التنموية تنطوي على مسارات إشارات ميكانيكية ذات صلة بجدار الخلية. استخدام المروجين لاستهداف مجموعات محددة من الخلايا هو سد الفجوة بين الجهاز ومستوى الخلية الواحدة التي تعاني بدورها من دقة قليلة أو تكاليف عالية جدا. هنا، نطبق TRAP لدراسة الاتصالات الخلية الخلية في تشكيل الجذر الجانبي.

Introduction

وبدافع من التطبيق المتزايد لتقنيات التسلسل من الجيل التالي، يمكن زيادة الاستبانة المكانية في البيولوجيا الإنمائية. تهدف الدراسات المعاصرة إلى تشريح الأنسجة وصولاً إلى أنواع الخلايا المتخصصة، إن لم يكن بخلية واحدة المستوى1،,2،,3،,4. ولتحقيق هذه الغاية، تم ابتكار عدد كبير من الطرق المختلفة على مدى السنوات الخمسين الماضية (انظر الشكل 1A)5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15.

وقد تم العديد من الأدوات في علم النبات التكيف من التقنيات التي كانت رائدة في مجال البحوث الحيوانية. وليس هذا هو الحال بالنسبة للطريقة التي نقدمها بالتفصيل هنا. في عام 2005، مجهزة خلفية قوية في ترجمة البروتين، مختبر بيلي سيريس المنصوص عليها لهندسة البروتينات riبوم لتنقية تقارب لاحقة16. وهكذا، فإنها يمكن أن تجنب التنميط متعدد السمات تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة، والذي يقوم على ultracentrifugation مع تدرج السكروز وكان يستخدم لتقييم ترجمة الريبوسوم منذ 1960s17،18. ومنذ ذلك الحين يشار إلى الأسلوب على أنه تنقية تقارب الريبوسرية الانتقالية (TRAP)16. بعد نجاح دراسات الترجمة في النباتات، Heiman وآخرون تكييفها TRAP للحيوانات19 وغيرها وسعت تطبيقها إلى الخميرة20، Drosophila21، زينوبوس22 وحمار وحشي23،24.

على الرغم من أن التعديل الجيني للنظام النموذجي هو شرط أساسي لـ TRAP ، الذي يحد من تطبيقه على الأنواع القابلة للتحول الوراثي ، يمكن للمرء في الوقت نفسه تسخير هذا الاعتراض لاستهداف مجموعات فرعية من الخلايا ذات أهمية خاصة ويصعب للغاية عزلها عن الأنسجة السليمة / الجهاز25 (على سبيل المثال ، الخلايا التشفية المتفرعة للغاية في دماغ فأر أو الهيفاي الفطري في الأنسجة النباتية المصابة). في النباتات ، يتم الاحتفاظ بجميع الخلايا في مكانها عبر جدران الخلايا التي تشكل أساس الهيكل العظمي الهيدروستاتيكي26. لتحرير خلية نباتية من هذه المصفوفة ، قام العلماء إما بقطع الخلية فعليًا من الأنسجة المحيطة بها من خلال إجراء عملية إزالة الميكروبات بالليزر (LCM)27 أو إجراء هضم أنزيمي لجدران الخلية28. من بين الخلايا الأخيرة، ما يسمى protoplasts، يتم تسمية السكان من الفائدة الفلورسنت ويمكن فصلها عن طريق فرز الخلايا المنشط ة الفلورية (FACS)7. LCM يتطلب عادة عينة لتكون ثابتة وجزءا لا يتجزأ من الشمع، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تدهور نوعية الحمض النووي الريبي29. الأساليب المستندة إلى FACS تنتج الحمض النووي الريبي عالي الجودة ، ولكن عملية protoplasting نفسها تدخل اختلافات في التعبير الجيني30 والأنسجة ذات جدران الخلايا الثانوية المعدلة والسميكة من الصعب علاجها. وعلاوة على ذلك، يفترض العديد من العمليات التنموية في النباتات أن تعتمد على إشارات تنتقل ميكانيكيا، وبالتالي سلامة جدار الخلية ذات أهمية قصوى31. طريقتان، تستخدمان اختصاراً للتحايل على عزل الخلايا من خلال العمل على مستوى النوى، هما الفرز النووي المنشط للفلورسينس (FANS) وعزل النوى الموسومة بأنواع خلايا محددة (INTACT). كما هو الحال في TRAP ، فإنها تستخدم المروجين نوع الخلية الخاصة لوضع علامة على النوى ، التي تحصل في وقت لاحق إثراء عن طريق الفرز أو سحب إلى أسفل ، على التوالي8،15. التحدي الرئيسي لجميع هذه النهج هو الحصول على ما يكفي من المواد الحمض النووي الريبي من مجموعات فرعية من الخلايا في الأنسجة. كما يلتقط TRAP سوى جزء صغير من الحمض النووي الريبي الخلوي، جمع عينة هو عنق الزجاجة كبيرة. ولذلك، هناك حاجة إلى بروتوكولات إعداد المكتبة الحساسة بشكل خاص لإنتاج بيانات عالية الجودة من كميات مدخلات منخفضة.

منذ إنشائها، وقد استخدمت TRAP إما في تركيبة مع microarrays الحمض النووي أو، كما انخفضت تكاليف التسلسل بشكل كبير في السنوات الأخيرة، RNA-seq10،32،33. وقد تم بالفعل توضيح العديد من الأسئلة البحثية كما تمت مراجعتها في Sablok et al.34. ونحن مقتنعون بأن المزيد من التقارير ستتبع في السنوات المقبلة كما تقنية متعددة جدا عند الجمع بين المروجين مختلفة لاستهداف أنواع محددة من الخلايا. في نهاية المطاف، سيتم ذلك حتى بطريقة لا يمكن اختزالها، ويمكن دمجها مع التحقيق في رد فعل النبات على العديد من عوامل الإجهاد الحيوي واللاأحيائي. بالإضافة إلى ذلك ، حيث لا تتوفر خطوط معدلة مستقرة ، تم استخدام أنظمة التعبير عن الجذر المشعر بنجاح أيضًا لتنفيذ TRAP في الطماطم وmedicago35،36.

Figure 1
الشكل 1: ترجمة تنقية التقارب الريبوسومي (TRAP) تكمل محفظة تحليل "omics". A. يمكن تحقيق زيادة مستويات الدقة التحليلية، وصولا إلى وحدة واحدة أو حتى دقة تحت الخلية من خلال عدد كبير من الأساليب أو تركيبات منها. ويقدم هذا المخطط لمحة عامة عن الأدوات المتاحة حاليا في المجال النباتي والحيواني. يمكن تحقيق جمع الأنسجة في دقة الخلوية من خلال بروتوكولات مثل LCM أو FACS ، والتي يتم اقترانها بعد ذلك بالنسخ القياسي أو تحليل التنميط / الترجمة المتعدد. TRAP وسليمة دمج كل من التقاط الأنسجة وعزل الحمض النووي الريبي لأنها تقوم على العلامات epitope. ومع ذلك ، عينات سليمة نواة الخلية فقط ويشكل ، وبالتالي ، حالة خاصة من تحليل النسخ. رمز أرنب صغير علامات الأساليب المطورة حديثا في مجال الحيوان: في حين أن SLAM-ITseq وFlura-seq تعتمد على التتار الأيضي من الحمض النووي الريبي الوليد مع قواعد uracil المعدلة في الخلايا التي تعبر عن الإنزيم المتساهل، الشريحة-seq يجعل استخدام شريحة الزجاج المغلفة مع الباركود الحمض النووي التي توفر المعلومات الموضعية في النطاق الخلوي. ويتبع نهج وضع علامات القرب في APEX-seq لأخذ عينات RNAs في مقصورات دون خلوية محددة. وتجدر الإشارة إلى أن زيادة الاستبانة كثيرا ما تتطلب توليد مواد معدلة وراثيا (علامات نجمية) ومن ثم تستخدم هذه الأساليب في الغالب للأنواع النموذجية. TRAP مناسب بشكل خاص لدراسات علوم النبات التي تنطوي على جدار الخلايا (CW) أو إشارات ميكانيكية وكذلك أنواع الخلايا التي يصعب إطلاقها من مصفوفة CW الخاصة بهم. ب. مفصلة الخطوات الرطب مختبر الإجراء TRAP: تزرع الشتلات التي تعبر عن بروتين riبوم الموسومة GFP في أنواع الخلايا المتميزة (مثل endodermis الجذر) على أطباق بيتري لمدة سبعة أيام والمواد الجذرية التي يتم حصادها عن طريق تجميد المفاجئة. يتم جمع عينة التحكم في الحمض النووي الريبي بالكامل من مستخلص النفط الخام المتجانس قبل أن يُسقط الحطام عن طريق الطرد المركزي. يتم إضافة الخرز المغناطيسي المضاد لـ GFP إلى المستخلص المنفّر لإجراء الترسيبات المناعي. بعد الحضانة وثلاث خطوات غسل ، يتم الحصول على الحمض النووي الريبي المرتبط بالبولي بعض (TRAP / POLYsome RNA) مباشرة عن طريق استخراج الفينول الكلوروفورم. LCM: الليزر التقاط microdissection، FACS / FANS: خلية تنشيط الفلورسينس / الفرز النووي، APEX-seq: طريقة تقوم على ascorbate peroxidase المهندسة، سليمة: عزل النوى الموسومة في أنواع خلايا محددة، SLAM-ITseq: thiol (SH) المرتبطة alkylation لتسلسل التمثيل الغذائي من الجيش الملكي النيبالي في الأنسجة، فلورا-seq: فلوروراسيل المسمى تسلسل الحمض النووي الريبي (خلق مع Biorender.com) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الهدف من هذه المقالة هو توفير وصف مفصل لأسلوب TRAP، لتسليط الضوء على الخطوات الهامة وتوفير التوجيه لأسلوب إعداد مكتبة ممكن.

وستتألف تجربة TRAP العامة أساسا من الخطوات التالية (انظر أيضا الشكل 1باء):(1) إعداد المواد النباتية بما في ذلك استنساخ بناء العلامات الريبوسومية، وإنتاج الخطوط المحورة وراثيا واختيارها، وتزايد البذور والطلاء وستكثرها، وتطبيق/معالجة الإجهاد (اختياري) وحصاد الأنسجة؛ (2) إعداد المواد النباتية بما في ذلك استنساخ الريبوسوم يُحدّد البناء، وإنتاج الخطوط المحورة وراثيا واختيارها، وزراعة البذور والطلاء وستكثرها، وتطبيق/معالجة الإجهاد (اختياري) وحصاد الأنسجة؛ (2) إعداد المواد النباتية بما في ذلك استنساخ الريبوسوم لوضع العلامات على الخلايا. (2) التنقية المناعية بما في ذلك تجانس الأنسجة وتطهير مستخلص النفط الخام، وغسل النحل وتنقية المناعة، وخطوات الغسيل؛ (3) استخراج الحمض النووي الريبي وتقييم الجودة؛ و(4) إعداد المكتبة.

وقد جذر Arabidopsis نظام نموذجي لدراسة تطوير النبات منذ عرضه كمصنع نموذجي37,38. هنا ، يتم عرض تطبيق TRAP في سياق تطوير الجذر الجانبي النباتي. في النباتات ، يعتمد تراكم نظام الجذر بأكمله على تنفيذ هذا البرنامج وبالتالي فهو مهم جدًا لبقاء الكائن الحي39. في Arabidopsis، تنشأ الجذور الجانبية من أنسجة الدراجة المحيطة التي تتواجد بجوار أوعية xylem وبالتالي يطلق عليها اسم xylem pole pericycle (XPP ؛ انظر الشكل 2C)40. بعض خلايا XPP ، والتي تقع في عمق الجذر ، والحصول على هوية الخلية مؤسس ، وعلى الزناد الهرمونية المحلية ، والبدء في الانتشار عن طريق تورم وتقسيم anticlinally41. ومع ذلك ، بسبب وجود مصفوفة جدار الخلية جامدة ، وهذه العملية تمارس الإجهاد الميكانيكي على الأنسجة المحيطة بها. على وجه الخصوص ، يتأثر endodermis التجاوزي ، كما هو الحال في طريق محور نمو الجذر الجانبي42،43،44. في الواقع ، فإن تشكيل بريمورديوم حديثا يجب أن تنمو من خلال الخلية endodermis المبالغ فيها(الشكل 2C2)في حين يتم دفع الخلايا القشرة والبشرة جانبا لprimordium لتظهر أخيرا45،46. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة في مختبرنا أن endodermis يساهم بنشاط لاستيعاب انتشار في pericycle. حظر المستهدفة من الإشارات الهرمونية endodermal كافية لمنع حتى الانقسام الأول جدا في خلايا XPP47. وبالتالي، الاتصالات pericycle-endodermis يشكل نقطة تفتيش مبكرة جدا لتطوير الجذر الجانبي في Arabidopsis. ومع ذلك، لا يُعرف كيف يتم تنفيذ هذا الكلام المتقاطع. لكشف هذا اللغز، اخترنا نهج TRAP-seq لاستهداف XPP والخلايا endodermal. لإثراء للخلايا في برنامج الجذر الجانبي، ونحن تحاكي الزناد الهرموني عن طريق تطبيق خارجي تناظرية الأوكسين (1-حمض النفتاليناستيك، NAA)48،والتي سمحت في الوقت نفسه لحل مؤقتا المرحلة الأولية من تشكيل الجذر الجانبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1- استنساخ الجين المتحول وإنتاج الخطوط المحورة وراثياً والاختيار

  1. استنساخ المروج من الاختيار في ناقلات الإدخال المناسبة. استخدام طريقة الاستنساخ المستندة إلى إعادة الجمع(جدول المواد)وإعادة دمج المروجين في pDONRP4-P1r. استنساخ RPL18 (مع علامة تقارب أو بروتين الفلورسنت من اختيار) باستخدام الاستنساخ القائم على إعادة التركيب في pDONRP1-P249.
  2. الجمع بين ناقلات الدخول التي تحتوي على RPL18 مع ناقل الإدخال المحتوي على المروج في رد فعل إعادة تركيبة جزء اثنين في متجه الوجهة المناسبة مع كاسيت الاختيار السريع الأحمر50 لتسهيل الاختيار المباشر للبذور المعدلة وراثيا.
  3. التحقق من المتجهات التي تم دمجها عن طريق التسلسل وتحويلها إلى البكتيريا الزراعية المناسبة والمختصة. زهرة تراجع النباتات Arabidopsis وبعد 3-4 أسابيع الحصاد واختيار T1 البذور51.
  4. استخدم المجهر لتحديد الخطوط المعبرة جيدًا والتحقق من أنماط التعبير وفقًا لنشاط المروج المبلغ عنه في خطوط مستقلة متعددة. حدد الأسطر التي تعرض نمط تعبير تمثيلي مع إدراج T-DNA واحد. وهذا قد يساعد على التقليل إلى أدنى حد من إسكات وسيكون من المفيد للصلبان الوراثية.
  5. حدد T3 ذرية وهذا هو homozygous لجين علامة.

2- الانتشار والتعقيم

  1. يفصل TRAP الخاص بنوع الخلية الحمض النووي الريبي عن عدد محدود من الخلايا المستهدفة لكل جذر. لتوليد مواد البداية اللازمة، نشر خطوط homozygous. ولتحقيق هذه الغاية، استخدم شروط النمو القياسية مع التركيز بشكل خاص على التحكم في النمو الفطري.
    ملاحظة: إذا تعذر الحصول على خطوط إدخال واحدة، قم بزراعة دفعات في مجموعات سكانية كبيرة على مدى أجيال قليلة لتجنب إسكات عبر الأجيال الناجم عن الحمض النووي.
  2. تعقيم كميات كبيرة من بذور العربيدوبسيس مع جولة واحدة من غاز الكلور وجولة واحدة من 70٪ EtOH.
    1. تنتشر البذور بالتساوي على 12 سم × 12 سم أطباق بيتري مربعة (أقل من 0.3 مل البذور / لوحة) وكومة لهم في المجفف أو حاوية مناسبة أخرى. تجنب تشكيل كتلة أو كومة كما البذور تحتاج إلى أن تكون في متناول الغاز. إجراء تعقيم الغاز بين عشية وضحاها مع وحدات التخزين التبييض وHCl كما ذكرت52: 100 مل من التبييض (13٪) مع 6 مل من conc. HCl في 60 L desiccator. Defumigate لمدة 1 ساعة على الأقل قبل جمع البذور في وعاء معقم.
      تنبيه: 37% HCl هو تآكل للغاية ويتطلب التعامل مع دقيق. غاز الكلور سام، استخدم غطاء الدخان.
    2. خذ 0.1 مل من البذور الجافة المعقمة بالغاز لكل لوحة ومزجها مع محلول التعقيم (70٪ EtOH ، 0،01٪ Tween) في درجة حرارة الغرفة. احتضان لمدة 20 دقيقة، وDecant EtOH وغسل البذور 3-4 مرات مع H2O المعقم.
    3. نقل البذور المنقوعة إلى أنابيب 50 مل وتمييع مع العقيمة 0.1٪ أجار للحصول على 1 مل من الطين البذور المنقبة لكل لوحة (0.1 مل البذور / 1 مل الطين).
      ملاحظة: بسبب أحداث التكامل عبر الجينات، خطوط النبات يمكن أن تكون عرضة لتقنيات التعقيم المختلفة. تم العثور على وقت الحضانة خاصة EtOH أن تكون حاسمة. في أيدينا، كانت خطوات التعقيم المزدوج ضرورية لتجنب التلوث الفطري أثناء التجارب. هذا مهم بشكل خاص عند تنفيذ سلسلة زمنية حيث أن تلوث نقطة زمنية واحدة يعوق التجربة بأكملها. قد يكون جيدا أن التعقيم المزدوج ليست هناك حاجة دائما، اعتمادا على ظروف النمو المحلية.

3. الطلاء

  1. إعداد هذه الخطوات مقدما. صب 1/2 لوحات MS (درجة الحموضة 5.8) مع 1٪ أجار في الكميات اللازمة للتجربة (20-30 لكل عينة / نقطة زمنية). قطع 1 مل نصائح ماصة لتكبير قطر طرف إلى حوالي 3-4 ملم مع شفرة حلاقة. أوتوكلاف النصائح. إنشاء حامل قالب للطلاء ثلاثة صفوف من البذور لكل لوحة مع أغطية طبق بيتري مربع. إعداد غطاء تدفق لامير لتوفير بيئة عمل معقمة وتسمية لوحات ليتم تجهيزها.
    ملاحظة: إذا تمت معالجة العديد من اللوحات في نفس الوقت، يمكن للتسميات الملونة تسريع وضع العلامات.
  2. ضع لوحات أجار فارغة في حامل القالب وتوزيع 1 مل من البذور المنقبة بالتساوي على ثلاثة صفوف. ضع الأطباق المعالجة في أكوام في تدفق اللاميد حتى تجف البذور (أي التمسك بسطح الأجار). لا تترك لوحات أطول كما سوف تجف أجار كذلك.
  3. مرة واحدة البذور جافة بما فيه الكفاية، وإغلاق الأغطية وختم كل لوحة مع الشريط micropore. تقسيم البذور لمدة يومين في 4 درجة مئوية في الظلام وبعد ذلك وضعها في غرفة النمو.

4. علاج الأنسجة (اختياري)

ملاحظة: في هذا البروتوكول، ونحن الخطوط العريضة للعلاج الخارجي لجذور أرابيدوبسيس مع البديل auxin الاصطناعية NAA. اعتمادا على السؤال التجريبي في متناول اليد، وهذا الجزء يحتاج إلى تعديل أو يمكن حذفها تماما.

  1. إعداد شرائط من ورق الأنسجة من 1.5 - 2 سم في الارتفاع و 10 سم في الطول. تتطلب فترات الحضانة المطولة أن يتم الأوتوكلاف على الأنسجة قبل الاستخدام.
  2. إزالة الشريط micropore من جميع لوحات التي يجب أن تخضع للعلاج الهرموني. تمييع 1 مل من 10 مل NAA (حل في DMSO) في 1 لتر من السائل، الأوتوكلاف 1/2 محلول MS (درجة الحموضة 5.8) ونقع ورقة الأنسجة في الحل (10 ميكرون NAA).
  3. استخدام ملاقط لتطبيق شريط من ورق الأنسجة على كل صف من الجذور. استخدام الأصابع بلطف لإزالة فقاعات الهواء. السائل الزائد الفارغ من اللوحة، أغلق الغطاء ووسم اللوحة بالوقت. بالنسبة لفترات الحضانة الممتدة، ضع اللوحات مرة أخرى في غرفة النمو.

5- الحصاد

  1. استرداد لوحات لكل تكرار البيولوجية / نقطة زمنية / العلاج. جمع النيتروجين السائل في وعاء ديوار نظيفة وأنابيب التسمية (15 أو 50 مل) لعينات الأنسجة المختلفة. إعداد حامل الستايروفوم.
    تنبيه: تصبح مألوفة مع إجراءات معالجة النيتروجين السائل (تقادير، قضمة الصقيع، يحتمل أن تنفجر الأنابيب).
  2. فتح لوحة وإزالة ورقة الأنسجة مع ملقط، مع الحرص على عدم فصل الجذور من سطح أجار. مع شفرة جراحية، وقطع مرة واحدة في الصف على طول تبادل لاطلاق النار الجذر-تقاطع في ضربة واحدة، تحديد. تنظيف ريش بين العينات وتبادل في كثير من الأحيان لضمان الحدة.
  3. مع ملاقط، مرر سريعًا على طول جذور كل صف لجمعها في ثلاث حزم. الاستيلاء على الجذور وتفريغها في أنبوب 50 مل مليئة النيتروجين السائل لتجميد المفاجئة.
    ملاحظة: لا تحاول تجميع الجذور في هياكل كثيفة (مثل الكرات) لأنها من الصعب طحن في الخطوة التالية.
  4. المضي قدما مع جميع اللوحات التي تشكل عينة واحدة (في ترتيب أوقات الحضانة) وصب النيتروجين السائل الزائد. استخدم غطاء الأنبوب لمنع الجذور من الانسكاب. ثم أغلق الغطاء وجمع جميع الأنابيب في سفينة ديوار. تخزين الأنسجة الجذرية في -80 درجة مئوية.

6- التنقية المناعية

ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى الحصول على راب/POLYsome RNA عالية الجودة. لذلك ، اتبع بدقة نصيحة الممارسة الجيدة للتعامل مع الحمض النووي الريبي. تنفيذ جميع الخطوات في هذا القسم في مقعد معقم وتنظيف جميع المعدات وأدوات المختبرات مع حل RNase إزالة(جدول المواد). ارتداء القفازات وتغييرها على الفور عندما ملوثة مع العينة، والجليد، أو غيرها من المصادر التي لم يتم تنظيفها. وبما أن هذا جانب بالغ الأهمية، يدرج قسم عن إعادة استخدام المعدات إلى جانب المشورة المتعلقة بالتخلص من النفايات.

  1. إعداد المخزن المؤقت
    1. إعداد حلول الأسهم وفقا للجدول 1 والأوتوكلاف (A) أو تصفية تعقيم (- ). ما لم ينص على خلاف ذلك، المذيب هو المياه الخالية من RNase.
    2. حل وaliquot dithiothreitol (DTT) ، فينيل ميثيل سولفونيل فلوريد (PMSF) ، cycloheximide (CHX) والكلورامفينيكول (CAM) في المذيبات الخاصة بهم على النحو المبين في الجدول 1 وتخزينها عند -20 درجة مئوية. يمكن أن تبقى جميع الأسهم الأخرى في درجة حرارة الغرفة.
    3. ما قبل خلط المخزونات - مع المكونات 1-4 لغسل المخزن المؤقت (البنك الدولي) و 1-6 لاستخراج متعدد العازلة (PEB) - لتجنب خلط المخزن المؤقت تستغرق وقتا طويلا قبل كل استخراج. وهكذا، فقط إضافة الماء والمكونات المجمدة (7-10) في يوم الاستخراج. الحفاظ على الأسهم المختلطة مسبقا والمياه الخالية من RNase في 4 °C.
      ملاحظة: تركيز DTT هو 1/5 من التركيز المبلغ عنه من زانيتي وآخرين 2005، حيث أن تفاعل ناون مع GFP حساس لتركيزات DTT عالية.
المكونات تركيز المخزون إضافة حجم في مل ل50 مل من البنك الدولي* إضافة وحدة تخزين في مل ل50 مل من PEB*
1 تريس، درجة الحموضة 9 أ 2 متر 5 5
2 KCl أ 2 متر 5 5
3 EGTA أ 0.5 متر 2.5 2.5
4 MgCl2 أ 1 متر 1.75 1.75
5 Pte أ 20% (v/v) 0 2.5
6 مزيج المنظفات أ 0 2.5
توين 20 20% (v/v)
تريتون-X 100 20% (v/v)
بريج-35 20% (ث/v)
إيجيبال 20% (v/v)
7 DTT ₳ 0.5 متر 0.1 0.1
8 منظمة أطباء بلا حدود ₳ 0.1 متر (ايزوبروبانول) 0.5 0.5
9 سيكلوهيكسيديميد ₳ 25 ملغ/مل (EtOH) 0.1 0.1
10 الكلورامفينيكول ₳ 50 ملغ/مل (EtOH) 0.05 0.05

الجدول 1: تكوين العازلة والمشورة الاختلاط. المكونات مع تركيزات الأسهم المعطى مختلطة في كميات معينة تسفر عن 50 مل من البنك الدولي أو PEB. Tris: tris-(hydroxymethyl)-aminomethane, EGTA: الإيثيلين غليكول-بيس (α-aminoethyl الأثير)-N, N,N', N',N'-tetra-حمض الخليك, PTE: البولي كاكسيثيلين-(10)-tridecyl الأثير, A: الأوتوكلاف, ο: مرشح-تعقيم; * ملء ما يصل إلى 50 مل مع المياه الخالية من RNase.

  1. تجانس الأنسجة / طحن
    1. تبريد أجهزة الطرد المركزي ووضع المتجانسات وأنابيب الطرد المركزي على الجليد. Thaw aliquots من DTT، PMSF، CHX وCAM. مزيج PEB والبنك الدولي من حلول الأسهم في أنابيب 50 مل وفقا لمتطلبات اليوم (# من العينات) وبارد على الجليد.
      ملاحظة: أضف PMSF قبل وقت قصير من الاستخدام، حيث أن نصف عمر PMSF في الماء هو 30 دقيقة فقط.
    2. إعداد الكثير من النيتروجين السائل في وعاء ديوار واسترداد عينات الأنسجة من -80 درجة مئوية التخزين. ارتداء قفازات القطن تحت قفازات المختبر القياسية لمنع الحروق من قذائف الهاون الباردة. صب النيتروجين السائل في مدافع الهاون والحشرات حتى تكون باردة بما يكفي للسماح طحن. من المستحسن وضع نظام للتمييز بين قذائف الهاون (التسمية أو الاحتفاظ بها في ترتيب معين).
    3. عينة الأنسجة الفارغة في هاون وطحن بعناية حتى جميع المواد هو مسحوق أبيض. إذا لزم الأمر، إضافة النيتروجين السائل للحفاظ على الأنسجة المجمدة أو لتسهيل طحن أفضل.
    4. إضافة 5 مل من PEB إلى العينة وتخلط بسرعة مع مسحوق قبل تجميد المخزن المؤقت. في حين أن هذه العينة يذوب (مزيج من وقت لآخر) معالجة عينة أخرى.
    5. بمجرد أن يمكن نقل الخليط، إفراغ الطين في المتجانس الزجاج والحفاظ على الجليد. مع 2 مل إضافية من PEB، شطف هاون والحشرات وإضافتهإلى العينة في المتجانس.
      ملاحظة: تجنب عينة سائلة تماما لأن هذا يسمح تدهور الحمض النووي الريبي.
    6. طحن الطين يدويا حتى استخراج متجانسة. نوصي بما لا يقل عن 4 إلى 5 يغرق.
      ملاحظة: قد يتطلب بعض وقت الانتظار إضافية للسماح للالطين لذوبان المزيد. التعامل مع المتجانسات يتطلب بعض الاجتهاد. لا تطبق القوة الغاشمة وحذار من قوات الشفط. وإذا لم يؤخذ ذلك في الحسبان، فإن ذلك سيؤدي إلى انسكاب المتجانس أو تلوثه أو تدميره.
    7. صب استخراج الجذر الخام في أنبوب الطرد المركزي 50 مل (الحفاظ على الجليد).
      ملاحظة: عادة ً ما يمكن أن تكون عدة عينات أرضًا قبل النقل. مطلوب معالجة متوازية من طحن ونقل وتجانس. في محاولة للعمل بسرعة ولكن لا تتعجل; حافظ على هدوئك. دائما الحفاظ على عينات متجانسة على الجليد.
  2. مجموع مجموعة عينات الحمض النووي الريبي
    1. نقل 200 ميكرولتر من كل عينة من الخام إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق نظيفة (وصفت وتبريدها على الجليد مسبقا).
    2. المضي قدما في استخراج الحمض النووي الريبي كما هو مفصل لعينات TRAP في النقطتين 7.1 و 7.2. القيام بهذه الخطوات أثناء مسح العينات في جهاز الطرد المركزي.
    3. إجراء علاج DNase مع الحمض النووي الريبي الكلي الذي أعيد تعليقه للقضاء على تلوث الحمض النووي وتنظيف التفاعل باستخدام مجموعة تجارية(جدول المواد).
      ملاحظة: عادة ما تسفر عمليات استخراج الحمض النووي الريبي الإجمالية عن تركيزات عالية وتحتاج العينات إلى تخفيفها إلى حد كبير. نوصي بقياس التركيز بعد التخفيف من خلال بروتوكول Qubit الحساس.
  3. تطهير استخراج الخام
    1. خذ دلو الثلج مع عينات من 6.2.7 وطاردها للطرد المركزي لمدة 15 دقيقة بمعدل 16000 × ز و4 درجات مئوية.
      ملاحظة: لتحقيق التوازن بين جهاز الطرد المركزي، قم بإقران العينات وفقًا لذلك. في حالة عدم إمكانية ذلك تمامًا، قم بضبط عينة واحدة عن طريق إضافة PEB.
    2. صب supernatant إلى أنبوب الطرد المركزي الطازج (تبريده على الجليد مسبقا) وتكرار الطرد المركزي (15 دقيقة في 16،000 × ز و 4 درجة مئوية). ويمكن إجراء هذا النقل بسرعة بجوار جهاز الطرد المركزي.
    3. في حين أن استخراج الخام هو تطهير، بدء غسل الخرز GFP للخطوة 6.6.
      ملاحظة: احتفظ بهذا الدلو الجليدي للهزاز على شاكر ولكن لا تضع مرة أخرى في مقاعد البدلاء العقيمة لأنها قد تكون ملوثة.
  4. غسل النحل
    1. Aliquot المغناطيسي GFP الخرز (#samples × 60 ميكرولتر، جدول المواد)في أنبوب 1.5 مل. ضع على المنصة المغناطيسية. مرة واحدة وقد جمعت الخرز، وإزالة supernatant.
    2. إضافة 1 مل من البنك الدولي الباردة، وإعادة تعليق الخرز وجمعها مرة أخرى. تجاهل المخزن المؤقت لغسل وكرر مرة أخرى مع 1 مل من البنك الدولي.
    3. في نهاية المطاف، إعادة تعليق الخرز في البنك الدولي إلى الحجم الأولي المستخدم في الخطوة 6.5.1.
  5. التنقية المناعية (IP)
    1. مباشرة بعد الطرد المركزي، صب supernatant مسح في أنابيب 15 مل وصفت وإضافة 60 ميكرولتر من الخرز غسلها لكل عينة.
    2. ضع جميع العينات أفقيًا في دلو الثلج ووضعها على شاكر. اسمحوا الخليط احتضان لمدة 2 ساعة من أجل ربط polysomes GFP المسمى إلى الخرز.
    3. جمع الخرز على موقف المغناطيسي لأنابيب 15 مل (على الجليد) وإضافة PMSF إلى PEB المتبقية. تجاهل supernatant. صب ما يقرب من 5 مل من PEB إلى الخرز وإعادة تعليقها عن طريق إمالة. يهز العينات لمدة 15 دقيقة في الإعداد نفسه كما هو الحال في القسم 6.6.2.
    4. كرر السُهُم مع البنك الدولي إلى ما مجموعه 3 مُسَرَج (1 × PEB، 2 × WB). قبل كل تبادل المخزن المؤقت، إضافة PMSF.
    5. جمع الخرز في 1 مل من البنك الدولي ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل. وأخيرا، جمع الخرز مرة أخرى على موقف المغناطيسي وإزالة جميع السائل. أغلق الأنبوب وابق على الثلج حتى تتم معالجة جميع العينات.
    6. نقل العينات إلى غطاء الدخان لاستخراج الحمض النووي الريبي.
  6. التخلص من النفايات وتجديد إمدادات المختبر.
    1. إذا أجريت وفقا لممارسات المختبر جيدة (انظر القسم 2.2.1)، إجراء التعقيم تسفر عن محلول NaCl مائي. ترك غاز الكلور، فضلا عن HCl المتبقية والتبييض، لdefumigate في غطاء الدخان.
    2. PEB والتخلص من البنك الدولي: كما تتحلل CHX في درجة الحموضة العالية، وجمع جميع السوائل وجلب إلى درجة الحموضة > 9. التخلص من النفايات السائلة في النفايات الكيميائية المهلجنة. يجب التخلص من جميع المواد الصلبة (الأنسجة والماصة المصلية والقفازات وما إلى ذلك) كنفايات كيميائية.
    3. جمع السوائل المحتوية على الفينول بشكل منفصل، وكذلك المواد الملوثة بالفينول (النصائح والأنابيب والقفازات).
    4. غسل اليد مدافع الهاون، pestles والمتجانسات (الإسفنج والفرشاة) مع الصابون وشطف جيدا. في وقت لاحق، خبز المواد في > 220 درجة مئوية بين عشية وضحاها. إما التفاف في رقائق القصدير قبل العلاج أو مكان في وعاء واقية من الحرارة، مغطاة.
    5. فرشاة أنابيب الطرد المركزي نظيفة مع المنظفات ومن ثم diethylpyrocarbonate (DEPC) علاج في غطاء الدخان. لهذه الغاية، إضافة DEPC السائل إلى المياه المنزوعة (1 مل من DEPC إلى 1 لتر من H2O) وتخلط عن طريق الهز. ضع أنابيب الطرد المركزي على صينية قابلة للأوتوكلاف تصطاد مياه DEPC المسكوبة. صب التعليق في الأنابيب وترك لمدة 3 ساعة أو بين عشية وضحاها. DEPC تتحلل في عملية الأوتوكلاف اللاحقة.
      تنبيه: DEPC سام للغاية.

7. استخراج الحمض النووي الريبي ومراقبة الجودة

  1. استخراج الحمض النووي الريبي
    1. تبريد جهاز الطرد المركزي على سطح الطاولة إلى 4 درجات مئوية.
    2. إضافة 1 مل من حمض guanidinium-الفينول القائم على كاشف(جدول المواد)إلى كل عينة، عكس لإعادة تعليق الخرز أو مجموع الطين الحمض النووي الريبي واحتضان لمدة 5 دقيقة على الجليد. لا دوامة!
    3. إضافة 200 ميكرولتر من الكلوروفورم واحتضان لمدة 3 دقيقة على الجليد. ثم دوامة بدقة العينات.
    4. للمساعدة في فصل المرحلة، الطرد المركزي كحد أقصى. السرعة لمدة 10-15 دقيقة، 4 درجات مئوية.
    5. تسمية 1.5 مل أنابيب منخفضة الاحتفاظ(جدول المواد)وaliquot 650 ميكرولتر من ايزوبروبانول في كل.
    6. تأخذ بعناية المرحلة المائية العليا (حوالي 650 ميكرولتر) ونقل إلى الأنابيب المعدة مع isopropanol. تجنب لمس المرحلة العضوية الوردية.
    7. تعجل الجيش الملكي النيبالي بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: من المستحسن تخزين العينات في الأيزوبروبانول عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية وفقط حتى في الماء عند الحاجة. الحمض النووي الريبي مائي يتحلل حتى عند -80 درجة مئوية عند تخزينها لأسابيع / أشهر.
  2. هطول الأمطار الحمض النووي الريبي
    1. تبريد جهاز الطرد المركزي على سطح الطاولة إلى 4 درجات مئوية.
    2. إعداد جديدة 80٪ EtOH مع المياه الخالية من RNase وتهدئة عند -20 درجة مئوية (5 دقيقة في -80 درجة مئوية تساعد على تسريع العملية).
    3. طرد العينات بأقصى سرعة (حوالي 13000 × ز)لمدة 30 دقيقة والتخلص من supernatant. لن تكون بيليه مرئية ، حتى ماصة بعناية كما لو كان هناك. إضافة 1 مل من الباردة 80٪ EtOH وعكس أنبوب مرة أو مرتين.
    4. الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 30 دقيقة بأقصى سرعة وتكرار الغسيل إلى ما مجموعه اثنين من يغسل.
    5. تدور لأسفل لمدة 2 دقيقة وإزالة جميع EtOH المتبقية مع تلميح 10 μL. اترك البيليه ليجف لمدة 3-5 دقيقة (وليس أكثر) في درجة حرارة الغرفة وإعادة تعليقه في 20 ميكرولتر ماء خال من RNase.
    6. الحفاظ على العينات على الجليد وأداء مراقبة الجودة في أقرب وقت ممكن. المضي قدما لتخزين العينات في -80 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان.
  3. مراقبة الجودة باستخدام معدات مخصصة(جدول المواد)وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.

8- إعداد المكتبة

  1. cDNA التوليف والتضخيم مع SMARTer v4 الترا منخفضة المدخلات الحمض النووي الريبي كيت
    1. حساب تخفيف كل عينة لديها 1.5 نانوغرام من TRAP-RNA أو إجمالي الحمض النووي الريبي في حجم 4.75 μL. تنفيذ جميع ردود الفعل في أنابيب PCR وتمييع العينات مع aliquots الطازجة من المياه الخالية من RNase.
    2. تنفيذ جميع الخطوات وفقا لتوصيات الشركة المصنعة مع 1/2 وحدات التخزين رد الفعل. تضخيم cDNA مع دورات PCR 12-13.
    3. تنظيف PCR عن طريق إضافة 0.5 ميكرولتر من 10x العازلة الزل و 25 ميكرولتر من الخرز SPRI(جدول المواد). إذا تمت معالجة العديد من العينات العازلة lysis ويمكن أن تكون الخرز قبل مختلطة. تأكد من أن يتم تفريق الخرز بالتساوي قبل الأنابيب.
    4. المضي قدما في البروتوكول في مجلدات رد الفعل الكامل (17 ميكرولتر من المخزن المؤقت elution). لا تدع الخرز يجف لأكثر من 3 دقائق. يمكن إنقاذ العينات المجففة بشكل مفرط من خلال أوقات الحضانة المطولة.
    5. قياس تركيزات العينة مع مجموعة الحمض النووي Qubit HS.
      ملاحظة: يمكن أن تتسامح مجموعة SMARTer v4 مع إدخال 200 pg. لقد حصلنا على مكتبات في الحالات التي تعذر فيها تحديد قيم Qubit (أقل من 250 بيكوغرام، حد الكشف) مع PCR دورة 16. غير أن المواد المحدودة للمدخلات قد تسفر أيضا عن مكتبات أقل تعقيدا.
  2. تجزئة ومحول ربط PCR مع مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي Nextera XT
    1. تمييع cDNA بالماء الخالي من RNase للحصول على تركيز 200 بيكوغرام/ميكرولتر وماصة 1.25 ميكرولتر في أنبوب PCR.
    2. تنفيذ جميع الخطوات وفقا للشركة المصنعة مع 1/4 وحدات التخزين رد الفعل. تضخيم cDNA مع 12 دورات PCR ومحولات متوافقة للعينات التي تنتمي إلى تجمع تسلسل واحد. مع مجموعات مؤشر Illumina A و D تصل إلى 384 عينة يمكن مضاعفتها.
    3. لتنظيف PCR إضافة 12.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت إعادة التعليق و 22.5 ميكرولتر من الخرز SPRI (نسبة 0.9x). تلوّي العينة بـ 22 ميكرولتر من المخزن المؤقت الإلوطي.
      ملاحظة: تم تنفيذ مراقبة الجودة والتجميع من قبل شركة التسلسل(جدول المواد)وبالتالي لم تكن هناك حاجة إلى تطبيع يستند إلى النحل. رد فعل التجزئة الأنزيمية (tagmentation) حساسة جدا للمدخلات المادية كما كل إنزيم يقطع مرة واحدة فقط. لذلك، لا تتجاوز توصية التركيز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ولتقييم الجودة، ينبغي بحث الإجراء المذكور أعلاه في عدة خطوات وسيطة: التحقق من صحة نمط التعبير في بلانتا، ومراقبة جودة الحمض النووي الريبي المتعدد الخصائص المعزول، فضلا عن المكتبات النهائية. يمكن إجراء qRT-PCR باستخدام جينات علامة معروفة ، بالإضافة إلى ذلك ، لتأكيد الاستجابة لحالة العلاج أو لضبط الظروف التجريبية.

تحليل بؤري لتوزيع إشارة GFP
للتحقق من كل من أنماط التعبير endodermal و XPP ، قمنا بتحليل خطوط متجانسة من pELTP:: GFP-RPL18 و pXPP::GFP-RPL18 عن طريق المجهر confocal. الشكل2 والشكل 2B تظهر النباتات التمثيلية مع إشارات GFP (الأخضر) التي تم عكسها مع يوديد البوليد (أرجواني) لتحديد جدران الخلايا. يظهر المقطع العرضي في الشكل 2A1 حلقة متحدة المركز في طبقة الخلية الثالثة من الخارج ، والتي تتوافق مع endodermis. تبدأ إشارة GFP النهاية فوق المنطقة الميريستية(الشكل 2A2)وتظهر في كل من السيتوسول وحول نواة الخلايا ، والتي تتوافق مع الريبوسوم. في المقابل ، يعرض خط XPP قطبين متميزين ، والذي يتوافق مع XPP(الشكل 2B1). تبدأ ثلاث خلايا تقريبًا في كل قطب فوق المنطقة الميريستيماتية لعرض إشارة GFP. وهكذا، يمتثل كلا الخطين لنمط التعريب من endodermis وXPP، على التوالي(الشكل 2C)53.

التحقق من صحة POLYsome RNA
لتحديد نوعية الحمض النووي الريبي المتعدد التي تم الحصول عليها قمنا بإجراء قياسات مراقبة الجودة، وذلك باستخدام اثنين من أنظمة الكهرباء الآلي(جدول المواد)التي تعمل مع كميات مدخلات μL وأيضا حساب رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN)54. الخوارزمية الملكية بتعيين قيمة RIN بين 1 و 10 لكل تخطيط كهربي وهو مقياس قوي واستنساخ لجودة الحمض النووي الريبي (أي التدهور) - كلما انخفضت القيمة كلما كانت العينة أكثر تدهورًا. ويبين الشكل 3 أمثلة على القياسات التي حصلنا عليها من الحمض النووي الريبي المتعدد الأبعاد. معظم العينات تظهر بالكاد أي تدهور واضح مع قيم RIN تتراوح بين 9-10، وهو ما يتفق مع التقارير السابقة55،56. وأي معالجة غير سليمة، ولا سيما فترات درجات الحرارة المرتفعة المطولة (مثل درجة حرارة الغرفة) أو التلوث بالمناطق المحمية ستكون واضحة في هذه المرحلة. كلا الصكين أيضا حساب تركيزات العينة من الكهربية(الشكل 3A). هذه يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا ومعظمها في الحد الأدنى للكشف. ولذلك، فإننا ننصح باستخدام القياسات الفلورية لتحديد التركيزات بدقة.

مكتبة QC
نظرًا لأن معظم المختبرات لا تقوم بتسلسل الحمض النووي الريبي في المنزل ، غالبًا ما يتم تشغيل عناصر التحكم في الجودة في مرافق متخصصة مع أجهزة إنتاجية عالية(جدول المواد). وهي تقيّم بصورة روتينية الجودة وتقيس تركيزاتها بواسطة qPCR والمواد الفلورية(جدول المواد)لأن القياسات الدقيقة هي شرط أساسي لتجميع المكتبات. ومع ذلك ، إذا لم يتم الاستعانة بمصادر خارجية لإعداد المكتبة ، يمكن للمرء أن عينة النتيجة مع المعداتالمتخصصة (جدول المواد). ويبين الشكل 4 آثار المكتبات المعدة بنجاح مع بروتوكولنا الموصى به (A) ويسلط الضوء على متانة الإجراء على الرغم من أحجام ردود الفعل المنخفضة (B). يوضح الجزء C العينات دون المستوى التي يمكن أن تنتج عن الإفراط في/نقص التجزئة، وفقدان المواد أثناء تنظيف أو إزالة محول غير ناجحة. وفي الحالة الأخيرة، يمكن أن يساعد تنظيف آخر بنسبة عينة من خرات أكثر صرامة في القضاء على التلوث. كانت العينات الفاشلة تمامًا نادرة للغاية في أيدينا ويمكن أن تنشأ عند نقاط متعددة (على سبيل المثال ، مدخلات عالية جدًا لرد فعل التاقان المترانق).

ويتجلى أداء المكتبات المتسلسلة في الشكل 4دال للعينات من endodermis في خلفيتنا المتحولة. المكتبات من WT و / أو pericycle أداء مماثل أو حتى أفضل. كانت قراءات Riبوبال في المتوسط حوالي 2٪ مع عينات قليلة فقط فوق 3٪. قراءات مع متوسط درجة الجودة فوق 30 كانت باستمرار فوق 90٪ بالفعل قبل التصفية. وكانت قدرة رسم الخرائط للقراءات المتسلسلة عالية بنفس القدر في المتوسط عند 85٪. لتحديد الارتباط بين يكرر البيولوجية معاملات سبيرمان زوج احسبت لكل نقطة زمنية. أدت كافة الاختبارات إلى قيم معامل عالية.

استجابة العلاج وتحليل التخصيب
قبل إنتاج مجموعة بيانات تمتد عبر الجينوم، يمكن فحص TRAP RNA من تجربة تجريبية بواسطة qRT-PCR للتحقق من نجاح العلاج و / أو الظروف التجريبية. قمنا بإجراء هذا النوع من التحليل لتقييم استجابات الأوكسين بعد 2 ساعة من العلاج في عينات XPP(الشكل 5A). تم اختبار ثلاثة جينات مختلفة تستجيب للأوكسين (GH3.3 و LBD29 و GATA23) عبر طريقة Ct57. ولوحظ تحريض قوي جدا في جميع الحالات الثلاث بعد فترة الحضانة، مما يشير إلى أن تطبيق NAA الخارجي كان ناجحا.

وإذا استُخدم المروجون المطورون حديثاً، ينبغي أيضاً أن يقوم أحدهم في هذه المرحلة بتحليل التخصيب باستخدام qRT-PCR. ولهذه الغاية، يتم تضخيم جين علامة معروفة (أي الجين الذي يقوده المروج المستخدم) في TRAP وإجمالي مستويات عينة وتعبير الحمض النووي الريبي إلى مستوى الحمض النووي الريبي الكلي. إذا كان عزل الحمض النووي الريبي TRAP من الأنسجة المحددة ناجحة ينبغي الحصول على زيادة كبيرة في تغيير أضعاف. وبدلا ً من ذلك، يمكن استرجاع معلومات مكافئة من بيانات التسلسل (انظر الشكل 5باء). التعبير عن اثنين من الجينات المرتبطة بـ suberin، GPAT5 و HORST، موجود في جميع عينات endodermis وغائبة بشكل ملحوظ عن أنسجة XPP. على العكس من ذلك ، يتم التعبير عن الجينات المعبر عنها عن pericycle (PHO1 و SKOR) فقط بشكل منخفض جدًا في endodermis وغنية في تحقيقات XPP مع تنظيم أسفل ناجم عن الأوكسيين على الإطار الزمني المدروس.

Figure 2
الشكل 2: تعبير خاص بنوع الخلية لـ GFP-RPL18 في جذر Arabidopsis. أ-ب. صور المجهر Confocal من PELTP:: GFP-RPL18 (A) و pXPP:: GFP-RPL18 (B) التعبير عن الجذور في ستة أيام بعد الإنبات. تم الحصول على الخطوط العريضة لجدار الخلية من خلال تلطيخ مع يوديد البوليديوم (أرجواني). والمقطعان العرضيان A1 و B1 من المناصب المشار إليها بخطوط متقطعة في A2 و B2، على التوالي. تظهر الصور الأخيرة أقصى الإسقاطات (MAX) للأكوام z المسجلة. جيم - التمثيل التخطيطي لأنواع الأنسجة التي تتألف من جذر أرابيدوبزفي الطولي (C1) والمقطع العرضي (C3) وكذلك في الجذور الجانبية البرية (C2). تم تعديل الصورة بإذن من ف. بوشيه. أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: TRAP/ تقييم جودة الحمض النووي الريبي متعدد الأبعاد. A. Tapestation - نتائج تمثيلية من 14 عينة مقاسة في تمثيل صورة هلامية مع قيمRe الخاصة بهم (أعلى اليسار). يظهر تمثيل الكهربهيروجرام للعينة A1 (أبرزباللون الأزرق). الجدول على اليمين يعلم عن تركيزات العينة. ب. يتم الحصول على آثار مماثلة كما هو الحال في A مع محلل حيوي. تعرض الألواح الموجودة على اليمين عينات ذات مستويات متزايدة من التدهور، وهو ما يعكس في قيمها المتناقصة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: ملفات تعريف المكتبة من عينات TRAP/polysome. A. عينتين TRAP التمثيلية (يسار) تتوافق بشكل جيد جدامع آثار المكتبات الناجحة الموصى بها من قبل دليل المستخدم Nextera XT. ب. تنتج أحجام ردود الفعل المختلفة نتائج قوية لإعداد المكتبة. ج. المكتبات ذات النتائج دون المثلى: شظايا قصيرة جداً (أعلى اليسار)، شظايا طويلة للغاية (أسفل اليسار)، تركيز منخفض (أعلى اليمين) أو كاملة تفشل (أسفل اليمين). لاحظ أيضًا الأجزاء القصيرة المتبقية (القطع الناقص الأزرق) ، التي يجب إزالتها قبل التسلسل. محلل الحيوي: آثار حمراء، لاب تشيب: آثار زرقاء. D. مقاييس الجودة المختارة لعينات TRAP المتسلسلة (endodermis من متحولتنا الجانبية الخالية من الجذر) في نقاط زمنية مختلفة وتوزيع معاملات ارتباط سبيرمان المحسوبة بين مقارنات زوجية لجميع العينات ضمن نقطة زمنية (n = 65). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: qRT-PCR وRNA-seq تظهر استجابة الأوكسين وإثراء نوع الأنسجة، على التوالي. A. تم تقييم مستويات التعبير من ثلاثة جينات معروفة تستجيب للأوكسين بعد 2 ساعة من علاج الأوكسين عن طريق qRT-PCR. ولوحظ تحريض قوي في جميع العينات. تم إجراء RT-PCR على 3 نسخ بيولوجية مستقلة وتطبيعها إلى العينات غير المعالجة مع UBC21 كجين مرجعي داخلي. أشرطة الخطأ تمثل SEM. GH3.3: غريتشن هاغن 3.3, LDB29: الحدود الجانبية المجال 29, GATA23: غاتا عزر ملزمة عامل النسخ 23, UBC21: UBIQUITIN-اقتران انزيم 21 B. مستويات التعبير من أربعة جينات علامة من مجموعة بيانات TRAP-seq. العينات الموجودة على اليسار مشتقة من endodermis (ظلال خضراء) ، في حين أن العينات على اليمين مشتقة من XPP (ظلال زرقاء). الأرقام تمثل فترات حضانة الأوكسين بالساعات. تعكس الدرجات السالبة z مستويات التعبير المنخفضة والعكس بالعكس. يتم التعبير عن جينات علامة Endodermal(GPAT5، HORST)بشكل تفاضلي مع مستويات عالية في عينات endodermis. على العكس من ذلك ، علامات pericycle(PHO1، SKOR) لديها مستويات عالية من التعبير في خلايا XPP وتظهر أسفل التنظيم على علاج الأوكسين. GPAT5: الجلسرين-3-الفوسفات 2-O-acyltransferas (ساوبرين biosynthsis), هورست: هيدروكسيلاز من الأنسجة المسورة الجذر, PHO1: الفوسفات 1, SKOR: stelar K+ مصحح خارجي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: أنماط التعريب غير التأسيسية pUBQ10::GFP-RPL18. المجهر المحوري للشتلات التي يبلغ عمرها ستة أيام. تم الحصول على الخطوط العريضة لجدار الخلية من خلال تلطيخ مع يوديد البوليديوم (أرجواني). والمقطعان العرضيان A2 و C1 من المناصب المشار إليها بخطوط متقطعة في A3 و C2، على التوالي. تظهر الصور التي تم وضع علامة MAX أقصى إسقاطات لمكدسات z المسجلة. A1-A3. أنماط التعريب الموحدة للبناء المستند إلى UBQ10. B1-C2. انخفاض ملحوظ في قوة الإشارة في طبقات الأنسجة الخارجية. A، B و C مسجلة في ثلاثة مصانع مختلفة. أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التحقق من نمط تعريب RPL18
حاسمة لتجنب سوء تفسير البيانات من أي تجربة TRAP هو نمط التعبير السليم للوحدة الفرعية riبومال الموسومة. لذلك ، فإن دمج GFP كعلامة epitope إلى RPL18 يسمح بأناقة كبيرة بالتحقق من نمط التعبير المطلوب وعلى التوالي ، والسحب من الكسر المتعدد الأجزاء من نفس الأنسجة. يتبع جياو ومايرويتز 2010 النهج الأكثر توغلًا لضمان أنماط المروج المناسبة ، مما يتطلب تلطيخ GUS وفي Tian et al. 2019 الذي يعتمد على المناعة مع الأجسام المضادة المضادة للراية58،59.

ننصح بشدة بالتحقق من نمط التعريب في كل جيل حيث يمكن أن تكون الخطوط المعدلة وراثياً من T-DNA عرضة للإسكات وبالتالي يمكن أن تتدهور قوة الإشارة أو تنخفض نسبة البذور المعبرة. مع إدراج علامة GFP في البناء ، يتم تنفيذ هذه الضوابط المتكررة بسهولة عن طريق المجهر.

ومع ذلك، حتى التحليل الشامل المحوري يمكن أن يؤدي في بعض الحالات إلى استنتاجات خاطئة. نود أن نسلط الضوء على ذلك من خلال محاولتنا الفاشلة لإنتاج خط TRAP. حتى الآن ، لم يتمكن مجتمع علوم النبات من إنشاء خط نباتي مع توزيع موحد RPL18 في جميع طبقات الخلايا. حتى المروج 35S المستخدمة في البداية كان يعزى فقط لإظهار التوزيع "شبه التأسيسي" مع نمط توطين غير موحد10. كان نهجنا هو استخدام مروج UBIQUITIN10 (UBQ10)لدفع بناء GFP-RPL18. عرض في الجيل T1 تقدم توطين واعدة جدا، وبالتالي تم اختيار ليتم نشرها(الشكل 6A). ومع ذلك ، فإن بيانات تشغيل تسلسل الاختبار لم تظهر الإثراء في المقارنات بين ELTP- وخطوط UBQ10مدفوعة لجينات محددة معروفة endodermis. عند الفحص الدقيق لتلك النباتات ، وجدنا بالفعل انخفاضًا في الإشارة في طبقات الأنسجة الخارجية في حين أظهرت الأنسجة القوية تعبيرًا قويًا(الشكل 6B). يجب أن تبحث الدراسات المستقبلية في مشهد المروج عن مرشحين أكثر ملاءمة وأن تكمل طريقة TRAP.

مجموع الحمض النووي الريبي كعينة التحكم
ولا يزال إنشاء خط تحكم أفضل من خط التحكم TRAP معلقا، وسوف يتوقع هـو الميدان ذلك. مع أخذ هذا في الاعتبار ، حتى الآن الطريقة الوحيدة للحصول على توزيع موحد على نطاق الأنسجة من mRNAs هو جمع الحمض النووي الريبي الكلي. وكما هو الحال في هذه الحالة، يتم أخذ عينات من جهاز النسخ، فإن هذا الأمر يحتاج إلى أن يُحسب في تحليل المعلوماتية البيولوجية. وتجدر الإشارة إلى أن كلاً من الحمض النووي الريبي الكلي وكسور الحمض النووي الريبي المتعددة الأبعاد مترابطة الآن لأنها تنشأ من نفس عينة الأنسجة.

في البحث عن طريقة إعداد مكتبة TRAP
وكما ذُكر سابقاً، فإن أحد العيوب الرئيسية لنهج TRAP هو الغلة المتفاوتة والمنخفضة في معظمها التي يمكن تحقيقها. مع عينات تتراوح بين نانوغرام قليلة وأحيانا تصل إلى 100 نانوغرام نهج قياسي مع مجموعة Illumina TruSeq (100 نانوغرام شرط المدخلات) وحكم على أنها غير حساسة جدا لبناء مكتبات ذات نوعية كافية. وكشف بحث في السوق عن عدة مجموعات لإعداد المكتبات المتاحة تجاريا، تم تحديدها للعمل مع مواد بدء منخفضة لا يصل إلى 5-10 نانوغرام. لم نختبر البروتوكول الذي استخدمه رينوسو وآخرون 2019، والذي يعمل لعينات TRAP الخاصة بهم من الطماطم والأرز وميديساغو ويستخدم نهج BrAD-seq60.

ومع ذلك، فإن جميع تجاربنا، مع تسلسل الاختبارات اللاحقة، أسفرت عن نتائج غير مرضية. وعلى الرغم من استخدام خطوات إثراء البولي A، عانت عينات TRAP من تلوث اتّهاب عالية (تصل إلى 30% من القراءات). وعلاوة على ذلك، كان معدل نجاح إعداد المكتبة متغيراً ومنخفضاً بشكل خاص بالنسبة للعينات ذات التركيزات المنخفضة للغاية أو قيم RIN منخفضة نسبياً. لدينا اختبار واسع النطاق يقودنا إلى استنتاج، أن تكوين الحمض النووي الريبي محددة من عينة TRAP، مع محتوى rRNA عالية جدا ويفترض تركيزات مرنا دقيقة، يتطلب نهجا أكثر حساسية للحصول على مكتبات موثوق بها. وهكذا، انتقلنا إلى أحدث الحلول لكميات المدخلات منخفضة للغاية: SMARTer v4 و Nextera XT. مطمئنة، سونغ وآخرون أيضا وجدت هذا النهج إعداد المكتبة للتفوق منافسيهم عندما اختبروا عدة طرق وإخراجها التسلسل على أنسجة الكبد TRAPed61. مقاييس الجودة التي قدمناها في الشكل 4D معرض جودة عالية يقرأ (سؤال > 30) في انخفاض معدلات رسم الخرائط rRNA (<3٪ ) بالتزامن مع ارتفاع معدلات رسم خرائط الجينات. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر معاملات ارتباط سبيرمان عالية باستمرار أن النسخ المتماثل ة تحتوي بالفعل على ملفات تعريف تعبير مشابهة جدًا. وكان استخدام المجموعتين واضحا ً مع أرقام دورات متواضعة وأسفر عن نتائج قوية وموثوقة. وكانت بيانات التسلسل ذات جودة عالية مع 1.5 نانوغرام بدءا من المواد. مع مجموعة SMARTer التسامح منخفضة تصل إلى 200 pg المدخلات، يمكن تحسين كمية المواد بدء النبات. سيتم تحديد قابلية التطبيق لأنواع الخلايا النادرة في نهاية المطاف من خلال الجدوى لتراكم ما يكفي من الحمض النووي الريبي.

TRAP يكمل مجموعة أدوات علوم النبات
أصبحت طريقة TRAP تحظى بشعبية متزايدة مع علماء النبات34 ونحن واثقون من أنها ستكتسب حالة تقنية قياسية لعدة أسباب.

لا تحتاج أي من الخطوات في بروتوكول TRAP إلى معدات متخصصة ، مثل جهاز فرز الخلايا أو مجهر التقاط الليزر المخصص ، مما يجعل من الممكن للعديد من المختبرات إجراء التجارب. وحتى الآن، فإن أكثر العوامل تكلفة هي إعداد المكتبة وتسلسل هاونتي. ومع ذلك، ومع التقدم الدينامي لتقنيات التسلسل من الجيل التالي والطلب المتزايد على تسلسل الخلايا الواحدة، نتوقع أن تنخفض التكاليف بشكل كبير.

وعلاوة على ذلك، فإن عزل الـ RNAs المرتبطة بالبوليسوم يعني أن المعلومات تُجمع عن حالة الترجمة النشطة لتلك الـ RNAs (translateome). ولذلك، يلتقط TRAP إخراج جميع الخطوات التنظيمية التي هي المنبع من الترجمة ويمثل وكيل أكثر مباشرة لتكوين البروتين الخلوي. وبطبيعة الحال، لا تزال الريبوسوم المتوقفة والتعديلات النظرية بعد الترجمة بعيدة المنال وتحتاج إلى معالجة من خلال نُهج أخرى (مثل البروتيوميات).

كما ذكر سابقا ، ميزة واضحة أن TRAP في سياق النبات هو الحفاظ على هياكل الأسلحة الكيميائية والخصائص الميكانيكية للخلايا. كما نبدأ فقط في فهم الاتصالات المعقدة والوظائف التنظيمية التي تنشأ من خلال CW - والميكانيكية الإشارات31،62،والنهج التي تحافظ على هذه الهياكل تصبح أكثر أهمية في العديد من السياقات التنموية المختلفة.

خاصة بالنسبة للأنواع النموذجية الراسخة ، يمكن أن تستفيد TRAP من ثروة من المروجين المختلفين ، والتي تم وصفها. في Arabidopsis، كان من الممكن لذلك خريطة الجذر بأكمله بطريقة محددة نوع الخلية باستخدام 19 علامة مختلفة المروجين الجينات30،63. مع كل تجربة RNA-seq ، سيتم تحسين هذه التحديدات والجديدة ، وسوف تنشأ المروجين أكثر تحديدا وصقل القرار الخلوي.

TRAP ينطبق بالإضافة إلى ذلك في استخدام combinatorial مع العديد من المروجين لتجمعات الخلايا حيث لا توجد علامات معروفة حتى الآن. هذا هو الحال بالنسبة للخلايا المتخصصة في endodermis الجذر. تتميز خلايا المرور المزعومة بمعنى طبقة السبين التي تغطي خلايا endodermis الناضجة53. الجمع بين المروجين المناسبين واللاحقة في طرح سيليكو من ملامح التعبير متميزة سوف تثري للمناطق التي تؤوي خلايا المرور. تحليل المراسل النسخي سيساعد بعد ذلك في تحديد جينات علامة خلية المرور. ومع ذلك، ما إذا كان يمكن استخدام TRAP ثم تحليل عدد الخلايا النادرة على هذا الأساس يبقى أن يحدد.

في هذه المقالة، قدمنا وصفا مفصلا لطريقة التنقية التقاربية القابلة للترجمة والريبوسوم، ومزاياها وقيودها، وسلطنا الضوء على التطبيقات المحتملة لها. في محفظة دراسات "omics" ، تحتل مكانة هامة وستساعد على الإجابة على العديد من الأسئلة البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ونود أن نشكر جان كلود والسر من مركز التنوع الوراثي في زيوريخ على مشورة الخبراء الحاسمة في المرحلة المبكرة من هذا المشروع. تم دعم العمل في مختبر فيرمير من خلال منحة الأستاذية SNF (PP00P3_157524) ومنحة معدات R'EQUIP (316030_164086) من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNSF) الممنوحة لـ JEMV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterilization
bleach, 13% Sigma 71696
beaker VWR 214-1172/74/75
desiccator with porcelaine plate (DURAN) Sigma/Merck Z317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
HCl, 37% Roth 4625.1
Tween 20 Sigma P9416
Plate growth + harvesting
MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer Duchefa M0254
agar plant for cell culture Applichem/Panreac A2111.1000
DMSO Sigma D4540
forcepts Rubis Switzerland 5-SA model
KOH Fluka 60370
micropore/surgical tape 3M 1530-0
NAA Duchefa N0903
petri dishes 120x120 mm Greiner bio-one 688102
scalpel VWR/Swann-Morton 233-5454
tissues, neutral, two-layered any supplier of your choice
Immunoprecipitation
GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA Chromotek e.g. gtma-100
Brij-35 Sigma P1254-500G
centrifuge tubes (in accordance with centrifuge) Beckman Coulter 357001
Chloramphenicol Applichem C0378-25G
cotton gloves VWR 113-7355
Cycloheximide, HPLC grade Sigma 01810-1G
DEPC VWR E174 might have long delivery times
DTT Fluka 43815
EGTA Sigma 3054.3
homogenizers DUALL 23 KONTES GLASS CO (via VWR) SCERSP885450-0023 (set) SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times
Igepal CA-360 Sigma I3021-100ml
KCl Sigma 60130
MgCl2 hexahydrat Roth 2189.2
mortar and pestle VWR 470148-960 & 470019-978
PMSF Roche 10 837 091 001
Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE Sigma P2393-500G
RNase-free water Roth T143.3
RNAZap Thermo Fisher AM9780/AM9782 for cleaning surfaces
Tris, >99.3% Roth AE15.3
Triton X-100 Fluka T8787-250ml
Tween 20 Sigma P9416-100ml
RNA extraction
2-Propanol, p.a. Sigma 33539-1L-GL-R
Chloroform, HPLC grade Scharlau CL02181000
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml Eppendorf/Sigma Z666548-250EA LoBind
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy MiniElute Cleanup Kit Qiagen 74204
TRIzol reagent ThermoFisher/Ambion 15596018
Library preparation
15/50 mL Tube Magnetic Separator Abraxis PN 472250
AMPure beads Beckman Coulter A63881
Index Kit A Illumina FC-131-2001
Index Kit D Illumina FC-131-2004
neodymium magnets Amazon/other 6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)
Nextera XT kit Illumina FC-131-1024/1096 https://emea.support.illumina.com/
PCR strips ThermoScientific AB-0266
SMARTer v4 kit Takara Bioscience 634892 https://www.takarabio.com/
Bioanalyzer Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Tapestation Agilent 4200 Tapestation Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Fragment Analyzer Agilent 5400 Fragment Analyzer System specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
LabChip PerkinElmer LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
Qubit 4 Fluorometer ThermoFisher Q33239 specialized equipment for RNA/DNA concentration determination
qRT-PCR
GATA23 Microsynth fwd: AGTGAGAATGAA
AGAAGAGAAGGG;
rev: GTGGCTGCGAAT
AATATGAATACC
GH3.3 Microsynth fwd: CAAACCAATCCT
CCAAATGAC;
rev: ACTTATCCGCAA
CCCGACT
LBD29 Microsynth fwd: TCTCCAACAACA
GGTTGTGAAT;
rev: AAGGAGCCTTAG
TAGTGTCTCCA
UBC21 Microsynth fwd: TGCGACTCAGGG
AATCTTCT;
rev: TCATCCTTTCTT
AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR Green Bio-Rad #172-5270
iScript Adv cDNA Kit Bio-Rad #172-5038
miscellaneous
Falcon tubes 15 ml, Cellstar Greiner bio-one 188261
Falcon tubes 50 ml, Cellstar Greiner bio-one 210261
filter tips 1 ml Axygen TF-1000-R-S
filter tips 10 µl Axygen TF-10-R-S
filter tips 100 µl Axygen TF-100-R-S
filter tips 20 µl Axygen TF-20-R-S
filter tips 200 µl Axygen TF-200-R-S
microcentrifuge tubes 1.5 ml SARSTEDT 72.690.001
Propidium iodide Sigma P4170-100MG
sequencing company Novogene en.novogene.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Verk, M. C., Hickman, R., Corné, M. J., Pieterse, M., Van Wees, S. C. RNA-Seq: Revelation Of The Messengers. Trends In Plant Science. 18 (4), 175-179 (2013).
  2. Libault, M., Pingault, L., Zogli, P., Schiefelbein, J. Plant Systems Biology At The Single-Cell Level. Trends In Plant Science. 22 (11), 949-960 (2017).
  3. Mustroph, A., et al. Profiling Translatomes Of Discrete Cell Populations Resolves Altered Cellular Priorities During Hypoxia In Arabidopsis. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 106 (44), 18843-18848 (2009).
  4. Karve, R., Iyer-Pascuzzi, A. S. Digging Deeper: High-Resolution Genome-Scale Data Yields New Insights Into Root Biology. Current Opinion In Plant Biology. 24, 24-30 (2015).
  5. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A Multiple Ribosomal Structure In Protein Synthesis. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 49 (1), 122-129 (1963).
  6. Gautam, V., Sarkar, A. K. Laser Assisted Microdissection, An Efficient Technique To Understand Tissue Specific Gene Expression Patterns And Functional Genomics In Plants. Molecular Biotechnology. 57 (4), 299-308 (2015).
  7. Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Fluorescence Activated Cell Sorting Of Plant Protoplasts. Journal of Visualized Experiments. (36), e1673 (2010).
  8. Deal, R. B., Henikoff, S. The Intact Method For Cell Type-Specific Gene Expression And Chromatin Profiling In Arabidopsis Thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56-68 (2011).
  9. Dougherty, J. D. The Expanding Toolkit Of Translating Ribosome Affinity Purification. The Journal of Neuroscience: The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 37 (50), 12079-12087 (2017).
  10. Mustroph, A., Juntawong, P., Bailey-Serres, J. Isolation Of Plant Polysomal mRNA By Differential Centrifugation And Ribosome Immunopurification Methods. Methods in Molecular Biology. 553, 109-126 (2009).
  11. Matsushima, W., et al. SLAM-ITseq: Sequencing Cell Type-Specific Transcriptomes Without Cell Sorting. Development. 145 (13), (2018).
  12. Basnet, H., et al. Flura-Seq Identifies Organ-Specific Metabolic Adaptations During Early Metastatic Colonization. Elife. 8, (2019).
  13. Rodriques, S. G., et al. Slide-Seq: A Scalable Technology For Measuring Genome-Wide Expression At High Spatial Resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  14. Fazal, F. M., et al. Atlas Of Subcellular RNA Localization Revealed By Apex-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  15. Slane, D., Bayer, M. Cell Type-Specific Gene Expression Profiling Using Fluorescence-Activated Nuclear Sorting. Plant Gene Regulatory Networks: Methods And Protocols. Kaufmann, K., Mueller-Roeber, B. , Springer. New York, NY. 27-35 (2017).
  16. Zanetti, M. E., Chang, I. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification Of Polyribosomal Complexes Of Arabidopsis For Global Analysis Of Gene Expression. Plant Physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
  17. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome Profiling: Methods For Genome-Scale Analysis Of mRNA Translation. Briefings In Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2016).
  18. Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome Analysis And RNA Purification From Sucrose Gradients. RNA: Methods And Protocols. Nielsen, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 293-309 (2011).
  19. Heiman, M., et al. A Translational Profiling Approach For The Molecular Characterization Of Cns Cell Types. Cell. 135 (4), 738-748 (2008).
  20. Halbeisen, R. E., Scherrer, T., Gerber, A. P. Affinity Purification Of Ribosomes To Access The Translatome. Methods. 48 (3), 306-310 (2009).
  21. Thomas, A., et al. A Versatile Method For Cell-Specific Profiling Of Translated mRNAs In Drosophila. Plos One. 7 (7), e40276 (2012).
  22. Watson, F. L., et al. Cell Type-Specific Translational Profiling In The Xenopus Laevis Retina. Developmental Dynamics. 241 (12), 1960-1972 (2012).
  23. Lam, P. Y., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility In Zebrafish. Plos One. 8 (12), e84436 (2013).
  24. Fang, Y., et al. Translational Profiling Of Cardiomyocytes Identifies An Early Jak1/Stat3 Injury Response Required For Zebrafish Heart Regeneration. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
  25. Mustroph, A., Zanetti, M. E., Girke, T., Bailey-Serres, J. Isolation And Analysis Of mRNAs From Specific Cell Types Of Plants By Ribosome Immunopurification. Methods In Molecular Biology. 959, 277-302 (2013).
  26. Monshausen, G. B., Gilroy, S. Feeling Green: Mechanosensing In Plants. Trends In Cell Biology. 19 (5), 228-235 (2009).
  27. Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be More Specific! Laser-Assisted Microdissection Of Plant Cells. Trends In Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
  28. Sheen, J. Signal Transduction In Maize And Arabidopsis Mesophyll Protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
  29. Datta, S., et al. Laser Capture Microdissection: Big Data From Small Samples. Histology And Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  30. Birnbaum, K., et al. A Gene Expression Map Of The Arabidopsis Root. Science. 302 (5652), 1956 (2003).
  31. Hamant, O., Haswell, E. S. Life Behind The Wall: Sensing Mechanical Cues In Plants. BMC Biology. 15 (1), 1354 (2017).
  32. Vragović, K., et al. Translatome Analyses Capture Of Opposing Tissue-Specific Brassinosteroid Signals Orchestrating Root Meristem Differentiation. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 923-928 (2015).
  33. Wang, Y., Jiao, Y. Translating Ribosome Affinity Purification (Trap) For Cell-Specific Translation Profiling In Developing Flowers. Methods In Molecular Biology. 1110, 323-328 (2014).
  34. Sablok, G., Powell, J. J., Kazan, K. Emerging Roles And Landscape Of Translating mRNAs In Plants. Frontiers in Plant Science. 8, 1443 (2017).
  35. Ron, M., et al. Hairy Root Transformation Using Agrobacterium Rhizogenes As A Tool For Exploring Cell Type-Specific Gene Expression And Function Using Tomato As A Model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
  36. Reynoso, M. A., et al. Evolutionary Flexibility In Flooding Response Circuitry In Angiosperms. Science. 365 (6459), 1291-1295 (2019).
  37. Dolan, L., et al. Cellular Organisation Of The Arabidopsis Thaliana Root. Development. 119 (1), 71 (1993).
  38. Ristova, D., Barbez, E. Root Development. , Springer. New York, NY. (2018).
  39. Shekhar, V., Stӧckle, D., Thellmann, M., Vermeer, J. E. M. The Role Of Plant Root Systems In Evolutionary Adaptation. Current Topics in Developmental Biology. 131, 55-80 (2019).
  40. Malamy, J. E., Benfey, P. N. Down And Out In Arabidopsis: The Formation Of Lateral Roots. Trends in Plant Science. 2 (10), 390-396 (1997).
  41. de Smet, I., et al. Bimodular Auxin Response Controls Organogenesis In Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 107 (6), 2705-2710 (2010).
  42. Péret, B., et al. Arabidopsis Lateral Root Development: An Emerging Story. Trends In Plant Science. 14 (7), 399-408 (2009).
  43. Vilches-Barro, A., Maizel, A. Talking Through Walls: Mechanisms Of Lateral Root Emergence In Arabidopsis Thaliana. Current Opinion in Plant Biology. 23, 31-38 (2015).
  44. Porco, S., et al. Lateral Root Emergence In Arabidopsis Is Dependent On Transcription Factor Lbd29 Regulation Of Auxin Influx Carrier Lax3. Development. 143 (18), 3340-3349 (2016).
  45. Stoeckle, D., Thellmann, M., Vermeer, J. E. Breakout-Lateral Root Emergence In Arabidopsis Thaliana. Current Opinion in Plant Biology. 41, 67-72 (2018).
  46. Banda, J., et al. Lateral Root Formation In Arabidopsis: A Well-Ordered Lrexit. Trends in Plant Science. 24 (9), 826-839 (2019).
  47. Vermeer, J. E. M., et al. A Spatial Accommodation By Neighboring Cells Is Required For Organ Initiation In Arabidopsis. Science. 343 (6167), 178-183 (2014).
  48. Vanneste, S., et al. Cell Cycle Progression In The Pericycle Is Not Sufficient For Solitary Root/Iaa14-Mediated Lateral Root Initiation In Arabidopsis Thaliana. The Plant Cell. 17 (11), 3035-3050 (2005).
  49. Marques-Bueno, M. M., et al. A Versatile Multisite Gateway-Compatible Promoter And Transgenic Line Collection For Cell Type-Specific Functional Genomics In Arabidopsis. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology. 85 (2), 320-333 (2016).
  50. Shimada, T. L., Shimada, T., Hara-Nishimura, I. A Rapid And Non-Destructive Screenable Marker, Fast, For Identifying Transformed Seeds Of Arabidopsis Thaliana. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology. 61 (3), 519-528 (2010).
  51. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral Dip: A Simplified Method For Agrobacterium Mediated Transformation Of Arabidopsis Thaliana. The Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
  52. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method For High-Throughput Sterilization Of Arabidopsis Seeds. Journal Of Visualized Experiments. (128), e56587 (2017).
  53. Andersen, T. G., et al. Diffusible Repression Of Cytokinin Signalling Produces Endodermal Symmetry And Passage Cells. Nature. 555, 529-533 (2018).
  54. Schroeder, A., et al. The Rin: An Rna Integrity Number For Assigning Integrity Values To Rna Measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  55. Vragović, K., Bartom, E., Savaldi-Goldstein, S. Quantitation Of Cell Type-Specific Responses To Brassinosteroid By Deep Sequencing Of Polysome-Associated Polyadenylated RNA. Methods in Molecular Biology. 1564, 81-102 (2017).
  56. Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. Trap-Rc, Translating Ribosome Affinity Purification From Rare Cell Populations Of Drosophila Embryos. Journal Of Visualized Experiments. (103), e52985 (2015).
  57. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis Of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR And The 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  58. Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-Type Specific Analysis Of Translating Rnas In Developing Flowers Reveals New Levels Of Control. Molecular Systems Biology. 6, 419 (2010).
  59. Tian, C., et al. A Gene Expression Map Of Shoot Domains Reveals Regulatory Mechanisms. Nature Communications. 10 (1), 141 (2019).
  60. Townsley, B. T., Covington, M. F., Ichihashi, Y., Zumstein, K., Sinha, N. R. Brad-Seq: Breath Adapter Directional Sequencing: A Streamlined, Ultra-Simple And Fast Library Preparation Protocol For Strand Specific mRNA Library Construction. Frontiers in Plant Science. 6, 366 (2015).
  61. Song, Y., et al. A Comparative Analysis Of Library Prep Approaches For Sequencing Low Input Translatome Samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
  62. Basu, D., Haswell, E. S. Plant Mechanosensitive Ion Channels: An Ocean Of Possibilities. Current Opinion in Plant Biology. 40, 43-48 (2017).
  63. Brady, S. M., et al. A High-Resolution Root Spatiotemporal Map Reveals Dominant Expression Patterns. Science. 318 (5851), 801 (2007).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 159، Arabidopsis، TRAP، TRAP-seq، التنميط الترجمة، خلية نوع محددة RNA-seq، تشكيل الجذر الجانبي، التمايز endodermis
ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) للتحقيق في تطوير جذر <em>Arabidopsis thaliana</em> على مقياس نوع الخلية الخاصة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thellmann, M., Andersen, T. G.,… More

Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale. J. Vis. Exp. (159), e60919, doi:10.3791/60919 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter