Summary
リボソームアフィニティー精製(TRAP)を翻訳すると、臓器や組織の最小限の処理で開発プログラムを解剖する可能性があります。このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識リボソームサブユニットを標的とした細胞から高品質のRNAを生成します。qRT-PCR や RNA-seq などのダウンストリーム解析ツールは、組織および細胞の種類特異的発現プロファイルを明らかにします。
Abstract
本稿では、リボソーム親和精製(TRAP)法と連続して最適化された低入力ライブラリ調製を通じて、異なるシロイヌナナの根細胞型から翻訳データを取得するための実践的な指示を与える。
原料として、適切なプロモーターを用いることで、細胞型特異的な方法でGFPタグリボソームタンパク質RPL18を発現する植物ラインを採用しています。免疫精製とRNA抽出の前に、組織は凍結され、組織の完全性を維持し、同時に高い時間分解能で時系列研究を実行することができます。特に、細胞壁構造はそのまま残っており、これは、異なる細胞集団を単離するために組織をプロトパロントに依存する蛍光活性化細胞選別ベースのアプローチのような代替手順の大きな欠点である。さらに、レーザー捕捉マイクロ解剖ベースの技術のように組織固定は必要なく、高品質のRNAを得ることができます。
しかし、細胞の亜集団からのサンプリングと、ポリソーム関連RNAの単離のみがRNAの収量を著しく制限します。したがって、RNA-seqによるデータ取得を成功させるためには十分に感受性の高いライブラリ調製方法を適用する必要がある。
TRAPは、多くの発達プロセスが細胞壁関連および機械的シグナル伝達経路を伴うため、植物研究に理想的なツールを提供します。特定の細胞集団を標的とするプロモーターの使用は、臓器と単一細胞レベルの間のギャップを埋めており、その結果、解像度の低下や非常に高いコストに苦しんでいます。ここでは、トラップを適用して、横根形成における細胞細胞通信を研究する。
Introduction
次世代シーケンシング技術の応用の増加によって、発生生物学における空間分解能が増強される可能性があります。現代の研究は、単一細胞レベル,,1、2、3、42ではないにしても、特殊な細胞タイプに組織1を解剖することを目的としています。34この処理のために、過去 50 年間に多数の異なる方法が考案されています (図1A)5、6、,7,、8 、9、109、11、12、13、1414、15.
植物科学の多くのツールは、動物研究で開拓された技術の適応されています。これは、ここで詳しく紹介する方法には当てはまらない。2005年、タンパク質翻訳の強力な背景を備えたBailey-Serres Labは、その後の親和性精製のためにリボソームタンパク質の設計に着手しました。したがって、スクロース勾配を有する超遠心分離に基づく時間と労力を要するポリソームプロファイリングを回避することができ、1960年代17、18,18年以来リボソームの翻訳を評価するために使用された。この方法は、その後、翻訳リボソーム親和性精製(TRAP)16と呼ばれている。植物の翻訳研究に成功した後、Heimanらの動物19と他の人のためのTRAPを適応させた酵母20、ショウジョウバエ21、ゼノプス22およびゼブラフィッシュ23、24,24への応用を拡張した。
モデルシステムの遺伝子改変はTRAPの前提条件であり、その適用を遺伝的変換に適した種に限定しますが、この異議を、特別な関心を持ち、無傷の組織/器官25から分離することが非常に困難な細胞のサブセット(例えば、マウス脳内の高度に分岐した樹状細胞または感染した植物組織の真菌性催眠細胞)に同時に利用することができます。植物では、全ての細胞が、静水性骨格26の基礎となる細胞壁を介して所定の位置に保持される。このマトリックスから植物細胞を解放するために、科学者たちはレーザー捕捉マイクロディション(LCM)27を介して周囲の組織から細胞を物理的27に切断するか、または細胞壁28の酵素消化を行った。後者の細胞の中でも、いわゆるプロトプラストは、目的の集団が蛍光標識され、蛍光活性化細胞選別(FACS)7を介して分離することができる7。LCMは通常、試料を固定してワックスに埋め込む必要があり、最終的にはRNA29の品質が低下する。FACSベースの方法は高品質のRNAを生み出すが、プロプロトバテナのプロセス自体が遺伝子発現30の違いを導入し、改変された厚い二次細胞壁を有する組織は治療が困難であると悪名高い。さらに、植物における多くの発達過程は機械的に伝達される信号に依存すると仮定され、したがって細胞壁の完全性は最も重要である31。核のレベルで動作することによって細胞単離を回避するためのショートカットを使用する2つの方法は、蛍光活性化核選別(FANS)および特定の細胞タイプ(INTACT)でタグ付けされた核の単離である。TRAPのように、彼らは細胞型特異的プロモーターを使用して核をマークし、その後、並べ替えまたはプルダウンを介して濃縮され、それぞれ8,8、15。これらすべてのアプローチの主要な課題は、組織中の細胞のサブセットから十分なRNA材料を得るということです。TRAP は細胞RNAのほんの一部しか捕捉しなかね、サンプル収集は大きなボトルネックです。したがって、特に、低入力量から高品質のデータを生成するためには、機密性の高いライブラリ準備プロトコルが必要です。
その設立以来、TRAPはDNAマイクロアレイと組み合わせて使用されているか、または、シーケンシングコストが近年大幅に低下したため、RNA-seq1010、32、3332,33が使用されている。Sablokら34でレビューされた多数の研究の質問が既に解明されています。我々は、特定の細胞タイプを標的に異なるプロモーターを組み合わせる場合、この技術は非常に汎用性が高いため、今後数年間でより多くの報告が続くと確信しています。最終的には、これは誘導可能な方法でも行われ、多くの生物的および無生物的ストレス要因に対する植物の反応を調査することと組み合わされる可能性があります。さらに、安定したトランスジェニックラインが利用できないところでは、毛深い根発現系もトマトおよびメディカゴ35,36,36でTRAPを行うためにもうまく使用されている。
図1:リボソームアフィニティー精製(TRAP)の翻訳は、「オミックス」分析ポートフォリオを補完します。A.分析精度のレベルを上げると、単一細胞または細胞内の分解能まで、多くの方法またはそれらの組み合わせによって達成できます。このスキームは、植物および動物分野で現在利用可能なツールの概要を示します。細胞分解能での組織の収集は、LCMやFACSのようなプロトコルによって達成され、標準のトランスクリプトームまたはポリソームプロファイリング/翻訳分析に結合されます。TRAPとINTACTは、エピトープタグに基づいているため、組織捕捉とRNAの分離の両方を統合します。しかしながら、INTACTサンプルは細胞核のみを構成し、したがって、トランスクリプトーム分析の特別な場合を構成する。小さなウサギのアイコンは、動物分野で新たに開発された方法を示しています:SLAM-ITseqとFlura-seqは、寛容な酵素を発現する細胞内の改変ウラシル塩基を持つ新生RNAの代謝ターゲッティングに依存していますが、Slide-seqは、細胞範囲内の位置情報を提供するDNAバーコード付きコーティングガラススライドを使用しています。特定の細胞内区画で RNA をサンプリングするために、APEX-seq では近接標識アプローチが続きます。特に、分解能の向上にはトランスジェニック材料(アスタリスク)の生成が必要なことが多く、モデル種に対してこれらの方法が主に使用される。TRAPは、細胞壁(CW)やメカニックシグナリング、およびCWマトリックスから放出することが困難な細胞種を含む植物科学研究に特に適しています。B. TRAP手順の詳細なウェットラボステップ:異なる細胞タイプ(例えば根内胚葉)でGFPタグ付きリボソームタンパク質を発現する苗は、7日間ペトリ皿で栽培され、根材料はスナップ凍結によって収穫される。全RNA制御サンプルは、遠心分離によって破片をペレットする前に、均質化された粗抽出物から収集されます。磁性抗GFPビーズをクリアした抽出物に添加して、免疫沈降を行います。インキュベートと3つの洗浄工程の後、ポリソーム関連RNA(TRAP/ポリソームRNA)はフェノール-クロロホルム抽出を介して直接得られます。LCM:レーザーキャプチャマイクロディスセクション、FACS/ファン:蛍光活性化細胞/核選別、 APEX-seq:工学的アスコルビンペルオキシダーゼに基づく方法、INTACT:特定の細胞型にタグ付けされた核の単離、SLAM-ITseq:チオール(SH)結合アルキル化組織中のRNAの代謝シーケンシングに対する、Flura-seq:フルオロシル標識RNAシーケンシング(フルオロシル標識RNAシーケンシング Biorender.com)をクリックしてください。
この記事の目的は、TRAP メソッドの詳細な説明を提供し、重要な手順を強調し、可能なライブラリ準備方法のガイダンスを提供することです。
一般的なTRAP実験は、基本的に次のステップで構成されます(図1Bも参照):(1)リボソームタグ構造のクローニング、トランスジェニックラインの生産と選択、種子の成長と増量、ストレス適用/処理(オプション)および組織収穫を含む植物材料の調製。(2)粗抽出物の組織均質化および除去、ビーズ洗浄および免疫精製、および洗浄工程を含む免疫精製;(3) RNA抽出および品質評価(4)図書館の準備。
シロイヌナズナルートは、モデルプラント37,38として導入されて以来、38植物開発を研究するモデルシステムとなっています。ここでは、TRAPの適用は植物側面根開発の文脈で紹介される。植物では、全体の根系の蓄積は、このプログラムの実行に依存し、したがって、生物の生存のために非常に重要である39.シロイヌナズナシスでは、横根はxylem血管の隣に存在するペリサイクル組織に由来し、したがってxylem極ペリサイクル(XPP;図2Cを参照)40と呼ばれます。根の奥深くに位置する一部のXPP細胞は、創始者の細胞の同一性を獲得し、局所ホルモンの引き金に基づいて、反クリン41を腫脹して分裂させることによって増殖し始める。しかし、硬質細胞壁マトリックスの存在により、このプロセスは周囲の組織に機械的なストレスを与えます。特に、上方の内皮は、根根成長軸42、43、44,43,の邪魔であるように影響を受ける。実際、新たに形成されたプリモジウムは、上層の内皮細胞(図2C2)を介して成長する必要がありますが、皮質および表皮細胞は、プリモジウムが最終的に45、46,46を出現させるために脇に押し出されるだけです。私たちの研究室での最近の研究は、内皮が積極的にペリサイクルの増殖に対応するために貢献していることを示しています。内皮ホルモンシグナル伝達の標的遮断は、XPP細胞47における非常に最初の分裂を阻害するのに十分である。したがって、ペリサイクル-子宮内皮通信は、シロイヌナズナの横根開発のための非常に初期のチェックポイントを構成する。しかし、このクロストークがどのように行われるかは分かっていません。この謎を解明するために、XPP細胞と内皮細胞を標的とするTRAP-seqアプローチを選択しました。横根プログラムの細胞を濃縮するために、オーキシンアナログ(1-ナフタレ酢酸、NAA)48を外因的に適用することによってホルモントリガーを模倣し、同時に側根形成の48初期段階を時間的に解決することを可能にした。
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Protocol
トランスジーン、トランスジェニックラインの生産と選択の1
- 適切なエントリーベクターで選択したプロモーターをクローン化する。再結合ベースのクローニング法(材料表)を使用し、pDONRP1-P249で再結合ベースのクローニングを使用してpDONRP4-P1r.クローンRPL18(アフィニティータグまたは蛍光タンパク質を選択した)でプロモーターを再結合する。
- RPL18を含むエントリベクターを2フラグメント再結合反応でプロモーター含有エントリベクターと組み合わせて、FAST-赤色選択カセット50を用いて適切な先行ベクトルに入り、トランスジェニック種子の直接選択を容易にする。
- シーケンスによって再結合されたベクターを検証し、適切な、有能なアグロバクテリアに変換します。花ディップシロイヌナズナズの植物と3-4週間の収穫後、T1種子51を選択します。
- 顕微鏡を使用して、よく発現するラインを識別し、複数の独立したラインで報告されたプロモーター活性に従って発現パターンを検証します。単一のT-DNA挿入を有する代表的な発現パターンを示す線を選択する。これは、サイレンシングを最小限に抑えるのに役立ち、遺伝的十字架に有利になります。
- マーカー遺伝子にホモ接合性のT3子孫を選択します。
2. 伝播と殺菌
- 細胞型特異的TRAPは、根当たりの限られた数の標的細胞からRNAを単離する。必要な出発材料を生成するには、ホモ接合線を伝搬する。この実現のために、真菌の成長制御に特に焦点を当てた標準的な成長条件を使用してください。
注: 単一の挿入ラインが得られない場合は、T-DNAによる世代経過サイレンシングを避けるために、数世代にわたって集団の大きい集団でバッチを増やしてください。 - 塩素ガス1ラウンドと70%EtOHの1ラウンドで大量のシロイヌナズナの種子を殺菌します。
- 12 cm x 12 cmの正方形のペトリ皿(0.3 mLシード/プレート未満)に種子を均等に広げ、デシケータまたは他の適切な容器に積み重ねてください。種子はガスにアクセス可能である必要がありますので、塊やヒープの形成を避けてください。報告された漂白剤とHClの容積で一晩ガス滅菌を行う52: 100 mL の漂白剤 (13%)60 L デシケータで 6 mL のコンク. HCl を使用します。種子を滅菌容器に集める前に少なくとも1時間脱脂する。
注意: 37% HCl は腐食性が高く、慎重な取り扱いが必要です。塩素ガスは有毒であり、ヒュームフードを使用してください。 - 1皿あたり0.1mLの乾燥したガス滅菌種子を取り、室温で殺菌溶液(70%EtOH、0,01%Tween)と混合します。20分間インキュベートし、EtOHをデカントし、滅菌H2Oで種子を3〜4回洗浄します。
- 浸した種子を50 mLチューブに移し、無菌0.1%寒天で希釈し、プレートあたり1mLのインビシードスラリー(0.1 mLシード/1 mLスラリー)を得ます。
注:トランスジーン統合イベントにより、植物ラインは異なる殺菌技術の影響を受けやすい可能性があります。特にEtOHインキュベーション時間が重要であることが判明した。私たちの手では、実験中に真菌汚染を避けるために二重殺菌ステップが必要でした。これは、単一のタイム ポイントの汚染が実験全体を妨げるため、時系列を実行する場合に特に重要です。地元の成長条件によっては、二重殺菌が必ずしも必要でない可能性があります。
- 12 cm x 12 cmの正方形のペトリ皿(0.3 mLシード/プレート未満)に種子を均等に広げ、デシケータまたは他の適切な容器に積み重ねてください。種子はガスにアクセス可能である必要がありますので、塊やヒープの形成を避けてください。報告された漂白剤とHClの容積で一晩ガス滅菌を行う52: 100 mL の漂白剤 (13%)60 L デシケータで 6 mL のコンク. HCl を使用します。種子を滅菌容器に集める前に少なくとも1時間脱脂する。
3. めっき
- これらの手順を事前に準備します。実験に必要な量(サンプル/タイムポイントあたり20〜30)に1/2 MSプレート(pH 5.8)を1%寒天で注ぎます。1 mL ピペットチップをカットして、先端径をカミソリの刃で 3~4 mm に拡大します。ヒントをオートクレーブします。正方形のペトリ皿の蓋でプレートごとに3列の種子をめっきするためのテンプレートホルダーを作成します。無菌作業環境を提供するために層流フードを準備し、処理するプレートにラベルを付けます。
注: 同時に多数のプレートを処理すると、ラベルが色付きの場合は、ラベルの表示速度が速くなります。 - 空の寒天プレートをテンプレートホルダーに入れ、1 mLのインビベッド種子を3列に均等に分配します。加工されたプレートを積み重ねて、種子が乾燥するまで積層流に入れます(すなわち、寒天表面に貼り付けます)。寒天も乾燥するので、プレートを長く放置しないでください。
- 種子が十分に乾燥したら、蓋を閉め、マイクロポアテープで各プレートを密封します。暗闇の中で4°Cで2日間種子を成層させ、その後、成長室に入れます。
4. 組織治療(オプション)
注:このプロトコルでは、合成オーキシン変異体NAAを用いたシロイヌナズナの根の外因性治療の概要を説明します。手元の実験問題に応じて、この部分を調整するか、完全に省略する必要があります。
- 高さ1.5~2cm、長さ10cmのティッシュペーパーを用意します。延長インキュベーション時間は、使用前に組織をオートクレーブする必要があります。
- ホルモン治療を受けなければならないすべてのプレートからマイクロポアテープを取り除きます。1lの液体に10mM NAA(DMSOに溶解)の1 mLを希釈し、1/2MS溶液(pH 5.8)をオートクレーブし、溶液(10 μM NAA)にティッシュペーパーを浸します。
- ピンセットを使用して、根の各列にティッシュペーパーを塗布します。指を軽く使って気泡を取り除きます。プレートから余分な液体を空にし、蓋を閉じ、時間でプレートにラベルを付けます。延長インキュベーション時間の場合は、プレートを成長チャンバーに戻します。
5. 収穫
- 各生物学的複製/タイムポイント/治療のためのプレートを取得します。異なる組織サンプルのためのきれいなデュワーの容器およびラベル管(15または50 mL)の液体窒素を集める。発泡スチロールホルダーを準備します。
注意:液体窒素処理手順(通気、凍傷、爆発する可能性のあるチューブ)に精通してください。 - プレートを開き、鉗子でティッシュペーパーを取り除き、寒天表面から根を取り外さないことに注意してください。外科用ブレードを使用して、1つの決定されたストロークでシュートルートジャンクションに沿って1行に1回カットします。サンプル間のブレードを清掃し、頻繁に交換して、シャープネスを保証します。
- ピンセットを使用して、各行のルートに沿ってスワイプして、3つのバンドルでそれらを収集します。根をつかんで、液体窒素で満たされた50 mLチューブに空にして凍結します。
注:次のステップでは、根を粉砕するのが難しいため、根を密な構造(ボールなど)に組み立てないでください。 - 1つのサンプルを構成するすべてのプレート(インキュベーション時間の順)を進め、余分な液体窒素を注ぎます。チューブの蓋を使用して、根がこぼれないようにします。その後、蓋を閉じて、デュワー船内のすべてのチューブを収集します。根組織を-80°Cに保存します。
6. 免疫精製
注:このステップは、高品質のTRAP/ポリソームRNAを得ることを目的としています。したがって、RNAの取り扱いのための良い習慣のアドバイスに厳密に従ってください。滅菌ベンチでこのセクションのすべての手順を実行し、RNase除去ソリューション(材料表)ですべての機器とラボウェアをクリーニングします。手袋を着用し、サンプル、氷、または洗浄されていない他のソースで汚染された場合は、すぐにそれらを変更します。これは非常に重要な側面であるため、廃棄物処理のアドバイスと一緒に機器の再利用に関するセクションが含まれています。
- バッファ準備
- 表1およびオートクレーブ(A)またはフィルター滅菌(※)に従ってストック溶液を準備する。特に指定がない限り、溶媒はRNaseフリー水である。
- ジチオトレイトール(DTT)、フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)、シクロヘキシミド(CHX)およびクロラムフェニコール(CAM)を表1に示すようにそれぞれの溶媒に溶解し、-20°Cで保存する。他のすべての在庫は室温のままでいることができます。
- ストックを、洗浄バッファー(WB)用の成分1~4、ポリサム抽出バッファー(PEB)用の1~6の成分で事前に混合し、抽出前に時間のかかるバッファー混合を回避します。したがって、抽出日に水と冷凍成分(7-10)のみを添加する。事前混合ストックとRNaseフリーの水を4°Cに保ちます。
注:DTT濃度は、GFPとのナネnobody相互作用が高DTT濃度に敏感であるため、2005年に報告された濃度の1/5です。
| 成分 | 在庫集中 | WB* の 50 mL の mL にボリュームを追加します。 | PEB* の 50 mL の mL にボリュームを追加します。 | ||
| 1 | トリス、pH 9 | A | 2 M | 5 | 5 |
| 2 | Kcl | A | 2 M | 5 | 5 |
| 3 | EGTA | A | 0.5 M | 2.5 | 2.5 |
| 4 | MgCl2 | A | 1 M | 1.75 | 1.75 |
| 5 | Pte | A | 20% (v/v) | 0 | 2.5 |
| 6 | 洗剤ミックス | A | 0 | 2.5 | |
| トゥイーン 20 | 20% (v/v) | ||||
| トリトンX 100 | 20% (v/v) | ||||
| ブリジ-35 | 20% (w/v) | ||||
| イゲパル | 20% (v/v) | ||||
| 7 | Dtt | ₳ | 0.5 M | 0.1 | 0.1 |
| 8 | PMSF | ₳ | 0.1 M (イソプロパノール) | 0.5 | 0.5 |
| 9 | シクロヘキシミド | ₳ | 25 mg/mL (EtOH) | 0.1 | 0.1 |
| 10 | クロラムフェニ コール | ₳ | 50 mg/mL (EtOH) | 0.05 | 0.05 |
表1:バッファー構成と混合のアドバイス。与えられた量に混合された与えられたストック濃度を有する成分は、WBまたはPEBの50mLを得る。トリス:トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、EGTA:エチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N',N',N'-テトラ酢酸,PTE:ポリオキシエチレン-(10)-トリデシルエーテル,A:オートクレーブ、フィルター滅菌;※最大50mLにRNaseフリーの水を充填してください。
- 組織均質化/研削
- 遠心分離機を冷やし、ホモジナイザーと遠心分離管を氷の上に置きます。DTT、PMSF、CHXおよびCAMのアリコートを解凍する。その日の要件(サンプルの#)に応じて50 mLチューブでストックソリューションからPEBとWBを混合し、氷の上で冷却します。
注: 水中での PMSF の半減期はわずか 30 分であるため、使用直前に PMSF を追加してください。 - デュワーの容器に液体窒素をたっぷり準備し、-80 °Cの貯蔵からティッシュサンプルを取り出す。標準的なラボ用手袋の下に綿の手袋を着用して、冷たいモルタルによる火傷を防ぎます。乳鉢や害虫に液体窒素を注ぎ、粉砕が可能なほど冷たくなるまで注ぎます。モルタルを区別するシステムを考案することをお勧めします(ラベルを付けるか、特定の順序で保管)。
- モルタルに組織サンプルを空にし、すべての材料が白い粉末になるまで慎重に粉砕します。必要に応じて、液体窒素を加え、組織を凍結状態に保つか、より良い粉砕を容易にします。
- サンプルに5mLのPEBを加え、緩衝液が凍結する前に粉末と素早く混ぜます。このサンプルが解凍している間(時々混ぜる)別のサンプルを処理します。
- 混合物が移すことができるとすぐに、ガラスホモジナイザーにスラリーを空にし、氷の上に保ちます。PEBの追加2 mLで、モルタルと害虫をすすいで、ホモジナイザーのサンプルに加えます。
注:RNA分解が可能なため、完全に液体サンプルは避けてください。 - 抽出物が均質になるまでスラリーを手動で粉砕します。4~5度のプランジを最低でもお勧めします。
注: スラリーがさらに解凍できるように、追加の待機時間が必要になる場合があります。ホモジナイザーの取り扱いには、ある程度の勤勉さが必要です。ブルートフォースを適用せず、吸引力に注意してください。考慮しない場合、これは、ホモジナイザーの流出、汚染または破壊につながります。 - 粗根エキスを50 mL遠心管に注ぎます(氷の上に保管してください)。
注: 通常、転送前に複数のサンプルを接地できます。粉砕、転写、均質化の並列処理が必要です。迅速に作業するようにしてくださいが、急いでしないでください。冷静。常に均質化されたサンプルを氷の上に保管してください。
- 遠心分離機を冷やし、ホモジナイザーと遠心分離管を氷の上に置きます。DTT、PMSF、CHXおよびCAMのアリコートを解凍する。その日の要件(サンプルの#)に応じて50 mLチューブでストックソリューションからPEBとWBを混合し、氷の上で冷却します。
- トータルRNAサンプルコレクション
- 各粗サンプルの200 μLのアリコートをクリーンなマイクロ遠心チューブに移します(事前に氷上でラベル付けして冷却します)。
- TRAPサンプルの詳細を示すとおり、点7.1および7.2のRNA抽出を進めます。サンプルが遠心分離機でクリアされている間は、これらの手順を実行します。
- 再懸濁された全RNAでDNase処理を行い、DNA汚染を排除し、市販キット(材料表)を使用して反応をクリーンアップします。
注:総RNA抽出は通常高濃度を得て、サンプルはかなり希釈する必要があります。敏感なQubitプロトコルで希釈後の濃度を測定することをお勧めします。
- 粗抽出物のクリア
- 6.2.7のサンプルでアイスバケツを取り、16,000 x gと4°Cで15分間遠心分離します。
注:遠心分離機のバランスを取るために、それに応じてサンプルをペアにします。これが完全に不可能な場合は、PEBを追加して1つのサンプルを調整してください。 - 上清を新鮮な遠心管(事前に氷で冷却)に注ぎ、遠心分離を繰り返します(16,000 x gおよび4°Cで15分)。この移動は、遠心分離機の隣で素早く行うことができます。
- 粗抽出物がクリアされている間に、ステップ6.6のGFPビーズの洗浄を開始する。
注:シェーカーで揺れるため、このアイスバケツを保管してくださいが、汚染されている可能性があるため、滅菌ベンチに戻らないでください。
- 6.2.7のサンプルでアイスバケツを取り、16,000 x gと4°Cで15分間遠心分離します。
- ビーズウォッシュ
- アリコート磁気GFP-ビーズ(#samples x 60 μL、材料表)を1.5 mLチューブに入れ.磁気スタンドに置きます。ビーズが収集されたら、上清を取り除きます。
- 冷たいWBの1 mLを追加し、ビーズを再中断し、再収集します。洗浄バッファーを破棄し、WB の 1 mL でもう一度繰り返します。
- 最終的には、ステップ 6.5.1 で使用した初期ボリュームに WB のビーズを再中断します。
- 免疫精製 (IP)
- 遠心分離の直後に、クリアした上清をラベル付き15 mLチューブに注ぎ、サンプルあたり60μLの洗浄ビーズを加えます。
- すべてのサンプルをアイスバケツに水平に置き、シェーカーの上に置きます。この混合物を2時間インキュベートさせ、GFP標識ポリソームをビーズに結合させる。
- 15 mLチューブ(氷上)の磁気スタンドにビーズを集め、残りのPEBにPMSFを加えます。上清を捨てます。約5mLのPEBをビーズに注ぎ、傾けて再中断します。セクション 6.6.2 と同じセットアップでサンプルを 15 分間振ります。
- WBでのスキを合計3回(1回PEB、2 x WB)に繰り返します。各バッファー交換の前に、PMSF を追加します。
- WBの1 mLでビーズを収集し、1.5 mLチューブに転送します。最後に、ビーズを磁気スタンドでもう一度回収し、すべての液体を取り除きます。チューブを閉じ、すべてのサンプルが処理されるまで氷の上に保管してください。
- RNA抽出のためにヒュームフードにサンプルを輸送します。
- ラボ用品の廃棄物処理と再調整。
- 良いラボの練習に従って行う場合(セクション2.2.1を参照)、殺菌手順は水性NaCl溶液をもたらす。塩素ガスだけでなく、残留HClと漂白剤を残して、煙のフードに浸します。
- PEBおよびWB処分:CHXが高pHで分解すると、すべての液体を集めてpH>9に持って来る。ハロゲン化された化学廃棄物の中に液体廃棄物を処分する。すべての固形物(組織、血清ピペット、手袋など)は、化学廃棄物として処分する必要があります。
- フェノール含有液とフェノール汚染物質(先端、チューブ、手袋)を別途収集します。
- 乳鉢、害虫、ホモジナイザー(スポンジ、ブラシ)を石鹸で手洗いし、十分に洗い流します。その後、一晩で>220°Cで材料を焼きます。処理の前にスズ箔で包むか、耐熱性の覆われた容器に入れます。
- 洗剤できれいな遠心分離チューブを磨き、次にヒュームフードでジエチルピロカーボネート(DEPC)を扱います。この上、脱イオン水(1 mLのDEPCからH2Oの1L)に液体DEPCを加え、振るによって混ぜます。遠心管を、こぼれ落としたDEPC水を捕まえるオートクレーブ可能なトレイに置きます。懸濁液をチューブに注ぎ、3時間または一晩放置します。DEPCは、後続のオートクレーブプロセスで分解します。
注意:DEPCは非常に有毒です。
7. RNA抽出とQC
- RNA抽出
- 卓上遠心分離機を4°Cに冷却します。
- 各サンプルに1mLの酸グアニジニウム-フェノールベース試薬(材料表)を加え、ビーズまたはRNAスラリー全体を再懸濁し、氷上で5分間インキュベートします。渦を出さないで!
- 200 μLのクロロホルムを加え、氷の上で3分間インキュベートします。その後、徹底的にサンプルを渦。
- 相分離を助けるために、最大で遠心分離する。10-15分、4 °Cの速度。
- ラベル 1.5 mL 低保持チューブ (材料表) およびアリコート 650 μL のイソプロパノールをそれぞれに入れ。
- 上側水相(ca. 650 μL)を慎重に取り、準備されたチューブにイソプロパノールで移します。ピンクの有機相に触れないようにしてください。
- RNAを-20°Cで一晩沈殿させた。
注:-20°Cまたは-80°Cのイソプロパノールでサンプルを保存し、必要に応じて水に可溶化することをお勧めします。RNA水溶液は、数週間/月保存すると-80°Cでも分解します。
- RNA沈殿
- 卓上遠心分離機を4°Cに冷却します。
- RNaseフリーの水で新鮮な80%EtOHを準備し、-20 °Cで冷却します(-80°Cで5分はプロセスをスピードアップするのに役立ちます)。
- サンプルを最高速度(13,000 x g)で30分間遠心し、上清を捨てます。ペレットは見えないので、ピペットはそこにあるかのように慎重に。冷たい80%のEtOHの1 mLを加え、管を1〜2回反転させます。
- 最大速度で30分間再び遠心分離機を行い、合計2回の洗浄に洗浄を繰り返します。
- 2分間スピンダウンし、10 μLチップで残留EOHをすべて取り除きます。ペレットを室温で3〜5分間乾燥させ、20 μL RNaseフリー水で再懸濁します。
- サンプルを氷の上に保管し、できるだけ早く品質管理を行います。サンプルを-80°Cで保存します。フリーズ解凍サイクルを避けてください。
- メーカーの推奨に従って専用機器(材料表)を使用した品質管理。
8. 図書館の準備
- SMARTer v4超低入力RNAキットによるcDNA合成と増幅
- 各サンプルの希釈量を計算して、4.75 μLの容量で1.5ngのTRAP-RNAまたは総RNAを持つ。
- 1/2反応量でメーカーの推奨事項に従ってすべての手順を実行します。12-13 PCR サイクルで cDNA を増幅します。
- 10xリシスバッファーの0.5 μLとSPRIビーズ25 μLを追加してPCRをクリーンアップします(材料表)。多くのサンプルが処理された場合は、リシスバッファーとビーズを事前混合することができます。ピペット処理の前にビーズが均等に分散していることを確認してください。
- フルリアクションボリューム(溶出バッファの17 μL)でプロトコルを続行します。ビーズを3分以上乾燥させないでください。過乾燥サンプルは、潜伏時間の延長によって救助される可能性があります。
- Qubit HS DNAキットでサンプル濃度を測定します。
注:SMARTer v4キットは200 pg入力まで許容できます。16 サイクル PCR で Qubit 値を特定できなかった場合 (250 pg 未満の検出限界) でライブラリを取得しました。ただし、限られた入力マテリアルは、より複雑なライブラリを生成する可能性もあります。
- ネクストセラXT DNAライブラリ調製キットを用いた断片化およびアダプターライゲーションPCR
- CDNAをRNaseフリー水で希釈し、PCRチューブ内の200 pg/μlとピペット1.25μLの濃度を得ます。
- 1/4反応量でメーカーに応じてすべてのステップを実行します。1 つのシーケンス プールに属するサンプルに対して、12 個の PCR サイクルと互換性のあるアダプターを使用して cDNA を増幅します。イルミナのインデックスキットAとDを使用すると、最大384サンプルを多重化することができます。
- PCRのクリーンアップには、12.5 μLのリサスペンションバッファーと22.5 μLのSPRIビーズ(0.9x比)を加えます。溶出バッファーの 22 μL でサンプルを溶出します。
注: QC とプールは、シーケンシング会社 (材料表) によって実行されているため、ビードベースの正規化は必要ありません。酵素断片化反応(タグメンテーション)は、すべての酵素が一度だけ切れ込むため、材料入力に非常に敏感です。従って、濃度勧告を超えないようにしてください。
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Representative Results
品質評価のために、上記の手順は、いくつかの中間ステップで調査する必要があります:プランタの発現パターン検証、分離された多ソームRNAの品質管理、および最終ライブラリの品質管理。既知のマーカー遺伝子を用いたqRT-PCRは、加えて、処置条件に対する応答を確認するか、または実験条件を微調整するために行うことができる。
GFP信号分布の共焦点解析
内皮およびXPP発現パターンの両方を確認するために、pELTP::GFP-RPL18およびpXPP::GFP-RPL18の同種線を共焦点顕微鏡で分析した。図2Aおよび図2Bは、細胞壁を輪郭を描くためにヨウ化プロピジウム(マゼンタ)で対抗されたGFP信号(緑色)を有する代表的な植物を示す。図2A1の断面は、外側から第3細胞層に同心円環を示し、これは内皮に対応している。内胚葉GFPシグナルは、有糸帯の上に開始され(図2A2)、細胞の細胞の核の周りの両方に現れ、リボソームに対応します。これに対し、XPP ラインは、XPP に対応する 2 つの異なる極を示します (図 2B1)。各極の約3つの細胞は、GFP信号を示すために有糸帯の上から開始する。したがって、両方の線は、それぞれ(図2C)53の内皮およびXPPの局在パターン53に準拠する。
ポリソームRNA検証
得られたポリソームRNAの品質を決定するために、μL入力量で動作する2つの自動電気泳動システム(材料表)を用いて、RNA完全性値(RIN)54を計算して、品質管理測定54を行いました。独自のアルゴリズムは、各エレクトロフェログラムに1と10の間のRIN値を割り当て、RNA品質(すなわち、劣化)のための堅牢で再現可能な尺度である - 値が低いほど、より劣化するサンプルです。図3は、我々がポリソームRNAから得た測定の例を示す。ほとんどのサンプルは、以前のレポート55,,56に従って、9-10 の範囲の RIN 値を持つ明らかな劣化をほとんど示していません。不適切な取り扱い、特に高温(室温など)またはRNase汚染の期間は、この段階で明らかであろう。両方の器械はまた、それらのエレクトロフェログラムからサンプル濃度を計算する(図3A)。これらは大きく異なる可能性があり、ほとんどが低い検出限界にあります。そのため、濃度を正確に定量するために、蛍光測定を使用することをお勧めします。
図書館QC
ほとんどのラボでは社内で RNA シーケンスを実行できないので、品質コントロールはスループットの高いデバイスを備えた専門の施設で実行されることがよくあります (材料表)。正確な測定がライブラリプールの前提条件であるため、qPCRおよび蛍光測定アッセイ(材料表)による品質評価と濃度の定量を日常的に行います。しかし、ライブラリの準備が外部委託されていない場合、特殊な機器(資料表)で結果をサンプリングできます。図 4は、推奨されるプロトコル (A) を使用して正常に準備されたライブラリのトレースを示し、スケールダウン反応量 (B) にもかかわらず、手順の堅牢性を示しています。パーツ C は、過剰/アンダーフラグ、クリーンアップ中の材料の損失、またはアダプタの取り外しの失敗に起因する可能性がある標準以下のサンプルを示しています。後者の場合、より厳しいサンプルビーズ比を持つ別のクリーンアップは、汚染を排除するのに役立ちます。完全に失敗したサンプルは、私たちの手の中では非常にまれであり、複数のポイント(例えば、ストキオメトリックタグメンテーション反応のための高すぎる入力)で発生する可能性があります。
シーケンス化されたライブラリのパフォーマンスは、我々の変異型バックグラウンドでの内皮からのサンプルの図4Dに例示される。WTやペリサイクルのライブラリは、同様またはより良いパフォーマンスを発揮します。リボソーム読み取りは平均で約2%で、3%を超えるサンプルはわずか数個であった。平均品質スコアが 30 を超える読み取りは、フィルタリング前にすでに 90% を超えています。シーケンス読み取りのマッピング能力は、平均85%と同様に高い範囲であった。生物学的複製間の相関を決定するために、対スピアマン係数を各時点について計算した。すべてのテストは高い係数値をもたらしました。
治療応答と濃縮分析
ゲノムにまたがるデータセットが生成される前に、試験実験からTRAP RNAをqRT-PCRでプローブして、治療の成功や実験条件を検証することができます。この種の分析を行い、XPPサンプルで2時間の治療後に補助応答を評価しました(図5A)。オーキシン応答性遺伝子(GH3.3、LBD29、GATA23)の3種類を核実験した57潜伏期間後の3症例すべてにおいて非常に強い誘導が認められ、外因性NAAの適用が成功したことを示唆している。
新たに開発されたプロモーターが利用される場合は、この時点でqRT-PCRによる濃縮分析も行う必要があります。この最後まで、既知のマーカー遺伝子(すなわち、使用されるプロモーターによって駆動される遺伝子)は、トラップおよび全RNAサンプルおよび発現レベル全体のRNAレベルに正規化して増幅される。特定の組織からのTRAP RNAの単離が成功した場合、大幅な折り目の増加が得られるべきである。または、等価な情報をシーケンス データから取得することもできます (図 5Bを参照)。2つのスベリン関連遺伝子、GPAT5およびHORSTの発現は、すべての内皮サンプルに存在し、特にXPP組織から存在しない。それどころか、サイクル形成された遺伝子(PHO1およびSKOR)は、内皮において非常に低く発現し、検査された期間にわたってオーキシン誘導のダウンレギュレーションを有するXPPプローブにおいて濃縮される。
図2:シロイヌナズナのGFP-RPL18の細胞型特異的発現A-B.pELTP::GFP-RPL18 (A) および pXPP::GFP-RPL18 (B) の共焦点顕微鏡画像は、発芽後6日で根を発現する。細胞壁の輪郭は、ヨウ化プロピジウム(マゼンタ)による染色を通じて得られた。断面A1とB1はそれぞれ、A2とB2の破線で示される位置からである。後者の画像は、記録された Z スタックの最大投影(MAX)を示しています。C.オリビナズナシス根を縦方向(C1)および断面(C3)、並びに横方向の根原素(C2)で構成する組織タイプの模式図表。画像はF.ブーシェの許可を得て変更されました。スケールバー:100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:TRAP/ポリソームRNA品質評価A.テーパステーション - 代表的な結果は、ゲル画像表現で14個の測定サンプルをそれぞれのRINe値(左上)で測定したものです。サンプル A1 の電解体表現 (青色で強調表示) が示されています。右側の表は、サンプル濃度について通知します。B. Aと同様の痕跡は、バイオアナライザーで得られます。右側のパネルには、劣化レベルが増加したサンプルが表示され、RIN 値の減少に反映されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:TRAP/ポリソームサンプルからのライブラリプロファイルA. 2 つの代表的な TRAP サンプル (左) は、Nextera XT ユーザーガイドが推奨する正常なライブラリのトレースと非常によく対応しています。B.異なる反応量は、堅牢なライブラリ調製結果をもたらす。C.最適でない結果を持つライブラリ:非常に短い断片(左上)、非常に長い断片(左下)、低濃度(右上)または完全な失敗(右下)。また、シーケンスの前に除去する必要がある残りの短い断片(青い楕円)にも注意してください。バイオアナライザ:赤い痕跡、LabChip:青い痕跡。D. 異なる時点点での配列TRAPサンプル(我々の横根のない変異体の内皮)および時間点内のすべてのサンプルの対方向比較(n=65)の間で計算されたスピアマン相関係数の分布に対する選択された品質尺度。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:qRT-PCRおよびRNA-seqはそれぞれ、オーキシン応答性および組織型の濃縮を示す。A. 3つの既知のオーキシン応答性遺伝子の発現レベルを、qRT-PCRを介したオーキシン処理の2時間後に評価した。全てのサンプルにおいて強い誘導が認められた。RT-PCRを3つの独立した生物学的複製に対して行い、UBC21を内部参照遺伝子として非処理サンプルに正規化した。誤差範囲は、SEM. GH3.3:グレッチェン ハーゲン 3.3, LDB29:ラテラバル境界ドメイン 29, GATA-モチーフ結合転写因子 23, UBC21: UBIQUITIN-CONJUGATING 酵素 21 B. GATA23TRAP-seq データセットから 4 つのマーカー遺伝子の発現レベル。左側のサンプルは内皮由来(緑色の色合い)で、右側のサンプルはXPP由来(青い色合い)です。数字は、数時間でのオーキシン潜伏間隔を表します。負の Z スコアは低い表現レベルを反映し、その逆も同様です。エンドダーマルマーカー遺伝子(GPAT5、HORST)は、エンドデルムサンプルにおいて高レベルで差異的に発現する。 HORST反対に、ペリサイクルマーカー(PHO1、SKOR)はXPP細胞において高い発現レベルを有し、オーキシン処理時にダウンレギュレーションを示す。 SKORGPAT5:グリセロール-3-リン酸 2-O-アシルトランスファー (スベリンバイオシンシス), HORST:根茎組織のヒドロキシラーゼ, PHO1:リン酸塩 1, SKOR : SKOR : SKOR: STELAR K+外向き整流器.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: 非構成型pUBQ10::GFP-RPL18ローカリゼーション パターン6日間齢の苗の共焦点顕微鏡。細胞壁の輪郭は、ヨウ化プロピジウム(マゼンタ)による染色を通じて得られた。断面A2とC1は、それぞれA3とC2の破線で示される位置から行われます。MAX とマークされたイメージは、記録された Z スタックの最大投影を示します。A1-A3.UBQ10駆動構造の均一なローカリゼーションパターン。B1-C2.外組織層における信号強度の顕著な減少。A、B、Cは3つの異なる植物に記録される。スケールバー:100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
RPL18ローカリゼーションパターンの検証
TRAP実験のデータの誤解釈を避けるために重要なのは、タグ付きリボソームサブユニットの適切な発現パターンです。従って、RPL18へのエピトープタグとしてのGFPの組み込みは、所望の発現パターンの検証を非常に優雅に可能にし、連続して、同じ組織からポリソーム分画のプルダウンを可能にする。適切なプロモーターパターンを保証するためのより侵襲的なアプローチは、GUS染色を必要とするJiaoおよびMayerowitz 2010と、抗FLAG抗体58、59,59による免疫染色に依存するTianら 2019年に続く。
T-DNAトランスジェニックラインはサイレンシングを起こしやすくなり、シグナル強度が低下したり、発現する種子の割合が低下したりするため、各世代の局在パターンを確認することを強くお勧めします。構成に組み込まれたGFPタグを使用すると、これらの頻繁な制御は顕微鏡観察によって容易に行われる。
しかし、徹底的な共焦点分析でさえ、場合によっては誤った結論につながる可能性があります。制御 TRAP ラインの生成に失敗した試みでこれを強調したいと思います。これまでのところ、植物科学コミュニティは、すべての細胞層全体で均一なRPL18分布を持つ植物ラインを作成できませんでした。当初採用された35Sプロモーターでさえ、不均一な局在パターン10を有する「近く構成的」分布のみを示すに起因した。我々のアプローチは、UBIQUITIN10(UBQ10)のプロモーターを使用してUBQ10、GFP-RPL18構造を駆動させることでした。T1世代でのスクリーニングは、非常に有望な局在化を提供し、したがって伝播することを選択した(図6A)。しかし、テストシーケンシング実行のデータは、既知の内皮特異的遺伝子のELTP-およびUBQ10駆動ラインとの比較において濃縮を示さなかった。これらの植物を詳しく調べると、実際に我々は、外組織層のシグナルの減少を発見したのに対し、stele組織は強い発現を示した(図6B)。今後の研究では、プロモーターの景観をより適切な候補に検索し、TRAP法を補完する必要があります。
制御サンプルとしての総RNA
より良いTRAP制御ラインの確立はまだ保留中であり、フィールドによって非常に期待されます。このことは、これまで、組織全体の均一なmRNA分布を得る唯一の方法は、総RNAを収集することである。この場合、トランスクリプトームがサンプリングされるように、これはさらなるバイオインフォマティクス分析において考慮される必要がある。特に、全RNAとポリサムRNAの両方の画分は、同じ組織サンプルから発生する相関性を持つようになりました。
TRAPライブラリの準備方法を検索する場合
前述のように、TRAPアプローチの大きな欠点は、達成できる様々で、ほとんどが低い利回りです。数ngから時には100 ngまでの範囲のサンプルでは、Illumina TruSeqキット(100 ng入力要件)を使用した標準的なアプローチは、十分な品質のライブラリの建設には過敏であると判断されました。市場検索では、市販のいくつかのライブラリ準備キットが明らかになっていました, それは、低い5-10 ngの出発材料で動作するように指定されました.私たちは、トマト、米、メディカゴからのTRAPサンプルのために働き、BrAD-seqアプローチ60を使用するReynosoらら2019で使用されるプロトコルをテストしませんでした。
しかし、その後のテストシーケンスですべての試験は不満足な結果をもたらしました。ポリA濃縮ステップを使用したにもかかわらず、TRAPサンプルは高リボソーム汚染(最大30%の読み取り)に苦しんでいました。さらに、ライブラリ調製の成功率は、濃度が非常に低い、または比較的低いRIN値を有するサンプルに対しては、変動し、特に低かった。私たちの広範なテストは、非常に高いrRNA含有量とおそらく微小mRNA濃度を有するTRAPサンプルの特異的RNA組成は、信頼性の高いライブラリを得るためにより敏感なアプローチを必要とするという結論に導きます。このように、SMARTer v4とNextera XTという超低入力量の最先端のソリューションに目を向けました。心強いことに、SongらはTRAPed肝臓組織61でいくつかの方法とそのシーケンシング出力をテストしたときに競合他社を上回るこのライブラリ調製アプローチも見つけました。図 4Dで示した品質指標は、低 rRNA マッピング レート (<3%) で高品質の読み取り (Q>30) を示します高い遺伝子マッピング率と同時に。さらに、一貫して高いスピアマン相関係数は、反復が実際に非常に類似した式プロファイルを持っていることを示しています。両方のキットの使用は、控えめなサイクル数で簡単であり、堅牢で信頼性の高い結果をもたらしました。シーケンシングデータは1.5 ngの出発材料で高品質でした。SMARTerキットは200pg入力の低いのを容認することで、プラントの開始材料の量を最適化することができます。希少な細胞タイプの適用性は、最終的には十分なRNAを獲得する可能性によって決定されます。
TRAPは植物科学ツールキットを補完する
TRAP法は植物科学者34にますます普及しており、いくつかの理由から標準技術のステータスを取得すると確信しています。
TRAPプロトコルのステップのどれも、細胞選別機や専用のレーザー捕獲顕微鏡のような特殊な装置を必要としません。現在までに最もコストのかかる要因は、ライブラリの準備とダウンストリームのシーケンスです。しかし、次世代シーケンシング技術のダイナミックな進歩と単一細胞シーケンシングの需要の増加に伴い、コストが大幅に削減されると予想しています。
さらに、ポリソーム関連RNAの分離は、それらのRNA(翻訳)のアクティブな翻訳ステータスに関する情報が収集されることを意味します。したがって、TRAPは、翻訳の上流にあるすべての規制ステップの出力をキャプチャし、細胞タンパク質組成のより直接的なプロキシを表します。もちろん、停滞したリボソームや翻訳後の改変はまだ不可解であり、他のアプローチ(例えばプロテオミクス)によって対処する必要があります。
前述のように、TRAPが植物の文脈で持っている明確な利点は、CW構造および細胞の機械的特性の保存である。CW-と機械的なシグナリング31,,62を通して生じる複雑な接続と制御機能を理解し始めるに従って、これらの構造を保存するアプローチは、多くの異なる発達の文脈でより重要になります。
特に確立されたモデル種の場合、TRAPは特徴付けられている豊富な異なるプロモーターから利益を得ることができます。シロイヌナズナズでは、19種類のマーカー遺伝子プロモーター30,63,63を用いることで、細胞型特異的な方法で根全体をマッピングすることが可能であった。RNA-seq実験のたびに、これらの選択が改善され、新しい、より特異的なプロモーターが生じ、細胞分解能を改良する。
TRAPは、マーカーがまだ知られていない細胞集団に対する多くのプロモーターとの組み合わせ使用においてさらに適用可能である。これは、根内皮の特殊な細胞の場合です。いわゆるパッセージ細胞は、成熟した内皮細胞53をコートするスベリン層のアブセンスによって特徴付けられる。適切なプロモーターを組み合わせ、その後の異なる発現プロファイルのインシリコ減算を組み合わせることは、通過細胞を収容する領域について豊かにする。転写レポーター分析は、その後、通過細胞マーカー遺伝子を同定するのに役立ちます。しかし、TRAPを使用してこの基準で希少細胞集団を分析できるかどうかはまだ決まっていない。
本稿では、翻訳-リボソームアフィニティー精製法の詳細な説明、その利点と限界、およびその潜在的な用途を強調した。「オミックス」研究のポートフォリオでは、それは重要なニッチを占めており、多くの生物学的な質問に答えるのに役立ちます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
このプロジェクトの初期段階で、チューリッヒ遺伝ダイバーシティセンターのジャン=クロード・ウォルサーに重要な専門家のアドバイスをしてくれたことに感謝します。フェルメール研究所での研究は、スイス国立科学財団(SNSF)からSNF教授助成(PP00P3_157524)とR'EQUIP機器助成金(316030_164086)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterilization | |||
| bleach, 13% | Sigma | 71696 | |
| beaker | VWR | 214-1172/74/75 | |
| desiccator with porcelaine plate (DURAN) | Sigma/Merck | Z317454-1EA/Z317594-1EA | |
| EtOH, p.a. | Honeywell | 02860-1L | |
| HCl, 37% | Roth | 4625.1 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Plate growth + harvesting | |||
| MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer | Duchefa | M0254 | |
| agar plant for cell culture | Applichem/Panreac | A2111.1000 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| forcepts | Rubis Switzerland | 5-SA model | |
| KOH | Fluka | 60370 | |
| micropore/surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| NAA | Duchefa | N0903 | |
| petri dishes 120x120 mm | Greiner bio-one | 688102 | |
| scalpel | VWR/Swann-Morton | 233-5454 | |
| tissues, neutral, two-layered | any supplier of your choice | ||
| Immunoprecipitation | |||
| GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA | Chromotek | e.g. gtma-100 | |
| Brij-35 | Sigma | P1254-500G | |
| centrifuge tubes (in accordance with centrifuge) | Beckman Coulter | 357001 | |
| Chloramphenicol | Applichem | C0378-25G | |
| cotton gloves | VWR | 113-7355 | |
| Cycloheximide, HPLC grade | Sigma | 01810-1G | |
| DEPC | VWR | E174 | might have long delivery times |
| DTT | Fluka | 43815 | |
| EGTA | Sigma | 3054.3 | |
| homogenizers DUALL 23 | KONTES GLASS CO (via VWR) | SCERSP885450-0023 (set) | SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times |
| Igepal CA-360 | Sigma | I3021-100ml | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| MgCl2 hexahydrat | Roth | 2189.2 | |
| mortar and pestle | VWR | 470148-960 & 470019-978 | |
| PMSF | Roche | 10 837 091 001 | |
| Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE | Sigma | P2393-500G | |
| RNase-free water | Roth | T143.3 | |
| RNAZap | Thermo Fisher | AM9780/AM9782 | for cleaning surfaces |
| Tris, >99.3% | Roth | AE15.3 | |
| Triton X-100 | Fluka | T8787-250ml | |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ml | |
| RNA extraction | |||
| 2-Propanol, p.a. | Sigma | 33539-1L-GL-R | |
| Chloroform, HPLC grade | Scharlau | CL02181000 | |
| EtOH, p.a. | Honeywell | 02860-1L | |
| low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml | Eppendorf/Sigma | Z666548-250EA | LoBind |
| RNase-free DNase set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| TRIzol reagent | ThermoFisher/Ambion | 15596018 | |
| Library preparation | |||
| 15/50 mL Tube Magnetic Separator | Abraxis | PN 472250 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Index Kit A | Illumina | FC-131-2001 | |
| Index Kit D | Illumina | FC-131-2004 | |
| neodymium magnets | Amazon/other | 6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB) | |
| Nextera XT kit | Illumina | FC-131-1024/1096 | https://emea.support.illumina.com/ |
| PCR strips | ThermoScientific | AB-0266 | |
| SMARTer v4 kit | Takara Bioscience | 634892 | https://www.takarabio.com/ |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | specialized equipment for RNA/DNA quality control |
| Tapestation | Agilent | 4200 Tapestation Instrument | specialized equipment for RNA/DNA quality control |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5400 Fragment Analyzer System | specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput) |
| LabChip | PerkinElmer | LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer | specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput) |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher | Q33239 | specialized equipment for RNA/DNA concentration determination |
| qRT-PCR | |||
| GATA23 | Microsynth | fwd: AGTGAGAATGAA AGAAGAGAAGGG; rev: GTGGCTGCGAAT AATATGAATACC |
|
| GH3.3 | Microsynth | fwd: CAAACCAATCCT CCAAATGAC; rev: ACTTATCCGCAA CCCGACT |
|
| LBD29 | Microsynth | fwd: TCTCCAACAACA GGTTGTGAAT; rev: AAGGAGCCTTAG TAGTGTCTCCA |
|
| UBC21 | Microsynth | fwd: TGCGACTCAGGG AATCTTCT; rev: TCATCCTTTCTT AGGCATAGCG |
|
| SsoAdvanced Universal SYBR Green | Bio-Rad | #172-5270 | |
| iScript Adv cDNA Kit | Bio-Rad | #172-5038 | |
| miscellaneous | |||
| Falcon tubes 15 ml, Cellstar | Greiner bio-one | 188261 | |
| Falcon tubes 50 ml, Cellstar | Greiner bio-one | 210261 | |
| filter tips 1 ml | Axygen | TF-1000-R-S | |
| filter tips 10 µl | Axygen | TF-10-R-S | |
| filter tips 100 µl | Axygen | TF-100-R-S | |
| filter tips 20 µl | Axygen | TF-20-R-S | |
| filter tips 200 µl | Axygen | TF-200-R-S | |
| microcentrifuge tubes 1.5 ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-100MG | |
| sequencing company | Novogene | en.novogene.com |
References
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