Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Översätta Ribosom Affinity Rening (TRAP) för att undersöka Arabidopsis thaliana Root Development på en celltyp-specifik skala

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/60919
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Plant and Microbial Biology, University of Zurich, 2Biophore - UNIL, 3Laboratory of Cell and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Neuchâtel

Summary

Translating ribosomaffinitet rening (TRAP) erbjuder möjligheten att dissekera utvecklingsprogram med minimal bearbetning av organ och vävnader. Protokollet ger högkvalitativt RNA från celler riktade med ett grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt ribosomal underavdelning. Nedströms analysverktyg, till exempel qRT-PCR eller RNA-seq, avslöjar vävnads- och celltypspecifika uttrycksprofiler.

Abstract

I den här artikeln ger vi praktiska instruktioner för att erhålla översättningsdata från olika Arabidopsis thaliana rotcellstyper via metoden översätta ribosomaaffinitetsrening (TRAP) och på varandra följande optimerade biblioteksförberedelser med låg ingång.

Som utgångsmaterial använder vi växtlinjer som uttrycker GFP-märkt ribosomalt protein RPL18 på ett celltypspecifikt sätt med hjälp av lämpliga initiativtagare. Före immunorening och RNA-extraktion är vävnaden snäppfryst, vilket bevarar vävnadsintegriteten och samtidigt möjliggör utförande av tidsseriestudier med hög temporal upplösning. Framför allt förblir cellväggsstrukturerna intakta, vilket är en stor nackdel i alternativa förfaranden såsom fluorescensaktiverade cellsorteringsbaserade metoder som är beroende av vävnadsprotoplasting för att isolera olika cellpopulationer. Dessutom är ingen vävnad fixering nödvändig som i laser fånga mikrodissection-baserade tekniker, vilket gör att högkvalitativa RNA som skall erhållas.

Provtagning från subpopulationer av celler och endast isolera polysome-associerade RNA begränsar dock kraftigt RNA avkastning. Det är därför nödvändigt att tillämpa tillräckligt känsliga metoder för förberedelse av bibliotek för framgångsrik datainsamling av RNA-seq.

TRAP erbjuder ett idealiskt verktyg för växtforskning eftersom många utvecklingsprocesser involverar cellväggsrelaterade och mekaniska signalvägar. Användningen av initiativtagare för att rikta in sig på specifika cellpopulationer överbryggar klyftan mellan organ- och encellig nivå som i sin tur lider av små upplösningar eller mycket höga kostnader. Här tillämpar vi TRAP för att studera cellcellskommunikation i lateral rotbildning.

Introduction

Driven av den ökande tillämpningen av nästa generations sekvenseringstekniker skulle rumslig upplösning i utvecklingsbiologi kunna utökas. Samtida studier syftar till att dissekera vävnader ner till specialiserade celltyper, om inte encellig nivå1,,2,,3,4. I detta syfte har en uppsjö av olika metoder utarbetats under de senaste femtio åren (se figur 1A)5,,6,,7,,8,,9,,10,,11,,12,,13,,14,,15.

Många verktyg inom växtvetenskap har varit anpassningar av tekniker som var pionjärer inom djurforskning. Detta är inte fallet för den metod som vi inför i detalj här. Under 2005, utrustad med en stark bakgrund inom proteinöversättning, Bailey-Serres Lab syftar till att ingenjör ribosomala proteiner för efterföljande affinitet rening16. Således kunde de undvika tidskrävande och arbetsintensiv polysome profilering, som bygger på ultracentrifugering med en sackaros gradient och användes för att bedöma översätta ribosomer sedan 1960-talet17,18. Metoden har sedan dess kallat translationell ribosomaffinitetsrening (TRAP)16. Efter framgångsrika översättarstudier på växter, Heiman et al. anpassade TRAP för djur19 och andra utvidgas dess tillämpning till jäst20, Drosophila21, Xenopus22 och zebrafisk23,24.

Även om genetisk modifiering av modellsystemet är en förutsättning för TRAP, som begränsar dess tillämpning till arter som kan användas för genetisk omvandling, kan man samtidigt utnyttja denna invändning mot målundergrupper av celler som är av särskilt intresse och i övrigt extremt svårt att isolera från intakt vävnad/organ25 (t.ex. höggrenade dendritiska celler i en mushjärna eller svamphyfa i infekterad växtvävnad). I växter hålls alla celler på plats via cellväggar som ligger till grund för det hydrostatiska skelettet26. För att frigöra en växtcell från denna matris, forskare har antingen fysiskt skära cellen ur sin omgivande vävnad genom laser fånga microdissection (LCM)27 eller utförs enzymatisk matsmältning av cellväggarna28. Bland de senare cellerna, så kallade protoplaster, är populationen av intresse fluorescerande märkt och kan separeras via fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)7. LCM kräver vanligtvis ett prov som skall fastställas och inbäddad i vax, vilket i slutändan försämrar kvaliteten på dess RNA29. FACS-baserade metoder ger högkvalitativa RNA, men processen att protoplasting själv introducerar skillnader i genuttryck30 och vävnader med modifierade och tjocka sekundära cellväggar är notoriskt svåra att behandla. Dessutom antas många utvecklingsprocesser i anläggningar förlita sig på mekaniskt överförda signaler och därför är cellväggens integritet av största vikt31. Två metoder, som använder en genväg för att kringgå cellisolering genom att arbeta på nivån av kärnor, är fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS) och isolering av kärnor taggade i specifika celltyper (INTAKT). Liksom i TRAP använder de celltypspecifika promotorer för att markera kärnor, som därefter berikas via sortering eller pull down,respektive 8,15. En stor utmaning för alla dessa metoder är att få tillräckligt RNA-material från delmängder av celler i en vävnad. Som TRAP fångar bara en bråkdel av den cellulära RNAs, prov insamling är en betydande flaskhals. Därför behövs särskilt känsliga biblioteksförberedelseprotokoll för att producera högkvalitativa data från låga indatamängder.

Sedan starten har TRAP antingen använts i kombination med DNA-mikroarrayer eller, som sekvensering kostnader minskat betydligt under de senaste åren, RNA-seq10,32,33. En mängd forskningsfrågor har redan klarlagts som granskats i Sablok et al.34. Vi är övertygade om att fler rapporter kommer att följa under de kommande åren eftersom tekniken är mycket mångsidig när man kombinerar olika initiativtagare för att rikta specifika celltyper. Så småningom, Detta kommer att ske även på ett inducerande sätt, och kan kombineras med sondering av anläggningens reaktion på många biotiska och abiotiska stressfaktorer. Dessutom, där stabila transgena linjer inte finns tillgängliga, håriga rot uttryckssystem har också framgångsrikt använts för att utföra TRAP i tomat och medicago35,36.

Figure 1
Figur 1: Omräkning av ribosomaffinitetsrening (TRAP) kompletterar analysportföljen "omics". A. Ökande nivåer av analytisk precision, ner till encellig eller till och med subcellulär upplösning kan uppnås genom en uppsjö av metoder eller kombinationer av dessa. Systemet ger en översikt över de verktyg som för närvarande finns tillgängliga på växt- och djurområdet. Vävnadssamling vid cellupplösning kan uppnås genom protokoll som LCM eller FACS, som sedan kopplas till standard transkriptom eller polysome profilering / översättaranalys. TRAP och INTACT integrerar både vävnadsfångst och RNA-isolering eftersom de är baserade på epitop-märkning. Intakt prover endast cellkärnor och utgör därför ett specialfall av transkriptom analys. En liten kanin ikon markerar nyutvecklade metoder inom djurområdet: Medan SLAM-ITseq och Flura-seq förlita sig på metabolisk targetting av begynnande RNAs med modifierade uracil baser i celler som uttrycker tillåtande enzym, Slide-seq använder sig av en bestruken glas bild med DNA-streckkoder som ger positionsinformation i cellområdet. En närhetsmärkning följs i APEX-seq för att prova RNA i specifika subcellulära fack. Framför allt kräver ökad upplösning ofta generering av transgent material (asterisker) och dessa metoder används därför främst för modellarter. TRAP är särskilt lämpad för växtvetenskapliga studier med cellvägg (CW) eller mekaniker signalering samt cellarter som är svåra att släppa från sin CW matris. B. Detaljerade våt-lab steg i TRAP förfarandet: Plantor som uttrycker GFP-märkt ribosomalt protein i olika celltyper (t.ex. rot endodermis) odlas på petriskålar i sju dagar och rotmaterial skördas genom snap frysning. Ett totalt RNA-kontrollprov samlas in från det homogeniserade råextraktet innan skräpet pelleteras via centrifugering. Magnetiska anti-GFP pärlor läggs till rensade extrakt för att utföra immunprecipitation. Efter inkubation och tre tvättsteg erhålls det polysome-associerade RNA (TRAP/polysome RNA) direkt via fenol-kloroformextraktion. LCM: mikroavskiljning av laseravskiljning, FACS/FLÄKTAR: fluorescensaktiverad cell-/kärnsortering. APEX-seq: metod baserad på konstruerad askorbatperoxidas, INTAKT: isolering av kärnor taggade i specifika celltyper, SLAM-ITseq: thiol(SH)-linked alkylation för metabolisk sekvensering av RNA i vävnad, Flura-seq: fluorouracil-märkt RNA-sekvensering (Skapad med Biorender.com) Klicka här för att se en större version av denna figur.

Målet med den här artikeln är att tillhandahålla en detaljerad beskrivning av TRAP-metoden, att markera kritiska steg och att ge vägledning för en möjlig biblioteksförberedelsemetod.

Ett generiskt TRAP-experiment kommer huvudsakligen att bestå av följande steg (se även figur 1B):(1) Beredning av växtmaterial, inklusive kloning av ribosommärkningskonstruktion, transgen linjeproduktion och val, odling och sammanslagning av frön, sterilisering och plätering samt stressapplicering/behandling (frivillig uppgift) och vävnadsskörd. (2) immunrening inklusive vävnad homogenisering och clearing av rå extrakt, pärla tvätt och immunrening, och tvätta steg; (3) RNA-utvinning och kvalitetsbedömning. och (4) biblioteksförberedelser.

Den Arabidopsis roten har varit en modell system för att studera växtutveckling ända sedan den infördes som en modell anläggning37,38. Här visas tillämpningen av TRAP upp i samband med växt lateral rot utveckling. I växter, uppbyggnaden av hela rotsystemet bygger på genomförandet av detta program och är därför mycket viktigt för överlevnaden av organismen39. I Arabidopsiskommer laterala rötter från pericycle vävnad som finns bredvid xylem fartyg och därför kallas xylem pole pericycle (XPP; se figur 2C)40. Vissa XPP celler, som ligger djupt inne i roten, förvärva en grundare cell identitet och, på en lokal hormonell trigger, börjar föröka sig genom svullnad och dela anticlinally41. Men på grund av närvaron av en styv cellvägg matris, utövar denna process mekanisk stress på de omgivande vävnaderna. I synnerhet påverkas den överliggande endodermis, som det är i vägen för den laterala rottillväxtaxeln42,43,44. Faktum är att den nybildande primordium måste växa genom den överliggande endodermis cellen (Figur 2C2) medan cortex och epidermis celler bara skjuts åt sidan för primordium att äntligen dyka upp45,46. Senaste arbetet i vårt labb har visat att endodermis aktivt bidrar till att tillgodose spridningen i pericycle. Riktad blockering av endodermal hormonell signalering är tillräcklig för att hämma även den allra första divisionen i XPP-cellerna47. Därför utgör pericycle-endodermis kommunikation en mycket tidig kontrollpunkt för lateral rot utveckling i Arabidopsis. Det är dock inte känt hur denna överhörning utförs. För att reda ut detta mysterium valde vi TRAP-seq-metoden för att rikta in sig på XPP och endodermala celler. För att berika för celler i det laterala rotprogrammet, härmade vi den hormonella utlösaren genom att exogent tillämpa en auxin analog (1-naftalenetiksyra, NAA)48, som samtidigt tillåtet att tidsmässigt lösa den inledande fasen av laterala rotbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kloning av transgen, transgenlinjeproduktion och val

  1. Klona valfri promotor i lämplig ingångsvektor. Använd en rekombinationsbaserad kloningsmetod (Tabell över material) och kombinera om initiativtagarna i pDONRP4-P1r. KlonA RPL18 (med affinitetstagg eller lysrörsprotein) med hjälp av rekombinationsbaserad kloning i pDONRP1-P249.
  2. Kombinera ingångsvektorn som innehåller RPL18 med den promotorhaltiga ingångsvektorn i en två fragmentrekombinationsreaktion till lämplig destinationsvektor med FAST-röd valkassett50 för att underlätta direkt val av transgena frön.
  3. Kontrollera den rekombinerade vektorn genom sekvensering och omvandla den till lämplig, kompetent agrobakterier. Blomma dopp Arabidopsis växter och efter 3-4 veckors skörd och välj T1 frön51.
  4. Använd mikroskopi för att identifiera väl uttryckslinjer och verifiera uttrycksmönster enligt den rapporterade promotoraktiviteten i flera oberoende linjer. Markera rader som visar ett representativt uttrycksmönster med en enda T-DNA-insättning. Detta kan bidra till att minimera ljuddämpning och kommer att vara fördelaktigt för genetiska kors.
  5. Välj T3 avkomma som är homozygous för markörgenen.

2. Förökning och sterilisering

  1. Celltypspecifika TRAP isolerar RNA från ett begränsat antal målceller per rot. För att generera det nödvändiga startmaterialet, sprida homozygous linjer. För detta ändamål, använd standard tillväxtförhållanden med särskilt fokus på svamp tillväxtkontroll.
    OBS: Om enstaka insättningslinjer inte kan erhållas, odla partier i stora populationer under några generationer för att undvika T-DNA-inducerad transgenerational ljuddämpning.
  2. Sterilisera stora mängder Arabidopsis frön med en runda klorgas och en runda av 70% EtOH.
    1. Sprid frön jämnt på 12 cm x 12 cm kvadratiska petriskålar (mindre än 0,3 ml frön/tallrik) och stapla dem i en exsickator eller annan lämplig behållare. Undvik klump eller högbildning eftersom fröna måste vara tillgängliga för gasen. Utför gassterilisering över natten med blekmedel och HCl volymer som rapporterats52:100 ml blekmedel (13%) med 6 ml conc. HCl i en 60 L-exsickator. Defumigate i minst 1 h innan du samlar fröna i en steril behållare.
      VARNING: 37% HCl är mycket frätande och kräver noggrann hantering. Klorgas är giftigt, använd en rökhuva.
    2. Ta 0,1 ml torra, gassteriliserade frön per platta och blanda dem med steriliseringslösning (70% EtOH, 0,01% Tween) vid rumstemperatur. Inkubera i 20 min, dekantera EtOH och tvätta fröna 3-4 gånger med steril H2O.
    3. Överför de blöta fröna till 50 ml-rör och späd med steril 0,1 % agar för att få 1 ml inbibelsfrön per platta (0,1 ml frö/1 ml slurry).
      OBS: På grund av transgenintegration händelser, växtlinjer kan vara mottagliga för olika sterilisering tekniker; särskilt EtOH inkubationstiden befanns vara kritisk. I våra händer var de dubbla steriliseringsstegen nödvändiga för att undvika svampkontaminering under experimenten. Detta är särskilt viktigt när man utför tidsserier eftersom kontaminering av en enda tidpunkt hämmar hela experimentet. Det kan mycket väl vara så att dubbel sterilisering inte alltid behövs, beroende på lokala odlingsförhållanden.

3. Plätering

  1. Förbered dessa steg i förväg. Häll 1/2 MS-plattor (pH 5.8) med 1% agar i de mängder som behövs för experimentet (20-30 per prov/tidpunkt). Skär 1 ml pipettspetsar för att förstora spetsdiametern till ca 3-4 mm med ett rakblad. Autoklav tipsen. Skapa en mallhållare för plätering tre rader frön per tallrik med kvadratiska petriskål lock. Förbered en laminär flödeshuva för att ge en steril arbetsmiljö och märka plattorna som ska bearbetas.
    Obs: Om många plattor bearbetas samtidigt kan färgade etiketter påskynda märkningen.
  2. Placera tomma agarplattor i mallhållaren och fördela 1 ml inbrättade frön jämnt på tre rader. Placera de bearbetade plattorna i staplar i laminarflödet tills fröna är torra (dvs. håll dig till agarytan). Lämna inte plattorna längre eftersom agar kommer att torka ut också.
  3. När fröna är tillräckligt torra, stäng locken och försegla varje platta med mikroporejp. Stratifiera fröna i två dagar vid 4 °C i mörkret och placera dem därefter i en tillväxtkammare.

4. Vävnadsbehandling (frivillig uppgift)

OBS: I detta protokoll beskriver vi exogen behandling av Arabidopsis rötter med syntetiska auxin variant NAA. Beroende på den experimentella frågan till hands måste denna del justeras eller kan utelämnas helt.

  1. Förbered remsor av mjukpapper på 1,5 - 2 cm i höjd och 10 cm i längd. Förlängda inkubationstider kräver att vävnaden autoklaveras före användning.
  2. Ta bort mikroportejpen från alla plattor som måste genomgå hormonbehandling. Späd 1 ml 10 mM NAA (upplöst i DMSO) i 1 L vätska, autoklaverad 1/2 MS-lösning (pH 5.8) och blötlägg mjukpapperet i lösningen (10 μM NAA).
  3. Använd pincett för att applicera en remsa av mjukpapper på varje rad av rötter. Använd försiktigt fingrarna för att ta bort luftbubblor. Töm överflödig vätska från plattan, stäng locket och märk plattan med tiden. För längre inkubationstider, placera plattorna tillbaka i tillväxtkammaren.

5. Skörd

  1. Hämta plattor för varje biologisk replikat/tidpunkt/behandling. Samla flytande kväve i ett rent Dewar-kärl och etikettrör (15 eller 50 ml) för de olika vävnadsproverna. Förbered en frigolithållare.
    VARNING: Bekanta dig med förfaranden för hantering av flytande kväve (luftning, köldskador, potentiellt exploderande rör).
  2. Öppna plattan och ta bort mjukpapper med pincett, var noga med att inte lossa rötterna från agarytan. Med ett kirurgiskt blad, skär en gång per rad längs shoot-root-korsningen i en enda, bestämd stroke. Rengör bladen mellan proverna och byt ut ofta för att garantera skärpan.
  3. Med pincett sveper du längs rötterna på varje rad för att samla dem i tre buntar. Ta tag i rötterna och töm dem i ett 50 ml-rör fyllt med flytande kväve för att snäppa frysa.
    OBS: Försök inte att montera rötter i täta strukturer (som bollar) eftersom de är svåra att slipa i nästa steg.
  4. Fortsätt med alla plattor som utgör ett prov (i ordningen av inkubationstider) och häll ut överflödigt flytande kväve. Använd rörlocket för att förhindra att rötterna spiller. Stäng sedan locket och samla alla rör i Dewar fartyget. Förvara rotvävnaden vid -80 °C.

6. Immunrening

OBS: Detta steg syftar till att få hög kvalitet TRAP / polysome RNA. Följ därför strikt råd om god praxis för RNA-hantering. Utför alla steg i detta avsnitt i en steril bänk och rengör all utrustning och labware med en RNase-borttagningslösning (Table of Materials). Använd handskar och byt dem omedelbart när de är förorenade med prov, is eller andra källor som inte har rengjorts. Eftersom detta är en mycket avgörande aspekt ingår ett avsnitt om återanvändning av utrustning tillsammans med avfallshanteringsrådgivning.

  1. Förberedelse av buffert
    1. Förbered stamlösningar enligt tabell 1 och autoklav (A) eller filtrera sterilisera (▌). Om inget annat anges är lösningsmedlet RNase-fritt vatten.
    2. Lös upp och aliquot dithiothreitol (DTT), fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), cykloheximid (CHX) och kloramfenikol (CAM) i sina respektive lösningsmedel enligt tabell 1 och förvara dem vid -20 °C. Alla andra bestånd kan förbli i rumstemperatur.
    3. Förblanda lagren - med ingredienserna 1-4 för tvättbuffert (WB) och 1-6 för polysome extraktionsbuffert (PEB) - för att undvika tidskrävande buffertblandning före varje extraktion. Således tillsätt bara vatten och frysta ingredienser (7-10) på dagen för extraktionen. Förvara de förblandade bestånden och RNase-fria vatten vid 4 °C.
      OBS: DTT-koncentrationen är 1/5 av den rapporterade koncentrationen från Zanetti et al. 2005, eftersom nanokroppsinteraktionen med GFP är känslig för höga DTT-koncentrationer.
Ingredienser Lagerkoncentration Tillsätt volym i ml för 50 ml WB* Tillsätt volym i ml för 50 ml PEB*
1 Tris, pH 9 A 2 M 5 5
2 KCl (KCl) A 2 M 5 5
3 EGTA ( EGTA ) A 0,5 M 2.5 2.5
4 MgCl2 (På andra) A 1 M 1.75 1.75
5 Pte A 20% (v/v) 0 2.5
6 blandning av tvättmedel A 0 2.5
Tween 20 (Tween) 20% (v/v)
Triton-X 100 20% (v/v)
Brij-35 20% (w /v)
Igepal (på andra sätt) 20% (v/v)
7 Dtt ₳ 0,5 M 0.1 0.1
8 PMSF (PÅ ANDRA) ₳ 0,1 M (isopropanol) 0.5 0.5
9 Cykloheximid ₳ 25 mg/ml (EtOH) 0.1 0.1
10 Kloramfenikol ₳ 50 mg/ml (EtOH) 0.05 0.05

Tabell 1: Buffertsammansättning och blandningsråd. Ingredienser med de givna beståndskoncentrationerna blandade i de angivna mängderna ger 50 ml WB eller PEB. Tris: tris-(hydroxymetyl)-aminometan, EGTA: etylenglykol-bis(β-aminoetyleter)-N,N,N',N'-tetra-ättiksyra, PTE: Polyoxyetylen-(10)-tridecyleterer, A: autoklaver, ≥: filtersterilisera; *fyll upp till 50 ml med RNase-fritt vatten.

  1. Homogenisering/slipning av vävnader
    1. Kyl ner centrifugen och placera homogenisatorer och centrifugrör på is. Tina alikvoter av DTT, PMSF, CHX och CAM. Blanda PEB och WB från stamlösningarna i 50 ml-rör enligt dagens krav (# av prover) och kyl på is.
      OBS: Tillsätt PMSF endast strax före användning, eftersom halveringstiden för PMSF i vatten är endast 30 min.
    2. Förbered mycket flytande kväve i ett Dewar-kärl och hämta vävnadsprover från -80 °C-lagring. Använd bomullshandskar under vanliga labbhandskar för att förhindra brännskador från kalla granatkastare. Häll flytande kväve i murbruk och pestles tills de är tillräckligt kalla för att tillåta slipning. Det rekommenderas att utforma ett system för att skilja granatkastare (etikett eller hålla i en viss ordning).
    3. Töm vävnadsprov i en mortel och slipa försiktigt tills allt material är ett vitt pulver. Om det behövs, tillsätt flytande kväve för att hålla vävnaden frusen eller för att underlätta bättre slipning.
    4. Tillsätt 5 ml PEB till provet och blanda snabbt med pulvret innan bufferten fryser. Medan detta prov tinar (blanda från tid till annan) bearbeta ett annat prov.
    5. Så snart blandningen kan överföras, töm slurry i ett glas homogenisator och hålla på is. Med ytterligare 2 ml PEB, skölj mortel och mortel och tillsätt det till provet i homogenisator.
      OBS: Undvik ett helt flytande prov eftersom detta möjliggör RNA-nedbrytning.
    6. Slipa slammet manuellt tills extraktet är homogent. Vi rekommenderar minst 4 till 5 dopp.
      Obs: Det kan kräva lite extra väntetid för att flytgödseln ska tina ytterligare. Hantering av homogenisatorer kräver viss flit. Applicera inte brute force och se upp för sugkrafter. Om detta inte beaktas kommer detta att leda till spill, kontaminering eller destruktion av homogenisatorn.
    7. Häll rå rotextraktet i ett 50 ml centrifugrör (håll på is).
      OBS: Vanligtvis kan flera prover slipas före överföring. Parallell hantering av slipning, överföring och homogenisering krävs. Försök att arbeta snabbt men inte rusa; håll dig lugn. Håll alltid homogeniserade prover på is.
  2. Total samling av RNA-prov
    1. Överför 200 μL alikvoter av varje råprov till ett rent mikrocentrifugrör (märkt och kylt på is i förväg).
    2. Fortsätt med RNA-extraktionen enligt vad som anges för TRAP-prover i punkterna 7.1 och 7.2. Gör dessa steg medan proverna rensar i centrifugen.
    3. Utför en DNase behandling med resuspended totala RNA för att eliminera DNA-kontaminering och rensa upp reaktionen med hjälp av en kommersiell sats (Tabell av material).
      OBS: Totala RNA-extraktioner ger vanligtvis höga koncentrationer och prover måste spädas avsevärt. Vi rekommenderar att du mäter koncentrationen efter utspädning med det känsliga Qubit-protokollet.
  3. Rensa råextraktet
    1. Ta ishinken med prover från 6.2.7 och centrifugera dem i 15 min vid 16 000 x g och 4 °C.
      OBS: För att balansera centrifugen, para ihop proverna därefter. Om detta inte är fullt möjligt, justera ett prov genom att lägga till PEB.
    2. Häll supernatanten till ett färskt centrifugrör (kylt på is i förväg) och upprepa centrifugering (15 min vid 16 000 x g och 4 °C). Denna överföring kan snabbt utföras bredvid centrifugen.
    3. Medan det råa extraktet rensar, initiera tvättning av GFP-pärlor för steg 6.6.
      OBS: Håll ishinken för gungning på skakapparaten men placera inte tillbaka i den sterila bänken eftersom den kan vara förorenad.
  4. Pärltvätt
    1. Aliquot magnetiska GFP-pärlor (#samples x 60 μL, Tabell över material) i ett 1,5 ml-rör. Placera på magnetstället. När pärlorna har samlats in, ta bort supernatanten.
    2. Tillsätt 1 ml kallt WB, resuspend pärlorna och samla in dem igen. Kassera tvättbufferten och upprepa igen med 1 ml WB.
    3. I slutändan återuppstänger pärlorna i WB till den ursprungliga volymen som används i steg 6.5.1.
  5. Immunrening (IP)
    1. Omedelbart efter centrifugering, häll det rensade supernatanten i märkta 15 ml-rör och tillsätt 60 μl tvättade pärlor per prov.
    2. Placera alla prover horisontellt i ishinken och lägg den på en shaker. Låt blandningen ruva i 2 timmar för att binda de GFP-märkta polysomesna till pärlorna.
    3. Samla pärlorna på magnetstället för 15 ml-rör (på is) och tillsätt PMSF till resterande PEB. Kasta supernatanten. Häll ca 5 ml PEB till pärlorna och resuspend dem genom att luta. Skaka proverna i 15 min i samma inställning som i avsnitt 6.6.2.
    4. Upprepa tvättar med WB till totalt 3 tvättar (1 x PEB, 2 x WB). Lägg till PMSF före varje buffertutbyte.
    5. Samla pärlorna i 1 ml WB och överför dem till ett 1,5 ml-rör. Slutligen samla pärlorna en gång till på det magnetiska stativet och ta bort all vätska. Stäng röret och förvara på is tills alla prover bearbetas.
    6. Transportera proverna till en rökhuv för RNA-extraktion.
  6. Avfallshantering och renovering av labbmaterial.
    1. Om steriliseringsproceduren utförs enligt god laboratoriesed (se avsnitt 2.2.1) ger steriliseringsproceduren en vattenhaltig NaCl-lösning. Låt klorgasen, liksom resterande HCl och blekmedel, avolera i rökhuven.
    2. PEB- och WB-kassering: När CHX bryts ned vid högt pH-kort, samla in alla vätskor och ta med till pH>9. Kasta flytande avfall i det halogenerade kemiska avfallet. Alla fasta ämnen (vävnader, serologiska pipetter, handskar etc.) ska kasseras som kemiskt avfall.
    3. Samla fenolhaltiga vätskor separat, samt fenol-förorenat material (tips, rör och handskar).
    4. Handtvättade granatkastare, pestles och homogenisatorer (svampar och borste) med tvål och skölj noggrant. Därefter baka materialet på >220 °C över natten. Antingen linda i tennfolie före behandlingen eller placera i en värmebeständig, täckt behållare.
    5. Borsta rena centrifugrör med tvättmedel och sedan diethylpykarbonat (DEPC)-behandla i rökhuven. Tillsätt därför flytande DEPC i avjoniserat vatten (1 ml DEPC till 1 L H2O) och blanda via skakning. Placera centrifugrören på en autoklaverbar bricka som fångar spillt DEPC-vatten. Häll suspensionen i rören och låt stå i 3 timmar eller över natten. DEPC bryts ned i den efterföljande autoklaveringsprocessen.
      VARNING: DEPC är mycket giftigt.

7. RNA-extraktion och QC

  1. RNA-extraktion
    1. Kyl ner bordscentrifugen till 4 °C.
    2. Tillsätt 1 ml syra-guanidinium-fenolbaserat reagens(Tabell över material)till varje prov, invertera för att återuppstå pärlorna eller den totala RNA-slammet och inkubera i 5 min på is. Virvla inte!
    3. Tillsätt 200 μl kloroform och inkubera i 3 min på is. Sedan grundligt virvel proverna.
    4. För att underlätta fasseparation, centrifug på max. hastighet i 10-15 min, 4 °C.
    5. Märk 1,5 ml lågretentionsrör (Tabell över material)och alikvot 650 μL isopropanol i varje.
    6. Ta försiktigt den övre vattenfasen (ca 650 μL) och överför till de förberedda rören med isopropanol. Undvik att vidröra den rosa organiska fasen.
    7. Fäll ut RNA över natten vid -20 °C.
      OBS: Det rekommenderas att proverna förvaras i isopropanol vid -20 °C eller -80 °C och endast lösligas i vatten vid behov. Vattenhaltigt RNA bryts ned även vid -80 °C när det förvaras i veckor/månader.
  2. RNA-nederbörd
    1. Kyl ner bordscentrifugen till 4 °C.
    2. Förbered färskt 80% EtOH med RNase-fritt vatten och kyl ner vid -20 °C (5 min vid -80 °C hjälper till att påskynda processen).
    3. Centrifugera proverna med högsta hastighet (ca 13 000 x g)i 30 minuter och kasta supernatanten. Pelleten kommer inte att synas, så försiktigt pipett som om den var där. Tillsätt 1 ml kallt 80% EtOH och vänd röret en eller två gånger.
    4. Centrifugera igen i 30 min vid maximal hastighet och upprepa tvätten till totalt två tvättar.
    5. Vrid ner i 2 min och ta bort alla kvarvarande EtOH med en 10 μL spets. Låt pelleten torka i 3-5 min (inte mer) i rumstemperatur och återsuspend i 20 μL RNase-fritt vatten.
    6. Förvara proverna på is och utför kvalitetskontroll så snart som möjligt. Fortsätt att förvara proverna vid -80 °C. Undvik frys-tö cykler.
  3. Kvalitetskontroll med särskild utrustning(Tabell över material)enligt tillverkarens rekommendationer.

8. Förberedelser för bibliotek

  1. cDNA-syntes och förstärkning med SMARTer v4 Ultra Low Input RNA Kit
    1. Beräkna utspädningen av varje prov så att det har 1,5 ng TRAP-RNA eller totalt RNA i en volym av 4,75 μL. Utför alla reaktioner i PCR-rör och späda prover med färska alikvoter RNase-fritt vatten.
    2. Utför alla steg enligt tillverkarens rekommendationer med 1/2 reaktionsvolymerna. Förstärk cDNA med 12-13 PCR-cykler.
    3. Rengör PCR genom att tillsätta 0,5 μL 10x lysbuffert och 25 μl SPRI-pärlor (Tabell över material). Om många prover bearbetas lysis buffert och pärlor kan förblöda. Se till att pärlorna är jämnt spridda före pipettering.
    4. Fortsätt med protokollet i fullständiga reaktionsvolymer (17 μL elueringsbuffert). Låt inte pärlorna torka i mer än 3 minuter. Överdriaderade prover kan potentiellt räddas genom långvariga inkubationstider.
    5. Mät provkoncentrationerna med Qubit HS DNA-kit.
      OBS: SMARTer v4 kit tål ner till 200 pg ingång. Vi fick bibliotek i fall där Qubit värden inte kunde fastställas (under 250 pg, detektion gräns) med en 16 cykel PCR. Det begränsade indatamaterialet kan dock också ge mindre komplexa bibliotek.
  2. Fragmentering och adapter ligering PCR med Nextera XT DNA Library Preparation Kit
    1. Späd cDNA med RNase-fritt vatten för att erhålla en koncentration på 200 pg/μl och pipett 1,25 μL i ett PCR-rör.
    2. Utför alla steg enligt tillverkaren med 1/4 reaktionsvolymerna. Förstärk cDNA med 12 PCR-cykler och kompatibla adaptrar för de prover som tillhör en sekvenseringspool. Med Illuminas Index KitS A och D kan upp till 384 prover multiplexeras.
    3. För PCR-rensningen tillsätt 12,5 μl resuspensionsbuffert och 22,5 μl SPRI-pärlor (0,9 x förhållande). Äckla provet med 22 μL elueringsbuffert.
      OBS: QC och pooling utfördes av sekvenseringsföretaget (Table of Materials) och därför behövdes ingen pärlbaserad normalisering. Den enzymatiska fragmenteringsreaktionen (tagmentation) är mycket känslig för materialtillförsel eftersom varje enzym bara skär en gång. Överskrid därför inte koncentrationsrekommendationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För kvalitetsbedömning bör ovannämnda förfarande undersökas vid flera mellanliggande steg: validering av uttrycksmönster i planta, kvalitetskontroll av det isolerade polysomala RNA och de slutliga biblioteken. qRT-PCR med hjälp av kända markörgener kan dessutom utföras för att bekräfta svaret på behandlingstillståndet eller för att finjustera försöksförhållandena.

Konfial analys av GFP-signaldistribution
För att kontrollera både endodermal och XPP uttryck mönster, analyserade vi homozygous linjer av pELTP::GFP-RPL18 och pXPP::GFP-RPL18 av confocal mikroskopi. Figur 2A och figur 2B visar representativa växter med GFP-signaler (gröna) som har kontrats med propidiumtodid (magenta) för att beskriva cellväggar. Tvärsnittet i figur 2A1 visar en koncentrisk ring i det tredje celllagret från utsidan, vilket motsvarar endodermis. Den endodermala GFP-signalen initierar strax ovanför den meristematiska zonen (figur 2A2) och visas både i cytosol och runt cellernas kärnor, vilket motsvarar ribosomer. XPP-linjen uppvisar däremot två distinkta poler, vilket motsvarar XPP(figur 2B1). Ungefär tre celler vid varje pol börjar ovanför den meristematiska zonen för att uppvisa en GFP-signal. Båda linjerna överensstämmer således med lokaliseringsmönstret för endodermis respektive XPP (figur 2C)53.

Polysome RNA validering
För att bestämma kvaliteten på det erhållna polysome RNA utförde vi kvalitetskontrollmätningar, med hjälp av två automatiserade elektroforessystem (Tabell över material) som arbetar med μL-indatamängder och även beräknar ett RNA-integritetsnummer (RIN)54. Den egenutvecklade algoritmen tilldelar ett RIN-värde mellan 1 och 10 till varje elektropherogram och är ett robust och reproducerbart mått för RNA-kvalitet (dvs. nedbrytning) - ju lägre värde desto mer försämrat är provet. Figur 3 visar exempel på de mätningar vi fått från polysome RNA. De flesta prover visar knappast någon uppenbar nedbrytning med RIN värden från 9-10, vilket är i enlighet med tidigare rapporter55,56. Felaktig hantering, särskilt perioder med förlängda förhöjda temperaturer (t.ex. rumstemperatur) eller RNase-kontaminering, skulle vara uppenbara i detta skede. Båda instrumenten beräknar också provkoncentrationer från sina elektroferogram (figur 3A). Dessa kan variera avsevärt och är mestadels på den lägre detektionsgränsen. Vi rekommenderar därför att du använder fluorometriska mätningar för att exakt kvantifiera koncentrationer.

Skåp för bibliotek
Eftersom de flesta laboratorier inte utför RNA-sekvensering i huset, körs kvalitetskontroller ofta på specialiserade anläggningar med hög genomströmningsanordningar (Tabell över material). De bedömer rutinmässigt kvaliteten och kvantifiera koncentrationerna genom qPCR och fluorometriska analyser (Tabell över material) som exakta mätningar är förutsättningen för bibliotekspoolning. Ändå, om biblioteket förberedelse inte läggs ut, kan man prova resultatet med specialiserad utrustning (Tabell över material). Figur 4 visar spår av framgångsrikt förberedda bibliotek med vårt rekommenderade protokoll (A) och belyser robustheten i förfarandet trots nedskalade reaktionsvolymer (B). Del C illustrerar undermåliga prover som kan bli resultatet av över-/underfragmentation, materialförlust vid rensning eller misslyckade borttagning av adaptrar. I det senare fallet, en annan sanering med en strängare prov-pärla-ratio kan bidra till att eliminera kontaminering. Helt misslyckade prover var extremt sällsynta i våra händer och kunde ha sitt ursprung på flera punkter (t.ex. för hög ingång för stochiometric tagmentation reaktion).

Utförandet av sekvenserade bibliotek exemplifieras i figur 4D för prover från endodermis i vår muterade bakgrund. Bibliotek från WT och/eller pericycle fungerar på liknande sätt eller ännu bättre. Ribosomal läsningar var i genomsnitt runt 2% med endast några prover över 3%. Läser med en genomsnittlig kvalitetspoäng över 30 var genomgående över 90% redan före filtrering. Kartförmågan hos de sekvenserade läsningarna var lika hög som i genomsnitt 85 %. För att bestämma korrelationen mellan biologiska replikat beräknades parvis Spearman-koefficienter för varje tidpunkt. Alla tester resulterade i höga koefficientvärden.

Behandlingssvar och analys av anrikning
Innan en genom-spanning datauppsättning produceras, TRAP RNA från ett pilotexperiment kan undersökas av qRT-PCR för att validera behandling framgång och / eller experimentella villkor. Vi utförde denna typ av analys för att bedöma auxin svar efter 2 h behandling i XPP prover(Figur 5A). Tre olika auxin-responsiva gener (GH3.3, LBD29 och GATA23) testades via ∆∆Ct-metoden57. Mycket stark induktion observerades i alla tre fall efter inkubationstiden, vilket tyder på att exogena NAA ansökan var framgångsrik.

Om nyutvecklade initiativtagare används bör man vid denna tidpunkt också utföra anrikningsanalys med qRT-PCR. För detta ändamål förstärks en känd markörgen (dvs. den gen som drivs av den använda promotorn) i TRAP och totala RNA-prov- och uttrycksnivåer normaliserade till den totala RNA-nivån. Om isoleringen av TRAP RNA från den specifika vävnaden var framgångsrik bör en betydande ökning av fålla förändringar erhållas. Alternativt kan motsvarande information hämtas från sekvenseringsdata (se figur 5B). Uttryck för två suberin-relaterade gener, GPAT5 och HORST, finns i alla endodermis prover och särskilt frånvarande från XPP vävnader. Tvärtom uttrycks pericycle-uttryckta gener (PHO1 och SKOR) endast mycket ringa i endodermis och berikas i XPP-sonderna med en auxin-inducerad nedreglering under den undersökta tidsramen.

Figure 2
Figur 2: Celltypspecifikt uttryck för GFP-RPL18 i Arabidopsis roten. A-B. Confocal mikroskopi bilder av pELTP::GFP-RPL18 (A) och pXPP::GFP-RPL18 (B) uttrycker rötter på sex dagar efter grobarhet. Cell vägg konturer erhölls genom färgning med propidium jodid (magenta). Tvärsnitten A1 och B1 kommer från de positioner som betecknas med streckade linjer i A2 respektive B2. De senare bilderna visar maximala projektioner (MAX) av de inspelade z-stackarna. C. Schematisk representation av de vävnadstyper som komponerar Arabidopsis roten i längsgående (C1) och tvärsnitt (C3) samt i en lateral rot primordium (C2). Bilden ändrades med tillstånd från F. Bouché. Skala barer: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: TRAP/polysome RNA kvalitetsbedömning. A. Tapestation - Representativa resultat från 14 uppmätta prover i gel bild representation med sina respektive RINe värden (överst till vänster). Elektropherogramrepresentation visas för prov A1 (markerat i blått). Tabellen till höger informerar om provkoncentrationerna. B. Liknande spår som i A erhålls med Bioanalyzer. Panelerna till höger visar prover med ökande nedbrytningsnivåer, vilket återspeglar i deras minskande RIN-värden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Biblioteksprofiler från TRAP/polysomeprover. A. Två representativa TRAP-exempel (vänster) motsvarar mycket väl de spår för lyckade bibliotek som rekommenderas av användarhandboken för Nextera XT. B. Olika reaktionsvolymer ger robusta biblioteksförberedelser. C. Bibliotek med suboptimala resultat: mycket korta fragment (uppe till vänster), extremt långa fragment (nere till vänster), låg koncentration (uppe till höger) eller fullständig misslyckas (nere till höger). Observera även kvarvarande korta fragment (blå ellips), som måste tas bort före sekvensering. Bioanalyzer: röda traces, LabChip: blått traces. D. Utvalda kvalitetsmått för sekvenserade TRAP-prover (endodermis av vår laterala rotfria mutant) vid olika tidpunkter och fördelningen av Spearmankorrelationskoefficienter som beräknats mellan parvisa jämförelser av alla prover inom en tidpunkt (n=65). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: qRT-PCR och RNA-seq visar auxin-lyhördhet respektive vävnadstyp anrikning, respektive. A. Uttryck nivåer av tre kända auxin-lyhörda gener bedömdes efter 2 h av auxin behandling via qRT-PCR. Stark induktion observerades i alla prover. RT-PCR utfördes på 3 oberoende biologiska replikerar och normaliserades till icke-behandlade prover med UBC21 som inre referensgen. Fel staplar representerar SEM. GH3.3: Gretchen Hagen 3.3, LDB29: LATERAL BOUNDARY DOMAIN 29, GATA23: GATA-motiv bindande transkriptionsfaktor 23, UBC21: UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME 21 B. Uttrycksnivåer för fyra markörgener från TRAP-seq-datauppsättningen. Prover till vänster är endodermis-härledda (gröna nyanser), medan prover till höger är XPP-härledda (blå nyanser). Talen representerar auxin inkubationsintervallen i timmar. Negativa z-poäng återspeglar låga uttrycksnivåer och vice versa. Endodermal markör gener (GPAT5, HORST) uttrycks differentially med höga nivåer i endodermis prover. Tvärtom, pericycle markörer (PHO1, SKOR) har höga uttryck nivåer i XPP celler och visa nedreglering vid auxin behandling. GPAT5: glycerol-3-fosfat 2-O-acyltransferas (suberin biosynthsis), HORST: hydroxylas av rot suberiserad vävnad, PHO1: fosfat 1, SKOR: stelar K+ utåt likriktare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Icke-konstituerande pUBQ10::GFP-RPL18 lokaliseringsmönster. Konfokalmikroskopi av sex dagar gamla plantor. Cell vägg konturer erhölls genom färgning med propidium jodid (magenta). Tvärsnitten A2 och C1 kommer från de positioner som betecknas med streckade linjer i A3 respektive C2. Bilder märkta MAX visar maximala projektioner av de inspelade z-stackarna. A1-A3. Enhetliga lokaliseringsmönster för UBQ10-drivenkonstruktion. B1-C2. Märkbar minskning av signalstyrkan i yttre vävnadslager. A, B och C registreras i tre olika växter. Skala barer: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Verifiering av RPL18-lokaliseringsmönster
Avgörande för att undvika feltolkning av data från alla TRAP-experiment är det korrekta uttrycksmönstret för den taggade ribosomala underenheten. Därför tillåter införlivandet av GFP som en epitoptagg till RPL18 mycket elegant kontroll av det önskade uttrycksmönstret och i följd, pulldown av polysomefraktionen från samma vävnad. Mer invasiva metoder för att säkerställa korrekt promotor mönster följs av Jiao och Mayerowitz 2010, vilket kräver GUS-färgning och i Tian et al. 2019 som bygger på immunstainning med anti-FLAG antikroppar58,59.

Vi rekommenderar starkt att kontrollera lokaliseringsmönstret i varje generation som T-DNA transgena linjer kan vara benägna att tysta och därmed signalstyrka kan försämras eller andelen uttrycka frön minskar. Med GFP-taggen införlivas i konstruktionen, dessa frekventa kontroller är lätt utförs via mikroskopi.

Men även grundlig konfocal analys kan i vissa fall leda till felaktiga slutsatser. Vi vill lyfta fram detta med vårt misslyckade försök att ta fram en kontroll TRAP-linje. Hittills har växtvetenskap samfundet inte kunnat skapa en växt linje med en enhetlig RPL18 fördelning i alla celllager. Även den ursprungligen anställda 35S promotorn tillskrevs endast visa "nära konstituerande" distribution med en icke-enhetlig lokalisering mönster10. Vår strategi var att använda initiativtagaren till UBIQUITIN10 (UBQ10)för att driva GFP-RPL18 konstruktion. Screening i T1 generationen erbjuds mycket lovande lokalisering och därmed valdes för att spridas (figur 6A). Data från en testsekvenseringskörning visade dock inte anrikning i jämförelser mellan ELTP- och UBQ10-drivnalinjer för kända endodermis specifika gener. Vid närmare inspektion av dessa växter fann vi faktiskt en minskning av signalen i de yttre vävnadsskikten medan stelevävnad visade starkt uttryck (figur 6B). Framtida studier bör söka i det initiativtagare landskapet efter mer lämpliga kandidater och komplettera TRAP-metoden.

Totalt RNA som kontrollprov
Inrättandet av en bättre TRAP-kontrolllinje är fortfarande under behandling och kommer att vara mycket efterlängtade av fältet. Med detta i åtanke, hittills det enda sättet att få en vävnad-bred enhetlig fördelning av mRNAs är att samla totala RNA. Eftersom man i detta fall provtas i ett transkriptom måste detta redovisas i den fortsatta bioinformatiska analysen. Noterbart är att både totala RNA och polysome RNA fraktioner är nu korrelerade eftersom de kommer från samma vävnadsprov.

I sökandet efter en TRAP-biblioteksförberedelsemetod
Som tidigare nämnts är en stor nackdel med TRAP-metoden de varierande och mestadels låga avkastningar som kan uppnås. Med prover från få ng till ibland upp till 100 ng en standard strategi med Illumina TruSeq kit (100 ng input krav) bedömdes som alltför okänslig för byggandet av bibliotek av tillräcklig kvalitet. En marknadssökning visade flera kommersiellt tillgängliga bibliotek förberedelse kit, som angavs för att arbeta med så lågt som 5-10 ng startmaterial. Vi har inte testat det protokoll som används av Reynoso et al. 2019, som fungerar för deras TRAP-prover från tomat, ris och Medicago och använder BrAD-seq-metoden60.

Alla våra prövningar, dock med efterföljande test sekvensering gav otillfredsställande resultat. Trots användningen av polyA-anrikning steg, TRAP prover led av höga ribosomal föroreningar (upp till 30% av läser). Dessutom var andelen framgångsrika för biblioteksberedningen varierande och särskilt låg för prover med kritiskt låga koncentrationer eller relativt lägre RIN-värden. Våra omfattande tester leder oss till slutsatsen att den specifika RNA-sammansättningen av ett TRAP-prov, med mycket hög rRNA-innehåll och förmodligen minut mRNA-koncentrationer, kräver en mer känslig metod för att få tillförlitliga bibliotek. Därför vände vi oss till toppmoderna lösningar för extremt låga insatsmängder: SMARTer v4 och Nextera XT. Lugnande, Song et al. fann också detta bibliotek förberedelse strategi för att överträffa sina konkurrenter när de testade flera metoder och deras sekvensering utgång på TRAPed levervävnad61. De kvalitetsmått som vi har presenterat i figur 4D uppvisar högkvalitativa läsningar (Q>30) vid låga rRNA-kartläggningshastigheter (<3%) samtidigt med höga genkartläggningshastigheter. Dessutom visar genomgående höga Spearman korrelationskoefficienter att replikerar har verkligen mycket liknande uttrycksprofiler. Användningen av båda kiten var enkel med blygsamma cykelnummer och gav robusta och tillförlitliga resultat. Sekvenseringsdata var av hög kvalitet med 1,5 ng startmaterial. Med SMARTer kit tolererar så lågt som 200 pg ingång, kan mängden anläggningens utgångsmaterial optimeras. Tillämpligheten för ovanligare celltyper kommer i slutändan att avgöras av möjligheten att samla tillräckligt med RNA.

TRAP kompletterar verktygslådan för växtvetenskap
TRAP-metoden har blivit allt populärare bland växtforskare34 och vi är övertygade om att den kommer att få status som standardteknik på grund av flera skäl.

Inget av stegen i TRAP-protokollet behöver specialutrustning, som en cellsorteringsmaskin eller ett dedikerat laserfångskop, vilket gör det möjligt för många laboratorier att utföra experimenten. Hittills är de mest kostsamma faktorerna biblioteksförberedelser och nedströmssekvensering. Ändå, med den dynamiska utvecklingen av nästa generations sekvensering tekniker och ökande efterfrågan på encellig sekvensering, räknar vi med att kostnaderna kommer att minska avsevärt.

Dessutom innebär isoleringen av polysome-associerade RNA att information samlas in om den aktiva översättningsstatusen för dessa RNA (översättar). Därför fångar TRAP produktionen av alla regulatoriska steg som är uppströms översättning och representerar en mer direkt proxy för den cellulära proteinsammansättningen. Naturligtvis är avstannade ribosomer och ändringar efter översättning fortfarande svårfångade och måste hanteras genom andra tillvägagångssätt (t.ex. proteomik).

Som tidigare nämnts är en klar fördel som TRAP har i ett växtsammanhang bevarandet av CW-strukturer och cellernas mekaniska egenskaper. När vi bara börjar förstå de invecklade anslutningar och reglerande funktioner som uppstår genom CW- och mekanisk signalering31,62, metoder som bevarar dessa strukturer kommer att bli viktigare i många olika utvecklingssammanhang.

Speciellt för väletablerade modellarter kan TRAP dra nytta av en mängd olika initiativtagare, som har karakteriserats. I Arabidopsisvar det således möjligt att kartlägga hela roten på ett celltypspecifikt sätt med hjälp av 19 olika markörgenpromotorer30,63. Med varje RNA-seq experiment, dessa val kommer att förbättras och nya, mer specifika initiativtagare kommer att uppstå och förfina cellulära upplösning.

TRAP är dessutom tillämplig i en kombinatorisk användning med många initiativtagare för cellpopulationer där inga markörer ännu är kända. Detta är fallet för specialiserade celler i roten endodermis. De så kallade passagecellerna kännetecknas av absense av suberinskiktet som rockar mogna endodermisceller53. Genom att kombinera lämpliga initiativtagare och efterföljande silico subtraktion av de distinkta uttrycksprofilerna kommer det att berikas för regioner som hyser passageceller. Transkriptionell reporter analys kommer sedan att hjälpa till att identifiera passage cellmarkör gener. Om TRAP kan användas för att sedan analysera den sällsynta cellpopulationen på denna grund återstår dock att bestämma.

I den här artikeln har vi lämnat en detaljerad beskrivning av den översätta-ribosoaffinitet reningsmetoden, dess fördelar och begränsningar, och betonade potentiella tillämpningar av dessa. I portföljen av "omics" studier, det upptar en viktig nisch och kommer att bidra till att besvara många biologiska frågor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Jean-Claude Walser från Genetic Diversity Center Zürich för viktiga expertråd i den tidiga fasen av detta projekt. Arbetet i Vermeer labbet stöddes av en SNF professur stipendium (PP00P3_157524) och en R'EQUIP utrustning bidrag (316030_164086) från Swiss National Science Foundation (SNSF) tilldelas JEMV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterilization
bleach, 13% Sigma 71696
beaker VWR 214-1172/74/75
desiccator with porcelaine plate (DURAN) Sigma/Merck Z317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
HCl, 37% Roth 4625.1
Tween 20 Sigma P9416
Plate growth + harvesting
MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer Duchefa M0254
agar plant for cell culture Applichem/Panreac A2111.1000
DMSO Sigma D4540
forcepts Rubis Switzerland 5-SA model
KOH Fluka 60370
micropore/surgical tape 3M 1530-0
NAA Duchefa N0903
petri dishes 120x120 mm Greiner bio-one 688102
scalpel VWR/Swann-Morton 233-5454
tissues, neutral, two-layered any supplier of your choice
Immunoprecipitation
GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA Chromotek e.g. gtma-100
Brij-35 Sigma P1254-500G
centrifuge tubes (in accordance with centrifuge) Beckman Coulter 357001
Chloramphenicol Applichem C0378-25G
cotton gloves VWR 113-7355
Cycloheximide, HPLC grade Sigma 01810-1G
DEPC VWR E174 might have long delivery times
DTT Fluka 43815
EGTA Sigma 3054.3
homogenizers DUALL 23 KONTES GLASS CO (via VWR) SCERSP885450-0023 (set) SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times
Igepal CA-360 Sigma I3021-100ml
KCl Sigma 60130
MgCl2 hexahydrat Roth 2189.2
mortar and pestle VWR 470148-960 & 470019-978
PMSF Roche 10 837 091 001
Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE Sigma P2393-500G
RNase-free water Roth T143.3
RNAZap Thermo Fisher AM9780/AM9782 for cleaning surfaces
Tris, >99.3% Roth AE15.3
Triton X-100 Fluka T8787-250ml
Tween 20 Sigma P9416-100ml
RNA extraction
2-Propanol, p.a. Sigma 33539-1L-GL-R
Chloroform, HPLC grade Scharlau CL02181000
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml Eppendorf/Sigma Z666548-250EA LoBind
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy MiniElute Cleanup Kit Qiagen 74204
TRIzol reagent ThermoFisher/Ambion 15596018
Library preparation
15/50 mL Tube Magnetic Separator Abraxis PN 472250
AMPure beads Beckman Coulter A63881
Index Kit A Illumina FC-131-2001
Index Kit D Illumina FC-131-2004
neodymium magnets Amazon/other 6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)
Nextera XT kit Illumina FC-131-1024/1096 https://emea.support.illumina.com/
PCR strips ThermoScientific AB-0266
SMARTer v4 kit Takara Bioscience 634892 https://www.takarabio.com/
Bioanalyzer Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Tapestation Agilent 4200 Tapestation Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Fragment Analyzer Agilent 5400 Fragment Analyzer System specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
LabChip PerkinElmer LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
Qubit 4 Fluorometer ThermoFisher Q33239 specialized equipment for RNA/DNA concentration determination
qRT-PCR
GATA23 Microsynth fwd: AGTGAGAATGAA
AGAAGAGAAGGG;
rev: GTGGCTGCGAAT
AATATGAATACC
GH3.3 Microsynth fwd: CAAACCAATCCT
CCAAATGAC;
rev: ACTTATCCGCAA
CCCGACT
LBD29 Microsynth fwd: TCTCCAACAACA
GGTTGTGAAT;
rev: AAGGAGCCTTAG
TAGTGTCTCCA
UBC21 Microsynth fwd: TGCGACTCAGGG
AATCTTCT;
rev: TCATCCTTTCTT
AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR Green Bio-Rad #172-5270
iScript Adv cDNA Kit Bio-Rad #172-5038
miscellaneous
Falcon tubes 15 ml, Cellstar Greiner bio-one 188261
Falcon tubes 50 ml, Cellstar Greiner bio-one 210261
filter tips 1 ml Axygen TF-1000-R-S
filter tips 10 µl Axygen TF-10-R-S
filter tips 100 µl Axygen TF-100-R-S
filter tips 20 µl Axygen TF-20-R-S
filter tips 200 µl Axygen TF-200-R-S
microcentrifuge tubes 1.5 ml SARSTEDT 72.690.001
Propidium iodide Sigma P4170-100MG
sequencing company Novogene en.novogene.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Verk, M. C., Hickman, R., Corné, M. J., Pieterse, M., Van Wees, S. C. RNA-Seq: Revelation Of The Messengers. Trends In Plant Science. 18 (4), 175-179 (2013).
  2. Libault, M., Pingault, L., Zogli, P., Schiefelbein, J. Plant Systems Biology At The Single-Cell Level. Trends In Plant Science. 22 (11), 949-960 (2017).
  3. Mustroph, A., et al. Profiling Translatomes Of Discrete Cell Populations Resolves Altered Cellular Priorities During Hypoxia In Arabidopsis. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 106 (44), 18843-18848 (2009).
  4. Karve, R., Iyer-Pascuzzi, A. S. Digging Deeper: High-Resolution Genome-Scale Data Yields New Insights Into Root Biology. Current Opinion In Plant Biology. 24, 24-30 (2015).
  5. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A Multiple Ribosomal Structure In Protein Synthesis. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 49 (1), 122-129 (1963).
  6. Gautam, V., Sarkar, A. K. Laser Assisted Microdissection, An Efficient Technique To Understand Tissue Specific Gene Expression Patterns And Functional Genomics In Plants. Molecular Biotechnology. 57 (4), 299-308 (2015).
  7. Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Fluorescence Activated Cell Sorting Of Plant Protoplasts. Journal of Visualized Experiments. (36), e1673 (2010).
  8. Deal, R. B., Henikoff, S. The Intact Method For Cell Type-Specific Gene Expression And Chromatin Profiling In Arabidopsis Thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56-68 (2011).
  9. Dougherty, J. D. The Expanding Toolkit Of Translating Ribosome Affinity Purification. The Journal of Neuroscience: The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 37 (50), 12079-12087 (2017).
  10. Mustroph, A., Juntawong, P., Bailey-Serres, J. Isolation Of Plant Polysomal mRNA By Differential Centrifugation And Ribosome Immunopurification Methods. Methods in Molecular Biology. 553, 109-126 (2009).
  11. Matsushima, W., et al. SLAM-ITseq: Sequencing Cell Type-Specific Transcriptomes Without Cell Sorting. Development. 145 (13), (2018).
  12. Basnet, H., et al. Flura-Seq Identifies Organ-Specific Metabolic Adaptations During Early Metastatic Colonization. Elife. 8, (2019).
  13. Rodriques, S. G., et al. Slide-Seq: A Scalable Technology For Measuring Genome-Wide Expression At High Spatial Resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  14. Fazal, F. M., et al. Atlas Of Subcellular RNA Localization Revealed By Apex-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  15. Slane, D., Bayer, M. Cell Type-Specific Gene Expression Profiling Using Fluorescence-Activated Nuclear Sorting. Plant Gene Regulatory Networks: Methods And Protocols. Kaufmann, K., Mueller-Roeber, B. , Springer. New York, NY. 27-35 (2017).
  16. Zanetti, M. E., Chang, I. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification Of Polyribosomal Complexes Of Arabidopsis For Global Analysis Of Gene Expression. Plant Physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
  17. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome Profiling: Methods For Genome-Scale Analysis Of mRNA Translation. Briefings In Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2016).
  18. Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome Analysis And RNA Purification From Sucrose Gradients. RNA: Methods And Protocols. Nielsen, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 293-309 (2011).
  19. Heiman, M., et al. A Translational Profiling Approach For The Molecular Characterization Of Cns Cell Types. Cell. 135 (4), 738-748 (2008).
  20. Halbeisen, R. E., Scherrer, T., Gerber, A. P. Affinity Purification Of Ribosomes To Access The Translatome. Methods. 48 (3), 306-310 (2009).
  21. Thomas, A., et al. A Versatile Method For Cell-Specific Profiling Of Translated mRNAs In Drosophila. Plos One. 7 (7), e40276 (2012).
  22. Watson, F. L., et al. Cell Type-Specific Translational Profiling In The Xenopus Laevis Retina. Developmental Dynamics. 241 (12), 1960-1972 (2012).
  23. Lam, P. Y., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility In Zebrafish. Plos One. 8 (12), e84436 (2013).
  24. Fang, Y., et al. Translational Profiling Of Cardiomyocytes Identifies An Early Jak1/Stat3 Injury Response Required For Zebrafish Heart Regeneration. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
  25. Mustroph, A., Zanetti, M. E., Girke, T., Bailey-Serres, J. Isolation And Analysis Of mRNAs From Specific Cell Types Of Plants By Ribosome Immunopurification. Methods In Molecular Biology. 959, 277-302 (2013).
  26. Monshausen, G. B., Gilroy, S. Feeling Green: Mechanosensing In Plants. Trends In Cell Biology. 19 (5), 228-235 (2009).
  27. Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be More Specific! Laser-Assisted Microdissection Of Plant Cells. Trends In Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
  28. Sheen, J. Signal Transduction In Maize And Arabidopsis Mesophyll Protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
  29. Datta, S., et al. Laser Capture Microdissection: Big Data From Small Samples. Histology And Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  30. Birnbaum, K., et al. A Gene Expression Map Of The Arabidopsis Root. Science. 302 (5652), 1956 (2003).
  31. Hamant, O., Haswell, E. S. Life Behind The Wall: Sensing Mechanical Cues In Plants. BMC Biology. 15 (1), 1354 (2017).
  32. Vragović, K., et al. Translatome Analyses Capture Of Opposing Tissue-Specific Brassinosteroid Signals Orchestrating Root Meristem Differentiation. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 923-928 (2015).
  33. Wang, Y., Jiao, Y. Translating Ribosome Affinity Purification (Trap) For Cell-Specific Translation Profiling In Developing Flowers. Methods In Molecular Biology. 1110, 323-328 (2014).
  34. Sablok, G., Powell, J. J., Kazan, K. Emerging Roles And Landscape Of Translating mRNAs In Plants. Frontiers in Plant Science. 8, 1443 (2017).
  35. Ron, M., et al. Hairy Root Transformation Using Agrobacterium Rhizogenes As A Tool For Exploring Cell Type-Specific Gene Expression And Function Using Tomato As A Model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
  36. Reynoso, M. A., et al. Evolutionary Flexibility In Flooding Response Circuitry In Angiosperms. Science. 365 (6459), 1291-1295 (2019).
  37. Dolan, L., et al. Cellular Organisation Of The Arabidopsis Thaliana Root. Development. 119 (1), 71 (1993).
  38. Ristova, D., Barbez, E. Root Development. , Springer. New York, NY. (2018).
  39. Shekhar, V., Stӧckle, D., Thellmann, M., Vermeer, J. E. M. The Role Of Plant Root Systems In Evolutionary Adaptation. Current Topics in Developmental Biology. 131, 55-80 (2019).
  40. Malamy, J. E., Benfey, P. N. Down And Out In Arabidopsis: The Formation Of Lateral Roots. Trends in Plant Science. 2 (10), 390-396 (1997).
  41. de Smet, I., et al. Bimodular Auxin Response Controls Organogenesis In Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 107 (6), 2705-2710 (2010).
  42. Péret, B., et al. Arabidopsis Lateral Root Development: An Emerging Story. Trends In Plant Science. 14 (7), 399-408 (2009).
  43. Vilches-Barro, A., Maizel, A. Talking Through Walls: Mechanisms Of Lateral Root Emergence In Arabidopsis Thaliana. Current Opinion in Plant Biology. 23, 31-38 (2015).
  44. Porco, S., et al. Lateral Root Emergence In Arabidopsis Is Dependent On Transcription Factor Lbd29 Regulation Of Auxin Influx Carrier Lax3. Development. 143 (18), 3340-3349 (2016).
  45. Stoeckle, D., Thellmann, M., Vermeer, J. E. Breakout-Lateral Root Emergence In Arabidopsis Thaliana. Current Opinion in Plant Biology. 41, 67-72 (2018).
  46. Banda, J., et al. Lateral Root Formation In Arabidopsis: A Well-Ordered Lrexit. Trends in Plant Science. 24 (9), 826-839 (2019).
  47. Vermeer, J. E. M., et al. A Spatial Accommodation By Neighboring Cells Is Required For Organ Initiation In Arabidopsis. Science. 343 (6167), 178-183 (2014).
  48. Vanneste, S., et al. Cell Cycle Progression In The Pericycle Is Not Sufficient For Solitary Root/Iaa14-Mediated Lateral Root Initiation In Arabidopsis Thaliana. The Plant Cell. 17 (11), 3035-3050 (2005).
  49. Marques-Bueno, M. M., et al. A Versatile Multisite Gateway-Compatible Promoter And Transgenic Line Collection For Cell Type-Specific Functional Genomics In Arabidopsis. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology. 85 (2), 320-333 (2016).
  50. Shimada, T. L., Shimada, T., Hara-Nishimura, I. A Rapid And Non-Destructive Screenable Marker, Fast, For Identifying Transformed Seeds Of Arabidopsis Thaliana. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology. 61 (3), 519-528 (2010).
  51. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral Dip: A Simplified Method For Agrobacterium Mediated Transformation Of Arabidopsis Thaliana. The Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
  52. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method For High-Throughput Sterilization Of Arabidopsis Seeds. Journal Of Visualized Experiments. (128), e56587 (2017).
  53. Andersen, T. G., et al. Diffusible Repression Of Cytokinin Signalling Produces Endodermal Symmetry And Passage Cells. Nature. 555, 529-533 (2018).
  54. Schroeder, A., et al. The Rin: An Rna Integrity Number For Assigning Integrity Values To Rna Measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  55. Vragović, K., Bartom, E., Savaldi-Goldstein, S. Quantitation Of Cell Type-Specific Responses To Brassinosteroid By Deep Sequencing Of Polysome-Associated Polyadenylated RNA. Methods in Molecular Biology. 1564, 81-102 (2017).
  56. Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. Trap-Rc, Translating Ribosome Affinity Purification From Rare Cell Populations Of Drosophila Embryos. Journal Of Visualized Experiments. (103), e52985 (2015).
  57. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis Of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR And The 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  58. Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-Type Specific Analysis Of Translating Rnas In Developing Flowers Reveals New Levels Of Control. Molecular Systems Biology. 6, 419 (2010).
  59. Tian, C., et al. A Gene Expression Map Of Shoot Domains Reveals Regulatory Mechanisms. Nature Communications. 10 (1), 141 (2019).
  60. Townsley, B. T., Covington, M. F., Ichihashi, Y., Zumstein, K., Sinha, N. R. Brad-Seq: Breath Adapter Directional Sequencing: A Streamlined, Ultra-Simple And Fast Library Preparation Protocol For Strand Specific mRNA Library Construction. Frontiers in Plant Science. 6, 366 (2015).
  61. Song, Y., et al. A Comparative Analysis Of Library Prep Approaches For Sequencing Low Input Translatome Samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
  62. Basu, D., Haswell, E. S. Plant Mechanosensitive Ion Channels: An Ocean Of Possibilities. Current Opinion in Plant Biology. 40, 43-48 (2017).
  63. Brady, S. M., et al. A High-Resolution Root Spatiotemporal Map Reveals Dominant Expression Patterns. Science. 318 (5851), 801 (2007).

Tags

Utvecklingsbiologi utgåva 159 Arabidopsis TRAP TRAP-seq translatomprofilering celltypspecifik RNA-seq lateral rotbildning endodermis differentiering
Översätta Ribosom Affinity Rening (TRAP) för att undersöka <em>Arabidopsis thaliana</em> Root Development på en celltyp-specifik skala
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thellmann, M., Andersen, T. G.,… More

Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale. J. Vis. Exp. (159), e60919, doi:10.3791/60919 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter