Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

En brugerdefineret multifoton mikroskopi platform for Live Imaging af mus hornhinde og konjunktiva

doi: 10.3791/60944 Published: May 17, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Præsenteret her er en multiphoton mikroskopisk platform for levende mus okulær overflade billeddannelse. Fluorescerende transgene mus muliggør visualisering af cellekerner, cellemembraner, nervefibre og kapillærer inden for den okulære overflade. Ikke-lineære anden harmoniske generation signaler stammer fra kollagen strukturer giver label-fri billeddannelse for stromale arkitekturer.

Abstract

Konventionelle histologiske analyse- og cellekultursystemer er utilstrækkelige til helt at simulere in vivo-fysiologiske og patologiske dynamikker. Multiphoton mikroskopi (MPM) er blevet en af de mest populære billeddannelse modaliteter for biomedicinsk undersøgelse på cellulære niveauer in vivo, fordele omfatter høj opløsning, dyb væv penetration og minimal fototoksicitet. Vi har designet en MPM-billedplatform med en tilpasset mus øjeholder og en stereotaxic fase til billeddannelse okulær overflade in vivo. Dobbelt fluorescerende protein reporter mus muliggør visualisering af cellekerner, cellemembraner, nervefibre, og kapillærer inden for den okulære overflade. Ud over multiphoton fluorescens signaler, erhverve anden harmoniske generation (SHG) samtidig giver mulighed for karakterisering af kollagen stromale arkitektur. Denne platform kan anvendes til intravital billeddannelse med nøjagtig positionering på tværs af hele den okulære overflade, herunder hornhinde og bindehinde.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De okulære overfladestrukturer, herunder hornhinden og bindehinden, beskytter andre dybere okulære væv mod eksterne forstyrrelser. Hornhinden, den gennemsigtige forreste del af øjet, fungerer både som en brydningsobjektiv til at lede lys ind i øjet og som en beskyttende barriere. Hornhinde epitel er det yderste lag af hornhinden og består af forskellige lag af overfladiske celler, vingeceller og basalceller. Hornhinde stroma er sammensat af sofistikeret pakket kollagen lamella indlejret med keratocytter. Hornhinde endotel, et enkelt lag af flade sekskantede celler, har en vigtig rolle i at opretholde gennemsigtigheden af hornhinden ved at holde hornhinden stroma i en relativt dehydreret tilstand gennem sin pumpefunktioner1. Limbus danner grænsen mellem hornhinden og bindehinden, og er reservoiret af hornhinde epitel stamceller2. Den stærkt vaskulariserede bindehinde hjælper med at smøre øjnene ved at producere slim og tårer3.

Celledynamik af hornhinden overfladestrukturer er konventionelt undersøgt ved enten histologisk analyse eller in vitro celle kultur, som måske ikke i tilstrækkelig grad simulere in vivo celle dynamik. En ikke-invasiv levende billeddannelse tilgang kan derfor bygge bro over en sådan kløft. På grund af dens fordele, som omfatter høj opløsning, minimal fotoskader og dybere billeddybde, MPM er blevet en kraftfuld modalitet i forskellige områder af biologiskforskning 4,,5,,6,,7,8. Til cornealbilleddannelse giver MPM cellulære oplysninger fra iboende autofluorescens, der stammer fra den intracellulære NAD(P)H. Anden harmoniske generation (SHG) signaler stammer fra den ikke-centrosymmetriske type I kollagen fibre under femtosekald laserscanning giver kollagen strommal strukturer uden yderligere farvning procedurer9. Tidligere har vi og andre grupper udnyttet MPM til billeddannelse af dyre- og humane hornher9,10,,11,,12,,13,14,15.

Transgene muselinjer udviser fluorescerende proteiner i specifikke cellepopulationer har været meget anvendt til forskellige undersøgelser i cellebiologi, herunder udvikling, vævhomostase, vævsregenerering og carcinogenese. Vi brugte transgene musestammer mærket med fluorescerende proteiner til in vivo-billeddannelse af hornhinder9,,10,hårsækkene10 og epidermis10 af MPM. Den dobbelte fluorescerende musestamme med cellemembran mærket med tdTomato og cellekerne mærket med EGFP er avlet fra to musestammer: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)0tm1Ytchn/J, #021847)16 og mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. R26R-GR transgene muselinje indeholder en dobbelt fluorescerende proteinreporter konstruktioner, herunder et H2B-EGFP fusionsgen og mCherry-GPI ankersignalfusionsgen, indsat i Gt (ROSA)26Sor locus. Den mT-mG transgene stamme er en celle membran-målrettet tdTomato og EGFP fluorescerende Cre-reporter mus. Før Kretas rekombination er cellemembranprotein med tdTomato fluorescensudtryk udbredt i forskellige celler. Denne transgene musestamme gør det muligt for os at visualisere kerner-EGFP og membran med tdTomato uden Cre excitation. To hunner (R26R-GR+/+) og en hanmus (mT-mG+/+) blev avlet sammen for at producere tilstrækkeligt med mus til forsøg. Deres afkom med R26R-GR+/-;mT-mG+/- genotype, en dobbelt fluorescerende musstamme, blev anvendt i denne undersøgelse. Sammenlignet med en fluorescerende reporter mus linje som tidligere beskrevet9,10, denne dobbelte fluorescerende reporter mus stamme giver os en 50% reduceret erhvervelse af billeddannelse tid.

I dette arbejde beskriver vi en detaljeret teknisk protokol for in vivo-billeddannelse af den okulære overflade på en trinvis måde ved hjælp af vores billedplatform og dobbelte fluorescerende transgene mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med procedurer godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra National Taiwan University og Chang Gung Memorial Hospital.

1. Opsætning af multifotonmikroskopi

  1. Byg et system baseret på et opretstående mikroskop med vandnedsænkning 20x 1,00 NA mål (Figur 1A).
  2. Brug Ti: Safir laser (med tunable bølgelængde) som excitation kilde. Laserudgangsbølgelængden indstilles til 880 nm for EGFP og 940 nm for tdTomato (Figur 1A).
  3. Medtag to dichroic spejle (495 nm og 580 nm) til adskillelse af SHG/EGFP og EGFP/tdTomato (Figur 1A). Spectrally adskille SHG signaler, EGFP og tdTomato ved bandpass filtre 434/17nm, 510/84nm og 585/40nm (Figur 1A).
  4. For at optimere billedkvaliteten og for at undgå fotobleaching og vævsskader, indstille laser magt til at være omkring 35 mW for billeddannelse hornhinde og 50 mW for limbus. Mål lasereffekten, før laseren passerer det optiske system. Den nøjagtige laser strøm på prøver er omkring 8-9 mW. Det komplette mikroskopiske design er vist i figur 1A.
    BEMÆRK: Den øvre grænse for lasereffekt er sat til 70 mW for at undgå fotoblegning og vævsskader.

2. Dyrs forberedelse til levende billeddannelse

  1. Brug 8-12 uger gamle mus til eksperimentet. Intramuskulært injicere 50-80 mg/kg tiletamin HCl og zolazepam HCi for generel anæstesi. Kontroller for den manglende reaktion på tilbagetrækning refleks ved at klemme en tå. Tilstrækkelig bedøvelse er vigtig for at muliggøre stabil overvågning af vejrtrækningshastigheden.
    BEMÆRK: Mus i en alder af 8 uger eller derover anbefales, fordi deres øjne er modnet.
  2. Placer musen under anæstesi på en opvarmet fase og indsæt temperaturovervågning sonden i anus.
    FORSIGTIG: Sonden skal indsættes helt ind i analhulen uden udsættelse for luft, for at undgå overophedning af varmeapparatet og induktion af hedeslag.

3. Øjenholdning til levende billeddannelse af okulær overflade

  1. Til levende billeddannelse af den okulære overflade anvendes den specialdesignede stereoaksiske museholder bestående af to dele: en hovedholder til at stabilisere hovedet og en øjenholder for at trække øjenlågene tilbage og udsætte hele den okulære overflade (Figur 1B-D).
  2. Sæt ørestængerne i den udvendige auditive kød og hold trepunktsfiksering af hovedholderen (Figur 1B,D).
  3. Topisk anvende en opløsning på 0,4% oxybuprocain hydrochlorid i saltvand og lad det i 3 min at bedøve den okulære overflade.
  4. Sørg for øjeæblet er fremspringet af korrekt manuel øjenlåg tilbagetrækning. Ellers kan iskæmi og blødning i øjeæblet forekomme.
  5. Placer forsigtigt en løkke af polyethylenrøret i øjet holder langs øjenlåget margin for at eksponere den okulære overflade. Stabilisere øjeæblet medøjeholderenbestående af en No. 5 Dumont kraftvipper med sine spidser dækket med løkken af polyethylenrør ( Figur 1C, D).
  6. Skru hægterne ved hjælp af en knop i distale kraftbecer i øjet holderen for at holde øjeæblet stabil (Figur 1D).
  7. Påfør en øjengel med brydningsindekset på 1.338 på hornhindensoverflade som nedsænkningsmedium for at opretholde fugten i den okulære overflade hver time. Desuden, regelmæssig anvendelse af øjet gel hver time undgå uklarhed i hornhinden under billeddannelse.
  8. Drej øjeæblet med holderen, der låste sig fast på steppermotoriserede trin til billeddannelse over hele hornhinden fra den centrale hornhinde til det perifere område (Figur 1C,D).
    FORSIGTIG: Både overskydende og utilstrækkelige mængder øjengel kan påvirke kvaliteten af billeder under billeddannelse. Derfor supplerer øjengel hver time for at holde overfladen fugtig regelmæssigt er vigtigt for billeddannelse.

4. Erhvervelse af Z-serielt billede

BEMÆRK: Indstil det første og sidste dias i hver stak for at reducere de faldende bevægelsesartefakter.

  1. Før du tager billederne, skal du afbilde målretningsfeltet med en kviksølvlyskilde.
  2. Klik på symbolet på mikroskopsoftwaren for at aktivere softwaren.
  3. Vælg korrekt YDELSEsforøgning og digital forstærkning for at visualisere den cellulære struktur i den okulære overflade.
  4. Indstil det første dias og det sidste dias til at hente en stak.
  5. Angiv numeriske værdier for billedopløsning og z-trin, f.eks.
  6. Klik på knappen Start for at indsamle z-serielle billeder.
  7. Anskaf levende billeder to gange i samme område, først ved 880 nm excitation for SHG/EGFP-signaler indsamling og andet ved 940 nm excitation for EGFP/tdTomato signaler indsamling.
    BEMÆRK: Kombinationen af to stakke giver 3 kanaler billeder. Billedopløsningen og scanningsformatstørrelsen var henholdsvis 512 x 512 pixel og 157 μm x157 μm.

5. Billedbehandling og 3D-rekonstruktion

  1. Læg z-seriebillederne i Fijis software18.
  2. Vælg plugin Median 3D-filter i Fiji for at reducere baggrundslyde.
  3. Vælg filteret Pakke uskarp maske i Fiji for at gøre billederne skarpere.
  4. Klik på "Auto" i lysstyrke/kontrast for automatisk at optimere kvaliteten af billederne.
  5. Gem billederne som billedsekvenser for at kunne eksportere de z-serielle billeder.
  6. Indlæs z-serielle billeder i kommerciel software (f.eks Avizo lite) til 3D-rekonstruktion ved hjælp af volumengengivelse.
  7. I alle MPM-billeder vises EGFP-, tdTomato- og SHG-signaler i henholdsvis pseudogrøn, rød og cyanfarve.
  8. Optag 3D-strukturbilleder ved øjebliksbilledet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ved hjælp af denne live billedplatform kan musens okulære overflade visualiseres på cellulære niveauer. For at visualisere individuelle enkeltceller i den okulære overflade anvendte vi de dobbelte fluorescerende transgene mus med EGFP udtrykt i kernen og tdTomato udtrykt i cellemembranen. Kollagen-rige hornhinde stroma blev fremhævet af SHG signaler.

I hornhindepitel blev overfladiske celler, vingeceller og basalceller (figur 2) visualiseret. I de dobbelte fluorescerende transgene mus var vi i stand til at kortlægge enkelte celler fra det basale lag til de overfladiske lag i både hornhinde og limbal epitel (Figur 2). De sekskantede overfladiske celler blev observeret (hvid pilespids i figur 2). Både nuklear størrelse og internuclear afstand fra det basale lag mod de ydre lag steg i hornhinde epitel (Figur 2). De cytoplasmatiske signaler af tdTomato fluorescens indikerede, at det membranproteinrige intracellulære veskulære system, herunder Golgi-apparatet, endoplasmatisk reticulum, var spredt i vingecellerne (Figur 2).

Inden for kollagen stroma, stellate-formede keratocytter blev skitseret af membran-målretning tdTomato fluorescens i dobbelt fluorescerende transgene mus (gul pilespids i figur 3 og Figur 4). De keratocytter indlejret i kollagen stroma var mere løst fordelt end endotelceller. Desuden blev tynde forgrenede nerver i hornhinde stroma også visualiseret af membran-målretning tdTomato signaler (hvid pilespids i figur 3). Monolag af hornhinde endotelceller viste en relativt homogen sekskantet form forbundet til et honeycombed mønster (hvid pilespids i figur 4). Den limbale epitel bestod af 1-2 lag epitelceller (Figur 5). Den dobbelte fluorescerende reporter transgene mus stamme også gjort det muligt for os at billedet kapillærerne i conjunctiva (Figur 6A). 3D-arkitektur kapillærer blev rekonstrueret ved at skitsere vaskulær endotel (Figur 6B,6C).

Figure 1
Figur 1: Opsætning af MPM og roterende museholder.
(A) Opsætningen af MPM. BB) Museholderens udformning. Museholderen består af en roterende hovedholder og en øjenholder. (C) Udformningen af mus øje holderen. Øjenholderen trækker øjenlåg af en plastik løkke til at udsætte hornhinden og bindehinde. Hovedholderen og øjenholderen skrues sammen (B) på scenen for at muliggøre præcis og kontrollerbar rotation og billeddannelse af okulært overflade. DD) Fotografi af levende mus til hornhindebilleddannelse med øjenholder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Levende billeddannelse af hornhindeepitel i dobbelte fluorescerende transgene mus.
Hornhinde epitel blev afbildet lag-for-lag, til at omfatte overfladiske celler, vingeceller, og basalceller. Overfladiske celler er markeret med en hvid pilespids. Skalabar = 50 μm. (Z = dybde fra epitels øverste overflade (μm)). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Levende billeddannelse af hornhinden stroma.
Inden for hornhinden stroma, keratocytter (gul pilespids) og nervefibre (hvid pilespids) blev indlejret i kollagen stroma (i pseudo-blå farve). Skalabar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Levende billeddannelse af hornhinde endotel i det centrale hornhinde.
Monolag af sekskantede hornhinde endotelceller (hvid pilespids). Skalabar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Levende billeddannelse af limbal epitel.
Levende billeder af det limbale epitel i dobbelt fluorescerende transgene mus viste vakuolerede kerner. Skalabar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Levende billeddannelse og den tredimensionale rekonstruktion af vaskulære netværk i bindehinden.
(A) Kapillærer i konjunktival stroma blev visualiseret. Skalabar = 50 μm. bB) 3D-rekonstruktion af kapillærnet, der udføres ved hjælp af kommerciel software. Skalabar = 50 μm. (C,D) Forstørrede 3D-visninger af billedet vist i panel B. Fluorescerende vaskulære endotelceller skitseret kapillærer (hvide og gule pilespidser). Skalabjælke til panel C = 6,26 μm og til panel D = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne specialbyggede MPM-billeddannelsesplatform med en kontrolsoftware blev brugt til intravital billeddannelse af museepitelorganer, herunder hud10,hårsækken10 og okulær overflade9,10 (Figur 1A). Det specialbyggede system blev brugt til sin fleksibilitet i at ændre de optiske komponenter til forskellige eksperimenter, siden begyndelsen af vores projekt. Denne billedbehandlingsmetode er alsidig til kommercielle MPM-produkter. Denne protokol beskriver en detaljeret metode til intravital billeddannelse af musens okulære overflade ved MPM-billedplatform. Ved hjælp af en stereotaxic mus indehaveren(Figur 1B),vi var i stand til at visualisere forskellige regioner på tværs af hele den okulære overflade. Den nøjagtige positioneringsfunktion gør det muligt at overvåge tidsmæssige celledynamiske ændringer i et bestemt område.

Selv om flere undersøgelser af murine corneal MPM imaging er blevet rapporteret in vivo19,,20,,21,22, der er flere tekniske begrænsninger, som man skal overvinde for at opnå kontinuerlig billeddannelse over en lang periode f.eks holde øjeæblet i en stabil position, faldende bevægelse artefakter under billeddannelse og erhverve billeder i en lang periode uden photobleaching. Sammenlignet med plast øjekop designet til hornhinde billeddannelse in vivo med relativt begrænset adgang til øjet overflade20, vores øjenholder ikke kun holder øjeæblet fuldt eksponeret, men også gør hele okulære overflade tilgængelig for målet linse (Figur 1C).

Selv om vitale farvestoffer eller sonder rutinemæssigt anvendes som fluorescerende reportere til at mærkecellerne 20,21,22, invasiv af nåleinjektion kan forstyrre den naturlige celle dynamik af organer under den fysiologiske hjemastatske tilstand eller væv regenerering proces. R26R-GR transgene mus stamme udtrykker stabil og lyse grønne fluorescerende protein i cellekernen og er blevet brugt til visualisering af celledynamik af muskel forfædre i spøgelsefibre23. mT-mG reporter transgene mus linje blev brugt til at analysere differentiering af epidermale celler inhomeostasis24. Sammenlignet med en enkelt reporter fluorescerende transgen mus linje, denne dobbelte fluorescerende transgene musestamme reduceret tidspunktet for billedet erhvervelse til halvdelen ved samtidig at give cellestruktur oplysninger om både cellekerner og cellemembraner. Ved at dreje museholderen blev flade kerner af både endotel- og blodlegemer visualiseret i vaskulære lumen ved hjælp af dobbelt fluorescerende transgen musestamme (Figur 6). Derfor kan denne transgene muselinje bruges til at undersøge celledynamikken i kapillærer i fremtiden, hvilket er nøglen til den patologiske hornhindenulvaskularisering. Desuden kan denne in vivo imaging platform også bruges til at udforske immunrespons i hornhinde patologier ved fluorescerende mærkning af forskellige immunceller, såsom neutrofiler25, langerhans celler26, regulerende T-celler (Tregs)27 og mastceller28.

Afslutningsvis viste vi en kraftfuld intravital MPM billeddannelse platform for mus okulær overflade undersøgelse. Kombinationen af levende MPM stereotaxic fase og særlige fluorescerende transgene mus muliggør real-time visualisering af forskellige cellulære og ekstracellulære strukturer i den okulære overflade, herunder hornhinde, limbus og bindehinde. Denne intravital billeddannelse platform kan bidrage til at udforske celle dynamik ne i den okulære overflade og, med yderligere udvikling, kan potentielt anvendes til oftalmologiske narkotika screening i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker tilskudsstøtte fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) og Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AVIZO Lite software Thermo Fisher Scientific Version: 2019.3.0
Bandpass filters Semrock FF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrors Semrock FF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
Galvano Thorlabs GVS002
Jade BIO control software SouthPort Corporation Jade BIO
Oxybuprocaine hydrochloride Sigma O0270000
PMT Hamamatsu H7422A-40
Polyesthylene Tube BECTON DICKINSON 427401
Stereotaxic mouse holder Step Technology Co.,Ltd 000111
Ti: Sapphire laser Spectra-Physics Mai-Tai DeepSee
Upright microscopy Olympus BX51WI
Vidisic Gel Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH D13581
Zoletil Virbac VR-2831

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37, (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
  4. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, (12), 5251-5259 (2006).
  5. Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, Pt 2 83-104 (2000).
  6. Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352, (6292), 1471-1474 (2016).
  7. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19, (2), 155-163 (2017).
  8. Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20, (12), 1361-1369 (2018).
  9. Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
  10. Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. (2019).
  11. Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (7), 3501-3507 (2012).
  12. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12, (2), 024013 (2007).
  13. Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2, (1), 10-20 (2004).
  14. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48, (3), 1087-1094 (2007).
  15. Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91, (2), 308-314 (2010).
  16. Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7, (9), 46171 (2012).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, (9), 593-605 (2007).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  19. Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
  20. Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, (10), 6526-6536 (2013).
  21. Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
  22. Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
  23. Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18, (2), 243-252 (2016).
  24. Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23, (5), 677-686 (2018).
  25. Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135, (4), 1181-1184 (2015).
  26. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, (5), 643-654 (2005).
  27. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191, (6), 3049-3056 (2013).
  28. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, (6), 973-984 (2011).
En brugerdefineret multifoton mikroskopi platform for Live Imaging af mus hornhinde og konjunktiva
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).More

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter