Une plate-forme personnalisée de microscopie multiphoton pour l’imagerie en direct de la cornée de souris et de la conjonctive
Summary
Présenté ici est une plate-forme microscopique multiphoton pour l’imagerie de surface oculaire de souris vivante. La souris transgénique fluorescente permet la visualisation des noyaux cellulaires, des membranes cellulaires, des fibres nerveuses et des capillaires à l’intérieur de la surface oculaire. Les signaux non linéaires de deuxième génération harmonique dérivés de structures collagènes fournissent une imagerie sans étiquette pour les architectures stromales.
Abstract
Les systèmes d’analyse histologique et de culture cellulaire conventionnels sont insuffisants pour simuler complètement la dynamique physiologique et pathologique in vivo. La microscopie multiphoton (MPM) est devenue l’une des modalités d’imagerie les plus populaires pour l’étude biomédicale aux niveaux cellulaires in vivo, les avantages incluent la haute résolution, la pénétration profonde des tissus et la phototoxicité minimale. Nous avons conçu une plate-forme d’imagerie MPM avec un porte-yeux de souris personnalisé et un stade stéréotaxique pour l’imagerie de la surface oculaire in vivo. La souris reporter de protéine fluorescente double permet la visualisation des noyaux cellulaires, des membranes cellulaires, des fibres nerveuses, et des capillaires dans la surface oculaire. En plus des signaux de fluorescence multiphoton, l’acquisition de la deuxième génération harmonique (SHG) permet simultanément la caractérisation de l’architecture stromale collagène. Cette plate-forme peut être utilisée pour l’imagerie intravitale avec un positionnement précis sur toute la surface oculaire, y compris la cornée et la conjonctive.
Introduction
Les structures oculaires de surface, y compris la cornée et la conjonctive, protègent d’autres tissus oculaires plus profonds contre les perturbations externes. La cornée, la partie avant transparente de l’œil, fonctionne à la fois comme une lentille réfractive pour diriger la lumière dans l’œil et comme une barrière protectrice. L’épithélium cornéen est la couche la plus externe de la cornée et se compose de couches distinctes de cellules superficielles, de cellules d’aile et de cellules basales. Le stroma cornéen est composé de lamelles collagènes sophistiquées intégrées aux kératocytes. L’endothélium cornéen, une seule couche de cellules hexagonales plates, a un rôle important dans le maintien de la transparence de la cornée en maintenant le stroma cornéen dans un état relativement déshydraté grâce à ses fonctions de pompage1. Limbus forme la frontière entre la cornée et la conjonctive, et est le réservoir de cellules souches épithéliales cornéennes2. La conjonctive très vascularisée aide à lubrifier les yeux en produisant du mucus et des larmes3.
La dynamique cellulaire des structures de surface cornéennes est traditionnellement étudiée soit par l’analyse histologique ou la culture cellulaire in vitro, qui pourrait ne pas simuler adéquatement la dynamique cellulaire in vivo. Une approche non invasive d’imagerie vivante peut donc combler un tel écart. En raison de ses avantages, qui comprennent la haute résolution, photodamage minimal et profondeur d’imagerie plus profonde, MPM est devenu une modalité puissante dans divers domaines de la recherche biologique4,5,6,7,8. Pour l’imagerie cornéenne, MPM fournit des informations cellulaires provenant de l’autofluorescence intrinsèque dérivée du NAD(P)H intracellulaire. Les signaux de deuxième génération harmonique (SHG) dérivés des fibres de collagène de type I non centrosymétriques sous balayage laser femtoseconde fournissent des structures stromales collagènes sans procédures de coloration supplémentaires9. Auparavant, nous et d’autres groupes avons exploité MPM pour l’imagerie des cornées animales et humaines9,10,11,12,13,14,15.
Les lignées transgéniques de souris présentant des protéines fluorescentes dans des populations cellulaires spécifiques ont été largement utilisées pour diverses études en biologie cellulaire, y compris le développement, l’homéostasie tissulaire, la régénération des tissus et la carcinogenèse. Nous avons utilisé des souches de souris transgéniques étiquetées avec des protéines fluorescentes pour l’imagerie in vivo des cornées9,10, follicules pileux10 et épiderme10 par MPM. La double souche de souris fluorescente avec membrane cellulaire étiquetée avec tdTomato et noyau cellulaire marqué avec EGFP est élevée à partir de deux souches de souris: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 et mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. La ligne transgénique de souris R26R-GR contient une double construction de radiopro protéines fluorescentes, y compris un gène de fusion H2B-EGFP et un gène de fusion de signal d’ancrage mCherry-GPI, inséré dans le locus gt (ROSA)26Sor. La souche transgénique mT-mG est une souris tdTomato et Cre-reporter fluorescente ciblée par membrane cellulaire. Avant la recombinaison de Cre, la protéine de membrane cellulaire avec l’expression de fluorescence tdTomato est largement présente dans diverses cellules. Cette souche de souris transgénique nous permet de visualiser les noyaux-EGFP et la membrane avec tdTomato sans excitation Cre. Deux femelles (R26R-GR+/+) et une souris transgénique mâle (mT-mG+/+) ont été élevées ensemble pour produire suffisamment de souris pour des expériences. Leur progéniture avec R26R-GR+/-;mT-mG+/- génotype, une souche de souris fluorescentes doubles, ont été utilisées dans cette étude. Par rapport à une ligne de souris de journaliste fluorescent comme décrit précédemment9,10, cette souche de souris double reporter fluorescent nous fournit une acquisition réduite de 50% de temps d’imagerie.
Dans ce travail, nous décrivons un protocole technique détaillé pour l’imagerie in vivo de la surface oculaire d’une manière étape par étape utilisant notre plate-forme d’imagerie et des souris transgéniques fluorescentes doubles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette plate-forme d’imagerie MPM sur mesure avec un logiciel de contrôle a été utilisée pour l’imagerie intravitale des organes épithéliaux de souris, y compris la peau10, follicule pileux10 et la surface oculaire9,10 (Figure 1A). Le système sur mesure a été utilisé pour sa flexibilité dans le changement des composants optiques pour diverses expériences, depuis le début…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le ministère des Sciences et de la Technologie de Taïwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) et Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPG3G1621, CRPPG3G1622, CRPPG3G1623).
Materials
| AVIZO Lite software | Thermo Fisher Scientific | Version: 2019.3.0 | |
| Bandpass filters | Semrock | FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40 |
|
| Dichroic mirrors | Semrock | FF495-Di01-25×36 FF580-Di01-25×36 | |
| Galvano | Thorlabs | GVS002 | |
| Jade BIO control software | SouthPort Corporation | Jade BIO | |
| Oxybuprocaine hydrochloride | Sigma | O0270000 | |
| PMT | Hamamatsu | H7422A-40 | |
| Polyesthylene Tube | BECTON DICKINSON | 427401 | |
| Stereotaxic mouse holder | Step Technology Co.,Ltd | 000111 | |
| Ti: Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai-Tai DeepSee | |
| Upright microscopy | Olympus | BX51WI | |
| Vidisic Gel | Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH | D13581 | |
| Zoletil | Virbac | VR-2831 |
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