Summary
这里展示的是一个多光子显微平台，用于实时小鼠眼表面成像。荧光转基因小鼠能够可视化细胞核、细胞膜、神经纤维和眼表面的毛细血管。从胶原结构派生的非线性二谐波生成信号为频闪结构提供了无标签成像。
Abstract
传统的组织分析和细胞培养系统不足以完全模拟体内的生理和病理动力学。多光子显微镜 （MPM） 已成为体内细胞水平上生物医学研究最流行的成像模式之一，其优点包括高分辨率、深层组织渗透和极小光毒性。我们设计了一个 MPM 成像平台，具有定制的鼠标眼架和用于体内眼表面成像的立体轴舞台。双荧光蛋白报告鼠标能够可视化细胞核、细胞膜、神经纤维和眼表面的毛细血管。除了多光子荧光信号外，获得第二谐波生成 （SHG） 可同时进行胶原蛋白生成结构。该平台可用于病毒内成像，可准确定位整个眼表面，包括角膜和结膜。
Introduction
眼表面结构，包括角膜和结膜，保护其他更深的眼组织免受外部干扰。角膜是眼睛的透明前部，既充当折射透镜，可将光线引导到眼睛中，也作为保护屏障。角膜上皮是角膜的最外层，由不同的表面细胞层、翼细胞和基底细胞组成。角膜频闪由嵌入角细胞的复杂包装胶原蛋白组成。角膜内皮是一层扁平六角细胞，通过泵送功能1保持角膜频闪，在保持角膜的透明度方面具有重要作用。林巴斯形成角膜和结膜之间的边界，是角膜上皮干细胞的蓄水池2。高度血管化的结膜有助于润滑眼睛产生粘液和眼泪3。
角膜表面结构的细胞动力学由组织学分析或体外细胞培养学进行常规研究，可能不足以模拟体内细胞动力学。因此，非侵入性实时成像方法可以弥补这种差距。由于其具有高分辨率、最小光损和深成像深度等优点，MPM已成为生物研究4、5、6、7、8,等不同,6,7领域的有力模式。对于角膜成像，MPM 提供来自细胞内NAD（P）H的固有自荧光的细胞信息。第二次谐波生成（SHG）信号来自非分色类型我胶原纤维在飞秒激光扫描下提供胶原蛋白生成结构，无需额外的染色程序9。此前，我们和其他团体利用MPM对动物和人类角膜进行成像，9、10、11、12、13、14、15。,10,11,12,13,14,15
在特定细胞群中表现出荧光蛋白的转基因小鼠系已广泛应用于细胞生物学的各种研究，包括发育、组织平衡、组织再生和致癌。我们使用标有荧光蛋白的转基因小鼠菌株，通过MPM对角膜9、10、,10毛囊10和表皮10进行体内成像。双荧光小鼠株与细胞膜标记与tDTomato和细胞核标记与EGFP是由两个小鼠株培育：R26R-GR（B6;129-Gt（ROSA）26Sortm1Ytchn/J，#021847）16和16tm1Ytchn/JmT-mG（Gt（ROSA26）ACTB-ttomato-EGFP，#007676ACTB-tdTomato-EGFP17R26R-GR转基因小鼠线包含双荧光蛋白报告器结构，包括H2B-EGFP融合基因和mCherry-GPI锚点信号融合基因，插入Gt（ROSA）26Sor位点。mT-mG转基因菌株是一种细胞膜靶向的tdTomato和EGFP荧光Cre-reporter小鼠。在Cre重组之前，具有tdTomato荧光表达的细胞膜蛋白广泛存在于各种细胞中。这种转基因小鼠菌株使我们能够可视化核-EGFP和膜与tdTomato没有Cre激发。两只雌性（R26R-GR+/+）和一只雄性（mT-mG+/+）转基因小鼠一起繁殖，以产生足够的小鼠进行实验。+/+他们的后代与R26R-GR+/--;mT-mG+/-基因型，双荧光小鼠株，在这项研究中被使用。+/-+/-与前面描述的9、10号荧光记者鼠标线相比，10这种双荧光测量仪的成像时间缩短了50%。
在这项工作中，我们描述了使用我们的成像平台和双荧光转基因小鼠逐步进行眼表面体内成像的详细技术方案。
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Protocol
所有动物实验都是按照台湾国立大学动物护理与使用委员会（IACUC）和长贡纪念医院批准的程序进行的。
1. 多光度显微镜设置
- 构建一个基于直立显微镜的系统，具有浸入水 20x 1.00 NA 目标（图 1A）。
- 使用 Ti：蓝宝石激光（可调波长）作为激励源。将EGFP的激光输出波长设置为 880 nm，为 tdTomato 将激光输出波长设置为 940 nm（图 1A）。
- 包括两个双色镜（495 nm 和 580 nm），用于分离 SHG/EGFP 和 EGFP/tdTomato（图 1A）。通过带通滤波器 434/17nm、510/84nm 和 585/40nm（图 1A ） 将 SHG 信号、EGFP 和 tdTomato 分镜分离（ 图1A）。
- 为了优化图像质量，避免光漂白和组织损伤，将激光功率设置为约35 mW，用于成像角膜，50 mW用于边缘。在激光通过光学系统之前测量激光功率。样品的激光功率约为8-9 mW。完整的微观设计如图 1A所示。
注：激光功率的上限设置为 70 mW，以避免光漂白和组织损伤。
2. 动物对活成像的准备
- 使用8-12周大的小鼠进行实验。肌肉内注射50-80毫克/千克的瓦塔胺HCl和佐拉泽帕姆HCl用于全身麻醉。通过捏一个手趾检查对戒断反射缺乏反应。充分的麻醉对于稳定呼吸速率监测非常重要。
注：建议在8周或以上的老鼠，因为他们的眼球成熟。 - 将鼠标放在加热的舞台上麻醉下，并将温度监测探头插入到 Anus 中。
注意：探头必须完全插入肛门腔，而不暴露在空气中，以避免加热器过热和中暑感应。
3. 眼表面活眼成像眼握
- 对于眼表面的实时成像，请使用定制设计的立体鼠标支架，由两部分组成：一个头架来稳定头部，一个眼架用来缩回眼睑并露出整个眼表面（图1B-D）。
- 将耳条插入外耳肉，并保持头部支架的三点固定（图1B，D）。
- 在盐水中应用0.4%的盐酸氧丙酸溶液，并留3分钟麻醉眼表面。
- 通过适当的手动眼睑缩回确保眼球突出。否则，可能发生缺血和眼球出血。
- 小心地沿眼睑边缘放置眼架聚乙烯管的环，以暴露眼表面。用由 5 号 Dumont 钳子组成的眼架稳定眼球，其尖端覆盖着聚乙烯管的环（图 1C，D）。
- 使用眼架两端钳中的旋钮拧紧螺钉以保持眼球稳定（图 1D）。
- 将眼部凝胶作为浸入介质，在角膜表面涂抹折射率为 1.338 的眼凝胶，每小时保持眼表面的水分。此外，每小时定期使用眼凝胶，避免在成像过程中在角膜中出现云彩。
- 旋转眼球与支架锁定在步进电机化阶段成像整个角膜表面从中央角膜到外围区域（图1C，D）。
注意：过量和不足的眼凝胶会影响成像过程中的图像质量。因此，每小时补充眼凝胶以保持表面的定期湿润对于成像非常重要。
4. Z 串行图像采集
注：在每个堆栈中设置第一张和最后一张幻灯片，以减少下降运动伪影。
- 在拍摄图像之前，使用汞光源对目标场进行成像。
- 单击显微镜软件的符号以打开软件。
- 选择适当的PMT增益和数字增益，以可视化眼表面的细胞结构。
- 设置第一张幻灯片和最后一张幻灯片以获取堆栈。
- 输入图像分辨率和 z 步进的数值，例如 512 x 512 和 1 μm 作为 z 步进。
- 单击"开始 " 按钮以收集 z 序列图像。
- 在同一区域获取两次实时图像，第一次为 SHG/EGFP 信号采集的 880 nm 激发，第二次在 940 nm 的激励下采集 EGFP/tdTomato 信号。
注：两个堆栈的组合提供 3 个通道图像。图像分辨率和扫描格式大小分别是 512 x 512 像素和 157 μm x 157 μm。
5. 图像处理和三元重建
- 将 z 序列图像加载到斐济软件18 中。
- 选择斐济的 插件中位数 3D 滤波器以减少背景噪音。
- 选择斐济的 "包取消锐化蒙 版"滤镜以锐化图像。
- 单击亮度/对比度中的"自动"以自动优化图像质量。
- 将图像保存为图像序列，以便能够导出 z 序列图像。
- 将 z 序列图像加载到商业软件（例如 Avizo lite）中，使用音量渲染进行 3D 重建。
- 在所有 MPM 图像中，分别以伪绿色、红色和青色呈现 EGFP、tdTomato 和 SHG 信号。
- 按快照捕获 3D 结构图片。
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Representative Results
使用这个实时成像平台，鼠标眼表面可以在细胞水平上可视化。为了可视化眼表面的单个细胞，我们采用了双荧光转基因小鼠，其EGFP在细胞核中表达，tdTomato在细胞膜中表达。富含胶原蛋白的角膜频闪被SHG信号突出显示。
在角膜上皮，表面细胞，翼细胞和基底细胞（图2）被可视化。在双荧光转基因小鼠中，我们能够将单个细胞从基底层映射到角膜和边缘上皮的表层（图2）。观察到六边形表面细胞（图2中的白色箭头）。核大小和核间间隔从基层到外层增加角膜上皮（图2）。tdTomato荧光的细胞质信号表明，膜富含蛋白质的细胞内车辆系统，包括高尔吉装置、内质神经，分散在翼细胞中（图2）。
在胶原蛋白频闪中，由双荧光转基因小鼠的膜靶向tdTomato荧光（图3和图4中的黄色箭头）概述了硬质状角细胞。嵌入在胶原蛋白频闪中的角细胞比内皮细胞更松散。此外，角膜频闪中的细枝神经也通过膜靶向tdTomato信号（图3中的白色箭头）可视化。角膜内皮细胞的单层显示一个相对均匀的六边形形状，连接成蜂窝状图案（图4中的白色箭头）。边缘上皮由1~2层上皮细胞组成（图5）。双荧光报告器转基因小鼠应变也使我们能够成像在结膜内的毛细血管（图6A）。通过概述血管内皮（图6B，6C）重建毛细血管的3D结构。
图1：MPM和旋转鼠标支架的设置。
（A） MPM 的设置。（B） 鼠标架的设计。鼠标架由旋转头架和眼架组成。（C） 鼠标眼架的设计。眼架通过塑料环缩回眼睑，露出角膜和结膜。头部支架和眼架在舞台上拧在一起 （B），以便精确且可控的眼表面旋转和成像。（D） 带眼架的活鼠眼角膜成像照片。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：双荧光转基因小鼠角膜上皮的活成像。
角膜上皮被层层成像，包括表面细胞、翼细胞和基底细胞。表面单元格用白色箭头标记。比例线 = 50 μm。（Z = 上皮 （μm） 顶部表面的深度）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：角膜频闪的实时成像。
在角膜频闪中，角膜细胞（黄色箭头）和神经纤维（白色箭头）嵌入胶原蛋白频闪（伪蓝色）。比例线 = 50 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：中央角膜角膜内皮的活成像。
六角角角内皮细胞的单层（白色箭头）。比例线 = 50 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：肢体上皮的活图。
双荧光转基因小鼠的肢体上皮的实时图像显示，细胞核已化。比例线 = 50 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：活体成像与结膜血管网络的三维重建。
（A） 结膜频闪的毛细血管被可视化。比例线 = 50 μm。（B） 使用商业软件执行毛细管网络的 3D 重建。比例线 = 50 μm。（C，D）面板 B 所示图像的放大 3D 视图。荧光血管内皮细胞勾勒出毛细血管（白色和黄色箭头）。面板 C = 6.26 μm 和面板 D 的刻度杆 = 10 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这个定制的MPM成像平台与控制软件用于小鼠上皮器官的病毒内成像，包括皮肤10，毛囊10和眼表面9，10（109图1A）。自项目开始以来，定制系统一直用于灵活地更改各种实验的光学元件。这种成像方法适用于商用 MPM 产品。该协议描述了通过MPM成像平台对小鼠眼表面进行病毒内成像的详细方法。使用立体鼠标架（图1B），我们能够在整个眼表面可视化不同的区域。精确的定位能力可以监控指定区域中的时态单元动态变化。
虽然在体内已经报告了几种关于穆林角膜MPM成像的研究，20,21,但存在一些技术限制，需要克服这些限制才能长期实现连续成像，例如，将眼球保持稳定位置，在成像过程中减少运动伪影，在长时间内获取图像而不进行光漂白。与专为体内角膜成像设计的塑料眼罩相比，我们眼架对眼表面的进入相对有限，不仅使眼球完全暴露，而且使整个眼表面都能接触到客观透镜（图1C）。
虽然重要的染料或探针通常用作荧光处理器，以标记细胞20，21，22，,21,22针头注射的侵入性可能会破坏器官的自然细胞动力学在生理的静态或组织再生过程。R26R-GR转基因小鼠菌株在细胞核中表达稳定明亮的绿色荧光蛋白，并用于幽灵纤维23中肌肉祖细胞的细胞动力学可视化。mT-mG记者转基因小鼠线用于分析表皮细胞在家常细胞24的分化。与单一的荧光转基因小鼠线相比，这种双荧光转基因小鼠菌株通过提供细胞核和细胞膜的细胞结构信息，将图像采集时间缩短到一半。通过旋转小鼠支架，使用双荧光转基因小鼠菌株在血管流明中可视化内皮细胞和血细胞的扁平核（图6）。因此，这种转基因小鼠系可用于研究毛细血管未来的细胞动力学，这是病理角膜新血管化的关键。此外，这种体内成像平台还可用于通过荧光标记不同免疫细胞，如中性粒细胞25，朗格汉斯细胞26，调节T细胞（Tregs）27和桅杆细胞28，探索角膜病理中的免疫反应。
最后，我们演示了一个强大的小鼠眼表面研究内MPM成像平台。活的MPM立体轴阶段和特殊的荧光转基因小鼠的结合，使眼表面不同的细胞和细胞外结构，包括角膜、肢体和结膜的实时可视化。这个病毒内成像平台可以帮助探索眼表面的细胞动力学，随着进一步发展，将来有可能用于眼科药物筛查。
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Disclosures
提交人宣称他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢台湾科技部（106-2627-M-002-034，107-2314-B-182A-089）的赠款支持， 108-2628-B-002-023，108-2628-B-002-023），台湾国立大学医院（NTUH108-T17）和台湾长荣纪念医院（CMRPG3G1621，CMRPG3G1622，CMRPG3G1623）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AVIZO Lite software | Thermo Fisher Scientific | Version: 2019.3.0 | |
| Bandpass filters | Semrock | FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40 |
|
| Dichroic mirrors | Semrock | FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36 |
|
| Galvano | Thorlabs | GVS002 | |
| Jade BIO control software | SouthPort Corporation | Jade BIO | |
| Oxybuprocaine hydrochloride | Sigma | O0270000 | |
| PMT | Hamamatsu | H7422A-40 | |
| Polyesthylene Tube | BECTON DICKINSON | 427401 | |
| Stereotaxic mouse holder | Step Technology Co.,Ltd | 000111 | |
| Ti: Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai-Tai DeepSee | |
| Upright microscopy | Olympus | BX51WI | |
| Vidisic Gel | Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH | D13581 | |
| Zoletil | Virbac | VR-2831 |
References
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