Summary
Qui è presentata una piattaforma microscopica multifoto per l'imaging della superficie oculare del mouse vivo. Il mouse transgenico fluorescente consente la visualizzazione di nuclei cellulari, membrane cellulari, fibre nervose e capillari all'interno della superficie oculare. I segnali di seconda generazione armonica non lineari derivati da strutture collagenose forniscono immagini senza etichette per architetture tropiche.
Abstract
L'analisi itologica convenzionale e i sistemi di coltura cellulare sono insufficienti per simulare completamente le dinamiche fisiologiche e patologiche in vivo. La microscopia multifotona (MPM) è diventata una delle modalità di imaging più popolari per lo studio biomedico a livelli cellulari in vivo, i vantaggi includono alta risoluzione, penetrazione dei tessuti profondi e fototossicità minima. Abbiamo progettato una piattaforma di imaging MPM con un supporto per gli occhi per mouse personalizzato e uno stadio stereotassico per l'imaging della superficie oculare in vivo. Il mouse reporter a doppia proteina fluorescente consente la visualizzazione di nuclei cellulari, membrane cellulari, fibre nervose e capillari all'interno della superficie oculare. Oltre ai segnali di fluorescenza multifotona, l'acquisizione di seconda generazione armonica (SHG) consente contemporaneamente la caratterizzazione dell'architettura stroa collagenos. Questa piattaforma può essere utilizzata per l'imaging intravitale con posizionamento accurato su tutta la superficie oculare, tra cui cornea e congiuntiva.
Introduction
Le strutture superficiali oculari, tra cui la cornea e la congiuntiva, proteggono altri tessuti oculari più profondi da disturbi esterni. La cornea, la parte anteriore trasparente dell'occhio, funziona sia come lente refrattiva per dirigere la luce nell'occhio sia come barriera protettiva. L'epitelio corneale è lo strato più esterno della cornea ed è costituito da strati distinti di cellule superficiali, cellule alali e cellule basali. Lo stroma corneale è composto da lamellae collagenose sofisticate e confezionate incastonate con cheratociti. L'endotelio corneale, un singolo strato di cellule esagonali piatte, ha un ruolo importante nel mantenere la trasparenza della cornea mantenendo lo stroma corneale in uno stato relativamente disidratato attraverso le sue funzioni dipompaggio 1. Limbus forma il confine tra la cornea e la congiuntiva, ed è il serbatoio delle cellule staminali epiteliali corneali2. La congiuntiva altamente vascolarizzata aiuta a lubrificare gli occhi producendo muco e lacrime3.
Le dinamiche cellulari delle strutture della superficie corneale sono convenzionalmente studiate dall'analisi sittologica o dalla coltura cellulare in vitro, che potrebbe non simulare adeguatamente le dinamiche cellulari in vivo. Un approccio non invasivo per l'imaging dal vivo può, pertanto, colmare tale lacuna. Grazie ai suoi vantaggi, che includono alta risoluzione, minimo fotodamage e profondità di imaging più profonda, MPM è diventato una potente modalità in diverse aree della ricerca biologica4,5,6,7,8. Per l'imaging corneale, MPM fornisce informazioni cellulari dall'autofluorescenza intrinseca derivata dal NAD(P)H intracellulare. I segnali di seconda generazione armonica (SHG) derivati dalle fibre di collagene di tipo I non centrosmimetriche sotto la scansione laser femtosecondi forniscono strutture stromali collagenose senza ulteriori procedure di colorazione9. In precedenza, noi e altri gruppi abbiamo sfruttato MPM per l'imaging di cornee animali e umane9,10,11,12,13,14,15.
Linee di topo transgenici che presentano proteine fluorescenti in specifiche popolazioni cellulari sono state ampiamente utilizzate per vari studi nella biologia cellulare, tra cui lo sviluppo, l'omeostasi dei tessuti, la rigenerazione dei tessuti e la carcinogenesi. Abbiamo usato ceppi di topi transgenici etichettati con proteine fluorescenti per l'imaging in vivo di cornee9,10, follicolipiliferi 10 ed epidermide10 da MPM. Il ceppo del topo a doppia fluorescente con membrana cellulare etichettata con tdTomato e nucleo cellulare etichettato con EGFP è allevato da due ceppi di topo: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 e mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. La linea di topi transgenici R26R-GR contiene un duplice costrutto di proteine fluorescenti, tra cui un gene di fusione H2B-EGFP e un gene di fusione del segnale di ancoraggio mCherry-GPI, inseriti nel locus Gt (ROSA)26Sor. Il ceppo transgenico mT-mG è un tdTomato mirato alla membrana cellulare e topi Cre-reporter fluorescenti EGFP. Prima della ricombinazione di Cre, la proteina della membrana cellulare con espressione di fluorescenza tdTomato è ampiamente presente in varie cellule. Questo ceppo di topo transgenico ci permette di visualizzare nuclei-EGFP e membrana con tdTomato senza eccitazione Cre. Due femmine (R26R-GR )eun topo transgenico maschio (mT-mG)sono state allevate insieme per produrre topi sufficienti per gli esperimenti. In questo studio sono stati utilizzati la loro prole con R26R-GR--;mT-mG-/- genotipo, un doppio ceppo di topi fluorescenti. Rispetto a una linea di topo fluorescente come descrittoin precedenza 9,10, questo ceppo di topo a doppio reporter fluorescente ci fornisce un 50% di acquisizione ridotta del tempo di imaging.
In questo lavoro, descriviamo un protocollo tecnico dettagliato per l'imaging in vivo della superficie oculare in modo passo-passo utilizzando la nostra piattaforma di imaging e i topi transgenici a doppia fluorescente.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le procedure approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della National Taiwan University e chang Gung Memorial Hospital.
1. Configurazione della microscopia multifoto
- Costruire un sistema basato su un microscopio verticale con immersione in acqua 20x 1.00 obiettivo NA (Figura 1A).
- Usa Ti: laser zaffiro (con lunghezza d'onda regolabile) come fonte di eccitazione. Impostare la lunghezza d'onda di uscita laser su 880 nm per EGFP e 940 nm per tdTomato (Figura 1A).
- Includere due specchi dicroici (495 nm e 580 nm) per la separazione di SHG/EGFP e EGFP/tdTomato (Figura 1A). Separare i segnali SHG, EGFP e tdTomato mediante i filtri del passabanda 434/17nm, 510/84nm e 585/40nm (Figura 1A).
- Al fine di ottimizzare la qualità dell'immagine ed evitare danni da fotobleaching e tessuti, impostare la potenza laser a circa 35 mW per l'imaging cornea e 50 mW per limbus. Misurare la potenza del laser prima che il laser passi il sistema ottico. L'esatta potenza laser sui campioni è di circa 8-9 mW. La progettazione microscopica completa è illustrata nella Figura 1A.
NOTA: Il limite superiore della potenza laser è impostato su 70 mW per evitare il foto-sbiancamento e danni ai tessuti.
2. Preparazione degli animali per l'imaging dal vivo
- Utilizzare topi di 8-12 settimane per l'esperimento. Iniettare intramuscolare 50-80 mg/kg di HCl di tiletamine e zolazepam HCl per anestesia generale. Controllare la mancanza di risposta al riflesso di ritiro pizzicando un dito del piedi. Un'anetizzazione sufficiente è importante per consentire un monitoraggio stabile della frequenza respiratoria.
NOTA: I topi all'età di 8 settimane o più sono raccomandati perché i loro bulbi oculari sono maturati. - Posizionare il mouse sotto anestesia su uno stadio riscaldato e inserire la sonda di monitoraggio della temperatura nell'ano.
CAUTION: La sonda deve essere inserita completamente nella cavità avaale senza esposizione all'aria, per evitare il surriscaldamento del riscaldatore e l'induzione del colpo di calore.
3. Tenuta oculare per l'imaging live della superficie oculare
- Per l'imaging live della superficie oculare, utilizzare il supporto del mouse stereotassico progettato su base personalizzata composto da due parti: un supporto per la testa per stabilizzare la testa e un portaocchi per ritrarre le palpebre ed esporre l'intera superficie oculare (Figura 1B-D).
- Inserire le barre dell'orecchio nella carne uditiva esterna e mantenere la fissazione a tre punti del supporto della testa(Figura 1B,D).
- Applicare con suarità una soluzione di idro cloruro di ossibuprocaina dello 0,4% in salina e lasciarla per 3 minuti per anestetizzare la superficie oculare.
- Assicurarsi che il bulbo oculare sia sporgente da una corretta retrazione manuale della palpebra. In caso contrario, può verificarsi ischemia e sanguinamento del bulbo oculare.
- Posizionare con attenzione un anello del tubo di polietilene del detentore degli occhi lungo il margine della palpebra per esporre la superficie oculare. Stabilizzare il bulbo oculare con il portaoculare composto da una forzata Dumont n. 5 con le punte coperte con il loop di tubo di polietilene (Figura 1C,D).
- Le foci della vite che utilizzano una manopola in fopinge distale del portaoculare per mantenere stabile il bulbo oculare (Figura 1D).
- Applicare un gel per gli occhi con l'indice di rifrazione di 1.338 sulla superficie corneale come mezzo di immersione per mantenere l'umidità della superficie oculare ogni ora. Inoltre, l'applicazione regolare del gel per gli occhi ogni ora evita di offuscarsi in cornea durante l'imaging.
- Ruotare il bulbo oculare con il supporto bloccato sullo stage stepper-motorizzato per l'imaging su tutta la superficie corneale dalla cornea centrale alla regione periferica (Figura 1C,D).
CAUTION: Sia l'eccesso che la quantità insufficiente di gel oculari possono influire sulla qualità delle immagini durante l'imaging. Pertanto, integrare il gel per gli occhi ogni ora per mantenere la superficie umida regolarmente è importante per l'imaging.
4. Acquisizione di immagini seriali
NOTA: impostare la prima e l'ultima diapositiva in ogni pila per ridurre gli artefatti di movimento di rilascio.
- Prima di scattare le immagini, immagine del campo di destinazione con una fonte di luce di mercurio.
- Fare clic sul simbolo del software al microscopio per attivare il software.
- Selezionare il guadagno PMT corretto e il guadagno digitale per visualizzare la struttura cellulare nella superficie oculare.
- Impostare la prima diapositiva e l'ultima diapositiva per acquisire una pila.
- Immettere i valori numerici per la risoluzione dell'immagine e il passaggio z, ad esempio 512 x 512 e 1 m come passo z.
- Fare clic sul pulsante Start per raccogliere le immagini seriali z.
- Acquisire immagini dal vivo due volte nella stessa area, prima a 880 nm di eccitazione per la raccolta dei segnali SHG/EGFP e seconda a 940 nm di eccitazione per la raccolta dei segnali EGFP/tdTomato.
NOTA: la combinazione di due stack fornisce immagini a 3 canali. La risoluzione dell'immagine e le dimensioni del formato di scansione erano rispettivamente 512 x 512 x 512 pixel e 157 m x157 m.
5. Elaborazione delle immagini e ricostruzione 3D
- Caricare le immagini z-seriali nel software Fiji18.
- Selezionare il filtro 3D mediano plugin in Fiji per ridurre i rumori di fondo.
- Selezionare il filtro Maschera di contrasto pacchetto in Figi per affinare le immagini.
- Fare clicsu "Auto " in luminosità/contrasto per ottimizzare automaticamente la qualità delle immagini.
- Salvare le immagini come sequenze di immagini per poter esportare le immagini seriali z.
- Caricare immagini z-seriali in software commerciale (ad esempio, Avizo lite) per la ricostruzione 3D utilizzando il rendering del volume.
- In tutte le immagini MPM, presentare i segnali EGFP, tdTomato e SHG rispettivamente in pseudo-verde, rosso e ciano.
- Acquisire immagini struttura 3D dall'istantanea.
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Representative Results
Utilizzando questa piattaforma di imaging dal vivo, la superficie oculare del mouse può essere visualizzata a livello cellulare. Per visualizzare singole cellule singole nella superficie oculare, abbiamo impiegato i topi transgenici a doppia fluorescente con EGFP espresso nel nucleo e tdTomato espresso nella membrana cellulare. Lo stroma corneale ricco di collagene è stato evidenziato dai segnali SHG.
Nell'epitelio corneale sono state mostrate cellule superficiali, cellule alare e cellule basali (Figura 2). Nei topi transgenici a doppia fluorescente, siamo stati in grado di mappare singole cellule dallo strato basale agli strati superficiali sia nell'epitelio corneale che nell'epitelio limbale (Figura 2). Sono state osservate le cellule superficiali esagonali (freccia bianca in Figura 2). Sia le dimensioni nucleari che la spaziatura internucleare dallo strato basale verso gli strati esterni sono aumentate nell'epitelio corneale (Figura 2). I segnali citoplasmici della fluorescenza tdTomato indicavano che il sistema vescolare intracellulare ricco di proteine della membrana, compreso l'apparato Golgi, il reticolo endoplasmico, erano sparsi nelle cellule alari (Figura 2).
All'interno dello stroma collagenoso, le cheratociti a forma di stellate sono state delineate dalla fluorescenza tdTomato mira a membrana in topi transgenici a doppia fluorescenza (freccia gialla in Figura 3 e Figura 4). Le cheratociti incorporate nello stroma di collagene erano più vagamente distanziate rispetto alle cellule endoteliali. Inoltre, i nervi ramificati sottili nello stroma corneale sono stati anche visivi dai segnali tdTomato mirati a membrana (freccia bianca nella Figura 3). Monostrato di cellule endoteliali corneali ha mostrato una forma esagonale relativamente omogenea collegata in un modello a nido d'ape (freccia bianca in Figura 4). L'epitelio limbale consisteva di 1–2 strati di cellule epiteliali (Figura 5). Il ceppo di topo transgenico dual fluorescent reporter ci ha anche permesso di immaginiare i capillari all'interno della congiuntiva (Figura 6A). L'architettura 3D dei capillari è stata ricostruita delineando l'endotelio vascolare(Figura 6B,6C).
Figura 1: La configurazione di MPM e il supporto del mouse rotante.
(A) L'impostazione dell'MPM. (B) Il disegno del supporto del mouse. Il supporto del mouse è costituito da un supporto rotante della testa e da un portao sopraeno. (C) Il design del portautensili del mouse. Il portaocchi ritrae le palpebre da un anello di plastica per esporre la cornea e la congiuntiva. Il supporto della testa e il portaocchi sono avvitati insieme (B) sul palco per consentire una rotazione precisa e controllabile e l'imaging della superficie oculare. (D) Fotografia del topo vivo per l'imaging corneale con portaocchi. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging vivo dell'epitelio corneale nei topi transgenici fluorescenti.
L'epitelio corneale è stato immaginito strato per strato, per includere cellule superficiali, cellule alali e cellule basali. Le celle superficiali sono contrassegnate da una punta di freccia bianca. Barra della scala di 50 m. (z - profondità dalla superficie superiore dell'epitelio (m)). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Imaging in tempo reale dello stroma corneale.
All'interno dello stroma corneale, le cheratociti (punta di freccia gialla) e le fibre nervose (punta di freccia bianca) erano incorporate nello stroma collagenoso (in colore pseudo-blu). Barra della scala di 50 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Imaging in tempo reale dell'endotelio corneale nella cornea centrale.
Monostrato di cellule endoteliali corneali esagonali (punta di freccia bianca). Barra della scala di 50 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Imaging in tempo reale dell'epitelio limbale.
Le immagini dal vivo dell'epitelio limbale nei topi trasgenici fluorescenti hanno mostrato nuclei vacuolati. Barra della scala di 50 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Imaging dal vivo e la ricostruzione tridimensionale della rete vascolare in congiuntiva.
(A) Sono stati visualizzati capillari in stroma congiuntivale. Barra della scala di 50 m. (B) Ricostruzione 3D di reti capillari eseguite utilizzando un software commerciale. Barra della scala di 50 m. (C,D) Viste 3D ingrandite dell'immagine mostrata nel pannello B. Le celle endoteliali vascolari fluorescenti delineano i capillari (punte di freccia bianche e gialle). Barra della scala per il pannello C , 6,26 m e per il pannello D, 10 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questa piattaforma di imaging MPM personalizzata con un software di controllo è stata utilizzata per l'imaging intravitale degli organi epiteliali del topo, tra cuila pelle 10, il follicolopilifero 10 e la superficie oculare9,10 (Figura 1A). Il sistema su base su base è stato utilizzato per la sua flessibilità nel cambiare i componenti ottici per vari esperimenti, fin dall'inizio del nostro progetto. Questa metodologia di imaging è versatile per i prodotti MPM commerciali. Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per l'imaging intravitale della superficie oculare del mouse da parte della piattaforma di imaging MPM. Utilizzando un supporto stereotassico del mouse (Figura 1B), siamo stati in grado di visualizzare diverse regioni su tutta la superficie oculare. La capacità di posizionamento accurata consente di monitorare le modifiche dinamiche delle celle temporali in una regione specificata.
Anche se diversi studi di imaging MPM murine corneale sono stati segnalati in vivo19,20,21,22, ci sono diverse limitazioni tecniche che si devono superare per ottenere l'imaging continuo per un lungo periodo, ad esempio, tenendo il bulbo oculare in una posizione stabile, diminuendo gli artefatti di movimento durante l'imaging e acquisendo le immagini per un lungo periodo senza fotobleaching. Rispetto al bulbo oculare in plastica progettato per l'imaging corneale in vivo con accesso relativamente limitato alla superficiedell'occhio 20, il nostro portaocchi non solo mantiene il bulbo oculare completamente esposto, ma rende anche l'intera superficie oculare accessibile alla lente obiettivo (Figura 1C).
Anche se i coloranti vitali o sonde sono regolarmente utilizzati come reporter fluorescenti per etichettare lecellule 20,21,22, l'invasività dell'iniezione di ago può interrompere la dinamica cellulare naturale degli organi durante lo stato omeostatico fisiologico o il processo di rigenerazione dei tessuti.22 R26R-GR ceppo di topi transgenici esprime stabile e verde brillante proteina fluorescente nel nucleo cellulare ed è stato utilizzato per la visualizzazione delle dinamiche cellulari dei progenitori muscolari in fibre fantasma23. mT-mG reporter linea di topo transgenico è stato utilizzato per analizzare la differenziazione delle cellule epidermiche inhomeostasi24. Rispetto a una singola linea di topi trasgeno fluorescente, questo ceppo di topo transgenico a doppia fluorescente ha ridotto il tempo di acquisizione dell'immagine a metà fornendo contemporaneamente le informazioni sulla struttura cellulare sia dei nuclei cellulari che delle membrane cellulari. Ruotando il supporto del topo, nuclei piatti di cellule endoteliali e del sangue sono stati visualizzati all'interno del lume vascolare utilizzando il ceppo del topo trasgeno doppio fluorescente (Figura 6). Pertanto, questa linea di topo transgenica può essere utilizzata per studiare le dinamiche cellulari dei capillari in futuro, che è la chiave per la neovascolarizzazione corneale patologica. Inoltre, questa piattaforma di imaging in vivo può essere utilizzata anche per esplorare le risposte immunitarie nelle patologie corneali mediante l'etichettatura fluorescente di diverse cellule immunitarie, come neutrofili25, cellule langerhans26, cellule T regolatorie (Tregs)27 e mastocite28.
In conclusione, abbiamo dimostrato una potente piattaforma di imaging MPM intravitale per lo studio della superficie oculare del mouse. La combinazione di stadio stereotassico MPM dal vivo e speciali topi transgenici fluorescenti consente la visualizzazione in tempo reale di strutture cellulari ed extracellulari distinte nella superficie oculare, tra cui cornea, limbo e congiuntiva. Questa piattaforma di imaging intravitale può aiutare a esplorare le dinamiche cellulari della superficie oculare e, con un ulteriore sviluppo, può essere potenzialmente utilizzata per lo screening dei farmaci oftalmici in futuro.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo il sostegno del Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) e Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1622, CMRPG3G1622).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AVIZO Lite software | Thermo Fisher Scientific | Version: 2019.3.0 | |
| Bandpass filters | Semrock | FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40 |
|
| Dichroic mirrors | Semrock | FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36 |
|
| Galvano | Thorlabs | GVS002 | |
| Jade BIO control software | SouthPort Corporation | Jade BIO | |
| Oxybuprocaine hydrochloride | Sigma | O0270000 | |
| PMT | Hamamatsu | H7422A-40 | |
| Polyesthylene Tube | BECTON DICKINSON | 427401 | |
| Stereotaxic mouse holder | Step Technology Co.,Ltd | 000111 | |
| Ti: Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai-Tai DeepSee | |
| Upright microscopy | Olympus | BX51WI | |
| Vidisic Gel | Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH | D13581 | |
| Zoletil | Virbac | VR-2831 |
References
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