Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Eine benutzerdefinierte Multiphotonen-Mikroskopie-Plattform für Live-Bildgebung von Maus-Cornea und Konjunktiva

doi: 10.3791/60944 Published: May 17, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Präsentiert wird hier eine mikroskopische Multiphotonen-Plattform für die Live-Maus-Augenoberflächenbildgebung. Fluoreszierende transgene Maus ermöglicht die Visualisierung von Zellkernen, Zellmembranen, Nervenfasern und Kapillaren innerhalb der Augenoberfläche. Nichtlineare Signale der zweiten harmonischen Generation, die von kollagenen Strukturen abgeleitet werden, bieten eine etikettenfreie Bildgebung für stromale Architekturen.

Abstract

Herkömmliche histologische Analysen und Zellkultursysteme reichen nicht aus, um die physiologische und pathologische Dynamik in vivo vollständig zu simulieren. Multiphotonenmikroskopie (MPM) hat sich zu einer der beliebtesten bildgebenden Modalitäten für biomedizinische Studien auf zellulärer Ebene in vivo, Vorteile sind hohe Auflösung, tiefe Gewebepenetration und minimale Phototoxizität. Wir haben eine MPM-Bildgebungsplattform mit einem maßgeschneiderten Maus-Augenhalter und einer stereotaxic-Bühne für die Bildgebung der Augenoberfläche in vivo entwickelt. Dual fluoreszierende Protein-Reportermaus ermöglicht die Visualisierung von Zellkernen, Zellmembranen, Nervenfasern und Kapillaren innerhalb der Augenoberfläche. Neben Multiphotonenfluoreszenzsignalen ermöglicht die gleichzeitige Erfassung der zweiten harmonischen Generation (SHG) die Charakterisierung kollagener Stromalarchitektur. Diese Plattform kann für die intravitale Bildgebung mit genauer Positionierung über die gesamte Augenoberfläche, einschließlich Hornhaut und Bindehaut, eingesetzt werden.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Die okulären Oberflächenstrukturen, einschließlich der Hornhaut und bindehaut, schützen andere tiefere Augengewebe vor äußeren Störungen. Die Hornhaut, der transparente vordere Teil des Auges, fungiert sowohl als Brechungslinse zur Lichtausweise ins Auge als auch als Schutzbarriere. Das Hornhautepithel ist die äußerste Schicht der Hornhaut und besteht aus unterschiedlichen Schichten von oberflächlichen Zellen, Flügelzellen und Basalzellen. Corneal stroma besteht aus raffiniert verpackten kollagenen Lamellen, die mit Keratozyten eingebettet sind. Hornhautendothel, eine einzige Schicht flacher sechseckigen Zellen, spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Transparenz der Hornhaut, indem Hornhautstroma durch seine Pumpfunktionen in einem relativ dehydrierten Zustand gehalten wird1. Limbus bildet die Grenze zwischen der Hornhaut und der Bindehaut und ist das Reservoir von Hornhautepithelstammzellen2. Die hochgradig vaskularisierte Bindehaut hilft, die Augen zu schmieren, indem sie Schleim undTränen3 produziert.

Die Zelldynamik der Hornhautoberflächenstrukturen wird konventionell entweder durch histologische Analyse oder in vitro Zellkultur untersucht, die die In-vivo-Zelldynamik möglicherweise nicht ausreichend simuliert. Ein nicht-invasiver Live-Imaging-Ansatz kann daher eine solche Lücke überbrücken. Aufgrund seiner Vorteile, die hohe Auflösung, minimale Photoschäden und tiefere Bildtiefe umfassen, hat sich MPM zu einer leistungsstarken Modalität in verschiedenen Bereichen der biologischen Forschung4,5,6,7,8. Für die Hornhautbildgebung liefert MPM zelluläre Informationen aus der intrinsischen Autofluoreszenz, die aus dem intrazellulären NAD(P)H abgeleitet wurde. Die Signale der zweiten harmonischen Generation (SHG), die von den nicht-zentrosymmetrischen Kollagenfasern des Typs I unter Femtosekunden-Laserscanning abgeleitet werden, bieten kollagene Stromalstrukturen ohne zusätzliche Färbeverfahren9. Zuvor haben wir und andere Gruppen MPM für die Bildgebung von tierischen und menschlichen Hornhäuten9,10,11,12,13,14,15.

Transgene Mauslinien, die fluoreszierende Proteine in bestimmten Zellpopulationen aufweisen, wurden häufig für verschiedene Studien in der Zellbiologie verwendet, einschließlich Entwicklung, Gewebehomöostase, Geweberegeneration und Karzinogenese. Wir verwendeten transgene Mausstämme, die mit fluoreszierenden Proteinen gekennzeichnet sind, für die In-vivo-Bildgebung von Hornhäuten9,10, Haarfollikel10 und Epidermis10 von MPM. Die doppelfluoreszierende Mausdehnung mit Zellmembran mit tdTomato und Zellkern mit EGFP-Kennzeichnung wird aus zwei Mausstämmen gezüchtet: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 und mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. Die transgene Mauslinie R26R-GR enthält ein duales fluoreszierendes Protein-Reporterkonstrukt, einschließlich eines H2B-EGFP-Fusionsgens und eines mCherry-GPI-Ankersignal-Fusionsgens, das in den Gt (ROSA)26Sor-Lokus eingeführt wird. Der transgene MT-mG-Stamm ist eine zellmembranorientierte tdTomato- und EGFP-fluoreszierende Cre-Reporter-Mäuse. Vor der Cre-Rekombination ist Zellmembranprotein mit tdTomato-Fluoreszenzexpression in verschiedenen Zellen weit verbreitet. Dieser transgene Mausstamm ermöglicht es uns, Nuklei-EGFP und Membran mit tdTomato ohne Cre Anregung zu visualisieren. Zwei Weibchen (R26R-GR+/+) und eine männliche (mT-mG+/+) transgene Maus wurden zusammen gezüchtet, um genügend Mäuse für Experimente zu produzieren. Ihre Nachkommen mit R26R-GR+/-;mT-mG+/- Genotyp, einem dualen fluoreszierenden Mäusestamm, wurden in dieser Studie verwendet. Im Vergleich zu einer fluoreszierenden Reporter-Mauslinie, wie zuvor beschrieben9,10, bietet uns diese duale fluoreszierende Reporter-Maus-Dehnung eine um 50 % reduzierte Erfassung der Bildzeit.

In dieser Arbeit beschreiben wir ein detailliertes technisches Protokoll für die In-vivo-Bildgebung der Augenoberfläche Schritt für Schritt mit unserer Bildgebungsplattform und zwei fluoreszierenden transgenen Mäusen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle Tierversuche wurden nach den vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der National Taiwan University und dem Chang Gung Memorial Hospital genehmigten Verfahren durchgeführt.

1. Multiphotonenmikroskopie-Setup

  1. Bauen Sie ein System auf Basis eines aufrechten Mikroskops mit Wassereintauchen 20x 1,00 NA Objektiv (Abbildung 1A).
  2. Verwenden Sie Ti: Saphirlaser (mit einstellbarer Wellenlänge) als Anregungsquelle. Stellen Sie die Laserausgangswellenlänge auf 880 nm für EGFP und 940 nm für tdTomato ein (Abbildung 1A).
  3. Zur Trennung von SHG/EGFP und EGFP/tdTomato(Abbildung 1A)sind zwei dichroitische Spiegel (495 nm und 580 nm) enthalten. Trennen Sie die SHG-Signale, EGFP und tdTomato durch Bandpassfilter 434/17nm, 510/84nm und 585/40nm (Abbildung 1A).
  4. Um die Bildqualität zu optimieren und Photobleichungen und Gewebeschäden zu vermeiden, stellen Sie die Laserleistung auf ca. 35 mW für die Bildqualität der Hornhaut und 50 mW für limbus ein. Messen Sie die Laserleistung, bevor der Laser das optische System passiert. Die genaue Laserleistung an Proben beträgt ca. 8-9 mW. Das komplette mikroskopische Design ist in Abbildung 1Adargestellt.
    HINWEIS: Die obere Grenze der Laserleistung ist auf 70 mW eingestellt, um Fotobleichungen und Gewebeschäden zu vermeiden.

2. Tierpräparation für Live-Bildgebung

  1. Verwenden Sie 8-12 Wochen alte Mäuse für das Experiment. Intramuskulär injizieren 50-80 mg/kg Tiletamin HCl und Zolazepam HCl zur Vollnarkose. Überprüfen Sie auf den Mangel an Reaktion auf Entzugsreflex, indem Sie einen Zehen kneifen. Eine ausreichende Anästhesisierung ist wichtig, um eine stabile Überwachung der Atemfrequenz zu ermöglichen.
    HINWEIS: Mäuse im Alter von 8 Wochen oder höher werden empfohlen, weil ihre Augäpfel gereift sind.
  2. Legen Sie die Maus unter Anästhesie auf eine beheizte Stufe und legen Sie die Temperaturüberwachungssonde in den Anus ein.
    VORSICHT: Die Sonde muss vollständig in die Analhöhle eingeführt werden, ohne der Luft zu ausgesetzt zu sein, um eine Überhitzung der Heizung und induktion des Hitzeschlags zu vermeiden.

3. Augenhaltung zur Live-Bildgebung der Augenoberfläche

  1. Für die Live-Bildgebung der Augenoberfläche verwenden Sie den speziell entwickelten stereotaxic Maushalter, der aus zwei Teilen besteht: einem Kopfhalter, um den Kopf zu stabilisieren, und einem Augenhalter, um die Augenlider zurückzuziehen und die gesamte Augenoberfläche freizulegen (Abbildung 1B-D).
  2. Ohrstangen in den externen Hörfleisch einstecken und die Dreipunktfixierung des Kopfhalters beibehalten (Abbildung 1B,D).
  3. Topisch eine Lösung von 0,4% Oxybuprocainhydrochlorid in Kochsalzlösung auftragen und 3 min zur Anästhesisierung der Augenoberfläche belassen.
  4. Stellen Sie sicher, dass der Augapfel durch die richtige manuelle Augenlid-Retraktion hervorsteht. Andernfalls können Ischämie und Blutungen des Augapfels auftreten.
  5. Legen Sie vorsichtig eine Schlaufe des Polyethylenrohrs des Augenhalters entlang des Augenlidrandes, um die Augenoberfläche freizulegen. Stabilisieren Sie den Augapfel mit dem Augenhalter, der aus einer Nr. 5 Dumont Zange besteht, mit seinen Spitzen, die mit der Schleife aus Polyethylenrohr bedeckt sind (Abbildung 1C,D).
  6. Schraubzange mit einem Knopf in distalen Zangen des Augenhalters, um den Augapfel stabil zu halten (Abbildung 1D).
  7. Tragen Sie ein Augengel mit dem Brechungsindex von 1,338 auf die Hornhautoberfläche als Tauchmedium auf, um die Feuchtigkeit der Augenoberfläche stündlich aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus vermeidet die regelmäßige Anwendung des Augengels stündlich eine Trübung in der Hornhaut während der Bildgebung.
  8. Drehen Sie den Augapfel mit dem Halter, der auf der Schritt-Motor-Bühne für die Bildgebung über die gesamte Hornhautoberfläche von der zentralen Hornhaut bis zum peripheren Bereich gesperrt ist (Abbildung 1C,D).
    VORSICHT: Sowohl überschüssige als auch unzureichende Mengen an Augengel können die Bildqualität während der Bildgebung beeinflussen. Daher ist die stündliche Ergänzung des Augengels wichtig, um die Oberfläche regelmäßig feucht zu halten.

4. Z-serielle Bildaufnahme

HINWEIS: Legen Sie die erste und letzte Folie in jedem Stapel fest, um die abtropfenden Bewegungsartefakte zu reduzieren.

  1. Bevor Sie die Bilder aufnehmen, stellen Sie das Zielfeld mit einer Quecksilberlichtquelle ab.
  2. Klicken Sie auf das Symbol der Mikroskopsoftware, um die Software einzuschalten.
  3. Wählen Sie die richtige PMT-Verstärkung und digitale Verstärkung, um die Zellstruktur in der Augenoberfläche zu visualisieren.
  4. Legen Sie die erste Folie und die letzte Folie fest, um einen Stapel zu erhalten.
  5. Geben Sie numerische Werte für Bildauflösung und Z-Schritt ein, z.B. 512 x 512 und 1 m als Z-Schritt.
  6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um Z-Seriellbilder zu sammeln.
  7. Erfassen Sie Live-Bilder zweimal im selben Bereich, zuerst bei 880 nm Anregung für die SHG/EGFP-Signalsammlung und zweitens bei 940 nm Anregung für die EGFP/tdTomato-Signalerfassung.
    HINWEIS: Die Kombination aus zwei Stapeln bietet 3 Kanäle Bilder. Die Bildauflösung und das Scanformat betrugen 512 x 512 Pixel bzw. 157 x 157 x 157 x 157 x 157 x 157 m.

5. Bildverarbeitung und 3D-Rekonstruktion

  1. Laden Sie die z-seriellen Bilder in Fidschi-Software18.
  2. Wählen Sie das Plugin Median 3D-Filter in Fidschi, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren.
  3. Wählen Sie den Filter Paket unscharfe Maske in Fidschi aus, um die Bilder zu schärfen.
  4. Klicken Sie auf"Auto" in Helligkeit/Kontrast, um die Bildqualität automatisch zu optimieren.
  5. Speichern Sie die Bilder als Bildsequenzen, um die Z-Seriellbilder exportieren zu können.
  6. Laden Sie z-serielle Bilder in kommerzielle Software (z.B. Avizo lite) für die 3D-Rekonstruktion mit Volume-Rendering.
  7. In allen MPM-Bildern werden EGFP-, tdTomato- und SHG-Signale in Pseudo-Grün-, Rot- und Cyanfarbe dargestellt.
  8. Erfassen Sie 3D-Strukturbilder durch den Snapshot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mit dieser Live-Bildgebungsplattform kann die Maus-Augenoberfläche auf zellulärer Ebene visualisiert werden. Um einzelne Einzelzellen in der Augenoberfläche zu visualisieren, verwendeten wir die zwei fluoreszierenden transgenen Mäuse mit EGFP, ausgedrückt im Kern und tdTomato in der Zellmembran. Die kollagenreiche Hornhautstroma wurde durch SHG-Signale hervorgehoben.

In Hornhautepithel wurden oberflächliche Zellen, Flügelzellen und Basalzellen (Abbildung 2) visualisiert. In den zwei fluoreszierenden transgenen Mäusen konnten wir einzelne Zellen aus der Basalschicht den oberflächlichen Schichten sowohl in Hornhaut- als auch in Limbalepithel zuordnen (Abbildung 2). Die sechseckigen oberflächlichen Zellen wurden beobachtet (weiße Pfeilspitze in Abbildung 2). Sowohl die kernnukleare Größe als auch der internukleare Abstand von der Basalschicht zu den äußeren Schichten wurden in Hornhautepithel erhöht (Abbildung 2). Die zytoplasmatischen Signale der tdTomato-Fluoreszenz zeigten, dass das membranproteinreiche intrazelluläre vesikuläre System, einschließlich des Golgi-Apparats, endoplasmatisches Retikulum, in den Flügelzellen verstreut war (Abbildung 2).

Innerhalb des kollagenen Stroms wurden die stellatförmigen Keratozyten durch die membranorientierte tdTomato-Fluoreszenz in zwei fluoreszierenden transgenen Mäusen umrissen (gelbe Pfeilspitze in Abbildung 3 und Abbildung 4). Die im Kollagen stroma eingebetteten Keratozyten waren lockerer als die Endothelzellen. Darüber hinaus wurden dünne Verzweigungsnerven in Hornhautstroma auch durch membran-targeting tdTomato-Signale visualisiert (weiße Pfeilspitze in Abbildung 3). Die Monoschicht der hornförmigen Endothelzellen zeigte eine relativ homogene sechseckige Form, die mit einem Wabenmuster verbunden ist (weiße Pfeilspitze in Abbildung 4). Das limbale Epithel bestand aus 1–2 Schichten epitheliale Zellen (Abbildung 5). Der dualfluoreszierende Reporter transgene Mausstamm ermöglichte es uns auch, die Kapillaren innerhalb der Bindehaut abzubilden (Abbildung 6A). Die 3D-Architektur von Kapillaren wurde durch die Darstellung des vaskulären Endothels rekonstruiert (Abbildung 6B,6C).

Figure 1
Abbildung 1: Einrichtung von MPM und rotierendem Maushalter.
(A) Die Einrichtung des MPM. (B) Das Design des Maushalters. Der Maushalter besteht aus einem rotierenden Kopfhalter und einem Augenhalter. (C) Das Design des Maus-Augenhalters. Der Augenhalter zieht Augenlider durch eine Kunststoffschlaufe zurück, um die Hornhaut und Bindehaut freizulegen. Kopfhalter und Augenhalter werden auf der Bühne zusammengeschraubt (B), um eine präzise und steuerbare Drehung und Abbildung der Augenoberfläche zu ermöglichen. (D) Foto von Live-Maus für Hornhautbildgebung mit Augenhalter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Live-Bildgebung von Hornhautepithel bei zwei fluoreszierenden transgenen Mäusen.
Das Hornhautepithel wurde Schicht für Schicht abgebildet, um oberflächliche Zellen, Flügelzellen und Basalzellen einzuschließen. Oberflächliche Zellen sind mit einer weißen Pfeilspitze markiert. Skalenbalken = 50 m. (Z = Tiefe von der Oberseite des Epithels (m)). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Live-Bildgebung der Hornhautstroma.
Innerhalb der Hornhautstroma wurden die Keratozyten (gelbe Pfeilspitze) und die Nervenfasern (weiße Pfeilspitze) in den kollagenen Stroma (in pseudoblauer Farbe) eingebettet. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Live-Bildgebung von Hornhautendothel in der zentralen Hornhaut.
Monolayer von sechseckigen hornhauten Endothelzellen (weiße Pfeilspitze). Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Live-Bildgebung des limbalen Epithels.
Live-Bilder des limbalen Epithels bei zwei fluoreszierenden transgenen Mäusen zeigten vakuolierte Kerne. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Live-Bildgebung und die dreidimensionale Rekonstruktion des Gefäßnetzes in Bindehaut.
(A) Kapillaren in Bindehautstroma wurden visualisiert. Skalenbalken = 50 m. (B) 3D-Rekonstruktion von Kapillarnetzen, die mit einer kommerziellen Software durchgeführt werden. Skalenbalken = 50 m. (C,D) Vergrößerte 3D-Ansichten des Bildes in Tafel B. Fluoreszierende vaskuläre Endothelzellen umrissen die Kapillaren (weiße und gelbe Pfeilspitzen). Skalenstange für Panel C = 6,26 m und für Panel D = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Diese maßgeschneiderte MPM-Bildgebungsplattform mit einer Steuerungssoftware wurde für die intravitale Bildgebung von Mausepithelorganen, einschließlich Haut10, Haarfollikel10 und Augenoberfläche9,10 (Abbildung 1A) verwendet. Das kundenspezifische System wurde seit Beginn unseres Projekts für seine Flexibilität beim Wechsel der optischen Komponenten für verschiedene Experimente eingesetzt. Diese Bildgebungsmethode ist vielseitig für kommerzielle MPM-Produkte. Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur intravitalen Bildgebung der Maus-Augenoberfläche durch die MPM-Bildgebungsplattform. Mit einem stereotaxic Maushalter (Abbildung 1B) konnten wir verschiedene Bereiche über die gesamte Augenoberfläche visualisieren. Die genaue Positionierungsfunktion ermöglicht die Überwachung zeitlicher zelldynamischer Veränderungen in einem bestimmten Bereich.

Obwohl mehrere Studien zur murinen Hornhaut-MPM-Bildgebung in vivo19,20,21,22berichtet wurden, gibt es mehrere technische Einschränkungen, die man überwinden muss, um eine kontinuierliche Bildgebung über einen langen Zeitraum zu erreichen, z.B. den Augapfel in einer stabilen Position zu halten, Bewegungsartefakte während der Bildgebung zu verringern und die Bilder für einen langen Zeitraum ohne Photobleichung zu erfassen. Im Vergleich zur Kunststoff-Augenmuschel für die Hornhautbildgebung in vivo mit relativ begrenztem Zugang zur Augenoberfläche20hält unser Augenhalter nicht nur den Augapfel vollständig exponiert, sondern macht auch die gesamte Augenoberfläche für die Objektivlinse zugänglich (Abbildung 1C).

Obwohl lebenswichtige Farbstoffe oder Sonden routinemäßig als fluoreszierende Reporter verwendet werden, um Zellen20,21,22zu kennzeichnen, kann die Invasivität der Nadelinjektion die natürliche Zelldynamik von Organen während des physiologischen otostatischen Zustands oder Geweberegenerationsprozesses stören. R26R-GR transgene MäuseStamm drückt stabile und hellgrüne fluoreszierende Protein im Zellkern und wurde für die Visualisierung der Zelldynamik von Muskelvorläufern in Geisterfasern23verwendet. mT-mG Reporter transgene Mauslinie wurde verwendet, um die Differenzierung von epidermalen Zellen inhomeostasis24zu analysieren. Im Vergleich zu einer einzigen reporterfluoreszierenden transgenen Mauslinie reduzierte dieser doppelfluoreszierende transgene Mausstamm die Zeit der Bildaufnahme auf die Hälfte, indem er gleichzeitig die Zellstrukturinformationen sowohl von Zellkernen als auch von Zellmembranen bereitstellte. Durch Drehen des Maushalters wurden flache Kerne sowohl der endotheliale als auch der Blutzellen innerhalb des Gefäßlumens mit einem doppelten fluoreszierenden transgenen Mausstamm visualisiert (Abbildung 6). Daher kann diese transgene Mauslinie verwendet werden, um die Zelldynamik von Kapillaren in der Zukunft zu untersuchen, was der Schlüssel zur pathologischen Hornhautneovaskularisation ist. Darüber hinaus kann diese in vivo Bildgebungsplattform auch verwendet werden, um Immunantworten in Hornhautpathologien durch fluoreszierende Etikettierung verschiedener Immunzellen, wie Neutrophilen25, Langerhans-Zellen26, regulatorische T-Zellen (Tregs)27 und Mastzellen28zu erforschen.

Abschließend haben wir eine leistungsstarke intravitale MPM-Bildgebungsplattform für die Maus-Augenoberflächenstudie demonstriert. Die Kombination aus live mPM stereotaxic Stadium und speziellen fluoreszierenden transgenen Mäusen ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung von unterschiedlichen zellulären und extrazellulären Strukturen in der Augenoberfläche, einschließlich Hornhaut, Limbus und Bindehaut. Diese intravitale Bildgebungsplattform kann helfen, die Zelldynamik der Augenoberfläche zu erforschen und kann bei der weiteren Entwicklung in Zukunft potenziell für das Screening von ophthalmologischen Arzneimitteln eingesetzt werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Wir danken der Stipendienunterstützung des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) und Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AVIZO Lite software Thermo Fisher Scientific Version: 2019.3.0
Bandpass filters Semrock FF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrors Semrock FF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
Galvano Thorlabs GVS002
Jade BIO control software SouthPort Corporation Jade BIO
Oxybuprocaine hydrochloride Sigma O0270000
PMT Hamamatsu H7422A-40
Polyesthylene Tube BECTON DICKINSON 427401
Stereotaxic mouse holder Step Technology Co.,Ltd 000111
Ti: Sapphire laser Spectra-Physics Mai-Tai DeepSee
Upright microscopy Olympus BX51WI
Vidisic Gel Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH D13581
Zoletil Virbac VR-2831

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37, (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
  4. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, (12), 5251-5259 (2006).
  5. Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, Pt 2 83-104 (2000).
  6. Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352, (6292), 1471-1474 (2016).
  7. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19, (2), 155-163 (2017).
  8. Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20, (12), 1361-1369 (2018).
  9. Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
  10. Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. (2019).
  11. Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (7), 3501-3507 (2012).
  12. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12, (2), 024013 (2007).
  13. Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2, (1), 10-20 (2004).
  14. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48, (3), 1087-1094 (2007).
  15. Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91, (2), 308-314 (2010).
  16. Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7, (9), 46171 (2012).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, (9), 593-605 (2007).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  19. Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
  20. Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, (10), 6526-6536 (2013).
  21. Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
  22. Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
  23. Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18, (2), 243-252 (2016).
  24. Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23, (5), 677-686 (2018).
  25. Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135, (4), 1181-1184 (2015).
  26. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, (5), 643-654 (2005).
  27. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191, (6), 3049-3056 (2013).
  28. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, (6), 973-984 (2011).
Eine benutzerdefinierte Multiphotonen-Mikroskopie-Plattform für Live-Bildgebung von Maus-Cornea und Konjunktiva
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).More

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter