Summary
Présenté ici est un protocole pour étudier la dépression comme et le comportement anhédonique chez les rats. Il combine deux méthodes comportementales bien établies, la préférence du saccharose et les tests d’hypophagie induits par la nouveauté, avec un système automatisé de surveillance de l’apport alimentaire et liquide, pour étudier indirectement le comportement des rongeurs à l’aide de paramètres de substitution.
Abstract
La prévalence et l’incidence des troubles dépressifs augmentent dans le monde entier, affectant environ 322 millions d’individus, soulignant la nécessité d’études comportementales dans les modèles animaux. Dans ce protocole, pour étudier le comportement dépression-comme et anhédonique chez les rats, la préférence établie de saccharose et les essais d’hypophagie novelty-induits sont combinés avec un système automatisé de surveillance de nourriture et de prise liquide. Avant de tester, dans le paradigme de préférence saccharose, les rats mâles sont formés pendant au moins 2 jours pour consommer une solution de saccharose en plus de l’eau du robinet. Pendant l’essai, les rats sont de nouveau exposés à la solution d’eau et de saccharose. La consommation est enregistrée chaque seconde par le système automatisé. Le rapport du saccharose à la prise totale d’eau (rapport de préférence de saccharose) est un paramètre de substitution pour l’anhédonie. Dans le test d’hypophagie induit par la nouveauté, les rats mâles subissent une période d’entraînement au cours de laquelle ils sont exposés à une collation agréable au goût. Pendant l’entraînement, les rongeurs affichent une collation de base stable. Le jour de l’essai, les animaux sont transférés des cages domestiques dans une cage fraîche et vide représentant un nouvel environnement inconnu avec accès à la collation agréable au goût connue. Le système automatisé enregistre l’apport total et sa microstructure sous-jacente (p. ex., latence à l’approche de la collation), ce qui donne un aperçu des comportements anhédoniques et anxieux. La combinaison de ces paradigmes avec un système de mesure automatisé fournit des informations plus détaillées, ainsi qu’une plus grande précision en réduisant les erreurs de mesure. Cependant, les tests utilisent des paramètres de substitution et ne représentent que la dépression et l’anhédonie d’une manière indirecte.
Introduction
En moyenne, 4,4 % de la population mondiale est touchée par la dépression. Ceux-ci représentent 322 millions de personnes dans le monde, soit une augmentation de 18% par rapport à il y adix ans 1. Selon les estimations de l’Organisation mondiale de la santé, la dépression sera au deuxième rang du classement des années de vie ajustées en fonction de l’incapacité en 20202. Pour faire face à la prévalence croissante des troubles affectifs et établir de nouvelles stratégies interventionnelles, il est nécessaire d’étudier davantage ce comportement. Avant et en plus de l’examen chez l’homme, des études sur les animaux sont nécessaires.
Plusieurs modèles ont été établis pour étudier les composantes du comportement dépressif (c.-à-d. test de natation forcée, essai de suspension de queue, essai de préférence de saccharose, et hypophagie novelty-induite)3,4. Le test de préférence de saccharose (SPT) et l’hypophagie induite par la nouveauté (NIH) peuvent détecter le comportement dépression-comme chez les animaux. Ces tests eux-mêmes n’induisent pas un état de dépression chez les rongeurs, mais dépeignent les changements aigus de comportement. Le SPT et les NIH évaluent tous deux un trait caractéristique de la dépression connu sous le nom d’anhédonie, qui est la perte d’intérêt pour les activités suivantes : activités enrichissantes, activités qui étaient autrefois appréciéespar l’individu 5, et un aspect du phénomène complexe de traitement et de réponse à larécompense 6. Les deux tests étudient la réponse à un stimulus gratifiant sous la forme d’aliments savoureux. L’étendue de la consommation sert de paramètre de substitution pour l’anhédonie7,8,9.
La valeur des tests d’étude de l’anhédonie dépend fortement de la détermination précise de la consommation résultant d’une mesure précise du poids de la substance. Traditionnellement, cette mesure est effectuée manuellement une fois avant et une fois après le test. Toutefois, cela est sujet à des mesures erronées pour plusieurs raisons. Tout d’abord, les rongeurs ont tendance à accumuler des aliments, ce qui signifie qu’ils enlèvent les aliments sans les consommer immédiatement, puis les cachent dans un endroit sûr. Ainsi, cette perte d’aliments peut être incluse dans le calcul de la consommation totale. Deuxièmement, les rats renversent de la nourriture et de l’eau, ce qui entraîne une perte de poids sans consommation respective. Troisièmement, la perte involontaire de liquide se produit en raison de la manipulation des bouteilles en les insérant et en les enlevant des cages.
Dans une approche visant à réduire ces sources d’erreur, nous avons combiné les deux tests communs évaluant l’anhédonie (SPT3,,4 et NIH9)avec la mesure de la consommation d’aliments et d’eau à l’aide d’un système automatisé de surveillance des aliments et des liquides. Cette procédure permet une étude précise de la consommation de substances acceptables ainsi que fournit des informations sur l’expérience du plaisir chez les rats comme une caractéristique de la dépression comme le comportement. Les erreurs mentionnées ci-dessus associées à la mesure manuelle sont réduites en utilisant différentes approches, qui sont illustrées plus en détail.
Pour fournir des informations sur la microstructure, le système automatisé de surveillance des prises utilisé dansce protocole 10 pèse les aliments (±0,01 g) chaque seconde. Ainsi, un poids stable est documenté comme « ne pas manger », et un poids instable comme « manger ». Un « combat » est défini comme un changement de poids stable avant et après un événement. Un repas se compose d’un ou plusieurs épisodes et sa taille minimale chez les rats a été définie comme 0,01 g. Un repas est séparé d’un autre repas chez les rats de 15 min (valeur normalisée). Ainsi, l’apport alimentaire est considéré comme un repas lorsque les épisodes se sont produits dans les 15 minutes et le changement de poids est aussi égal ou supérieur à 0,01 g. Les paramètres de repas évalués dans ce protocole incluent la durée du repas, le temps passé dans les repas, la taille du combat, la durée du combat, le temps passé dans les combats, la latence au premier combat, et le nombre de combats.
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Protocol
Les soins aux animaux et les procédures expérimentales ont suivi les lignes directrices spécifiques en matière d’éthique institutionnelle et ont été approuvés par l’autorité de l’État pour la recherche sur les animaux.
1. Fonctionnement du système de surveillance automatisé
REMARQUE : Lors de l’exploitation du système de surveillance automatisé, il est crucial de documenter chaque action dans la boîte de commentaires incluse dans le logiciel immédiatement avant l’action. La description doit être tapée dans la boîte de commentaires, et en appuyant sur Enregistrer, il est enregistré avec un point de temps spécifique. Les délais sont importants lors de l’analyse des données, puisque le système enregistre en permanence, et la période d’intérêt doit être indiquée pour analyse.
- Installation, utilisation et entretien du système de surveillance automatisé
REMARQUE : Ce protocole utilise des rats sprague dawley mâles adultes pesant de 250 à 300 g (~10 semaines). Il est recommandé d’abriter les rats en groupes pendant la période d’acclimatation. Les conditions environnementales doivent être contrôlées avec les paramètres suivants : cycle obscurité/lumière de 12 h/12 h avec lumières allumées à 6 h A.M., humidité de 45 % à 65 %, température de 21 à 23 °C et accès ad libitum à l’eau et régime alimentaire standard des rongeurs. La manipulation quotidienne permet aux animaux de s’habituer aux enquêteurs.- Séparez les rats de sorte que chaque animal ait une cage individuelle. Assurez-vous que chaque rat reste séparé pendant le protocole.
- Remplissez les cages d’habitation d’une literie ordinaire avec une couche de 1 à 2 cm d’épaisseur. Cette quantité (réduite) diminue la possibilité de contamination des microbalances et des trémies par déversement, réduisant ainsi les erreurs de mesure. Ajouter les tubes en plastique (p. ex., un morceau de 20 cm de long d’un tuyau d’évacuation en plastique d’un diamètre de 8 cm) et ronger le bois comme enrichissement, tout en omettant les tissus de papier pour réduire les erreurs de mesure.
- Préparez les cages pour la mesure automatisée de l’apport alimentaire solide et liquide en attachant deux supports de cage fermés avec des microbalances à des trous sur mesure dans le côté avant des cages. Placez deux trémies vides sur les montures de cage, une pour le chow et une pour la bouteille.
REMARQUE : Les microbalances sont reliées par câble à un système d’enregistrement attaché à un ordinateur et le logiciel respectif est installé sur l’ordinateur. - Pour commencer l’enregistrement,ouvrez " Monitor" et appuyez sur "Démarrer« , puis choisissez un endroit pour enregistrer les données.
- À l’aide de la fonction d’étalonnage (appuyez sur« Calibrate») du système automatisé de surveillance des prises, calibrez tous les équilibres en enlevant les trémies et en plaçant deux poids mesurés différents sur les supports de cage avec des équilibres. Faites ceci à intervalles réguliers de temps (hebdomadaire est recommandé).
- Remplissez complètement une trémie de chow (~100 g) et retirez les morceaux de chow et les émiettées qui sont trop petits en taille. Remplissez l’eau dans la bouteille (~100 mL) et placez-la dans l’autre trémie.
- Documenter la position de la nourriture et de l’eau (p. ex., équilibre 1 : animal alimentaire 1, équilibre 2 : animal aquatique 1).
- Placez le rat dans la cage et ouvrez toutes les portes de la cage monte afin qu’il puisse manger et boire ad libitum.
REMARQUE : Pour une mesure précise, il est nécessaire de maintenir les équilibres et les trémies tous les jours en nettoyant doucement à l’aide d’une brosse du déversement et en enlevant les petites miettes de nourriture du contenant alimentaire. Cela réduira considérablement les mesures erronées. Fermez toutes les portes pendant l’entretien quotidien.
- Accès aux données après les expériences
- Recherchez dans la boîte de commentaires les points de début et de terminaison d’une période (p. ex., formation, test) qui doit être analysée.
- Cliquez sur "Afficher les données" sur le logiciel pour ouvrir la visionneuse de données.
- Insérez les points de temps dans les cases ci-dessous "Begin time" et "End time« . Appuyez sur le carré dans le coin supérieur gauche indiquant l’équilibre qui a enregistré l’information.
- Cliquez sur "PSC Totals" pour accéder aux données de microstructure. Appuyez sur le bouton "Export PSC Table" pour exporter les données.
REMARQUE : Pour comparer la microstructure d’animaux individuels (p. ex., non stressés par rapport aux animaux stressés) à l’aide d’une surveillance automatisée, les animaux individuels peuvent être sélectionnés dans le «visionneuse de données » en appuyant sur le carré approprié dans le coin supérieur gauche. Les totaux de la CFP ne montrent que la microstructure de l’animal sélectionné. L’analyse statistique ne peut pas être effectuée avec le système. Les données doivent être extraites dans un logiciel de calcul/analyse.
2. Mise en œuvre du test de préférence saccharose
- Mener la période de formation
REMARQUE : Avant l’essai, les animaux doivent être habitués à la disponibilité de deux bouteilles de liquides sur les trémies à travers les barrières, tandis que la nourriture doit être fournie à partir du sommet des cages (l’ensemble est indiqué dans la figure 1). Cette période de formation devrait durer au moins 2 jours. Il est effectué dans les cages de la maison dans la salle où les animaux sont détenus.- Fermez toutes les portes. Retirer la bouteille d’eau et le contenant de nourriture des microbalances.
- Placez les aliments pré-pesés (~50 g) sur le dessus de la cage et documentez leur poids quotidiennement à l’aide d’un équilibre régulier pour évaluer la consommation quotidienne d’aliments. Rechargez, si nécessaire.
- Nettoyez une bouteille avec de l’eau claire et remplissez-la d’environ 100 mL d’eau. Placez-le sur la trémie.
- Remplissez une deuxième bouteille propre de 100 ml de solution de saccharose fraîchement faite à 1 %. Placez-le sur la trémie.
REMARQUE : Marquez soigneusement les bouteilles et documentez leurs emplacements (p. ex., équilibre 1 : animal aquatique 1, équilibre 2 : solution saccharose animal 1). - Ouvrez toutes les portes. Documenter le début de la formation dans le système de surveillance. Laissez les portes ouvertes pendant 24 h, ce qui donne un accès ad libitum aux deux bouteilles. Après 24 h, fermez les portes et documentez la fin de l’entraînement. Les données de l’intervalle de 24 h peuvent être évaluées à l’aide du système de surveillance automatisé en insérant l’heurede débutet l’heurede fin. Les procédures sont les mêmes lorsqu’un intervalle de test de 1 h est évalué.
- Nettoyez et remplissez les bouteilles toutes les 24 h. Préparez une solution de saccharose fraîche de 1 % par jour. Changez la position de la bouteille de solution d’eau et de saccharose quotidiennement pour éviter les effets d’accoutumabilité.
REMARQUE : Effectuez la formation chez tous les animaux au moins 48 h jusqu’à ce que les ratios de préférence atteignent ~1. Le rapport de préférence saccharose est évalué directement après la formation à l’aide de la« visionneuse de données». Il est calculé comme le rapport entre la prise de saccharose et l’apport global (eau plus prise de saccharose). - 24 h avant l’essai, retirez la bouteille avec la solution de saccharose afin que le rat ait accès au chow standard et à l’eau seulement.
- Préparez une bouteille fraîche remplie d’eau du robinet et une bouteille remplie d’une solution de saccharose de 1 %, toutes deux d’environ 100 ml.
- Avant les essais, fermez toutes les portes.
- Retirer la bouteille remplie d’eau du robinet de la trémie et placer les deux bouteilles fraîches, l’une remplie d’eau du robinet et l’autre remplie d’une solution de saccharose de 1 %, sur la trémie.
- Ouvrez toutes les portes, documentez le début du test dans le système de surveillance. Laissez les portes ouvertes pendant 60 min. Fermez les portes après 60 min et documentez la fin du test.
- Évaluer les données (p. ex., le rapport saccharose/apport total en liquide).
REMARQUE : Le test peut être répété plusieurs fois avec des intervalles d’entraînement (au moins 2 jours) entre les deux.
3. Mise en œuvre du test d’hypophagie induit par la nouveauté
- Mener la période de formation
REMARQUE : Avant le test, une période de formation quotidienne de 30 minutes de 5 jours est recommandée (la mise en place est indiquée à la figure 2). L’objectif est d’atteindre une base stable de collations agréables au goût avant l’expérience. Il est effectué dans les cages de la maison dans la salle où les animaux sont détenus.- Fermez toutes les portes et retirez la trémie avec le chow standard.
- Remplissez une trémie fraîche avec la collation agréable au goût (~50 g). Insérez soigneusement les craquelins dans la trémie pour éviter qu’ils ne s’effondrent. Placez la trémie sur le support de la cage au-dessus du microbalance.
- Ouvrez les portes pendant 30 min afin que le rat ait accès ad libitum à la collation et à l’eau. Documenter le début de la formation dans le système de surveillance.
REMARQUE : Le rat ne doit pas avoir accès au chow standard pendant la période d’entraînement. - Fermez les portes après 30 min et documentez la fin de la formation dans le système de surveillance. Remplacez la collation par un chow standard.
- Répétez cette journée jusqu’à ce qu’un apport stable en collations acceptables de base soit atteint (p. ex., 1,5 à 2,0 g/30 min) et 2) l’apport ne diffère pas statistiquement entre les jours d’entraînement.
- Effectuer le test d’hypophagie induit par la nouveauté
- Préparer une cage vide fraîchement nettoyée sans literie ni enrichissement attaché au système automatisé de surveillance de l’apport alimentaire. Placez une trémie avec une bouteille d’eau du robinet et une trémie avec une collation agréable au goût sur les supports de la cage.
REMARQUE : La nouvelle cage doit être placée dans la même pièce où les rats sont détenus et où l’entraînement est effectué. Gardez les portes fermées. - Retirez le rat de la cage de la maison et placez-le dans la nouvelle cage.
- Ouvrez toutes les portes pendant 30 min. Documentez le début des tests dans le système de surveillance.
REMARQUE : Pendant les 30 minutes d’accès à la collation, la taille de la consommation de collations et les paramètres sous-jacents de la microstructure (p. ex., latence au premier repas) sont enregistrés à l’aide du système automatisé de surveillance de l’apport alimentaire. - Fermez les portes après 30 min et documentez la fin des tests. Remettre le rat dans la cage de la maison.
REMARQUE : Le test peut être répété plusieurs fois avec des intervalles d’entraînement (au moins 5 jours) entre les deux.
- Préparer une cage vide fraîchement nettoyée sans literie ni enrichissement attaché au système automatisé de surveillance de l’apport alimentaire. Placez une trémie avec une bouteille d’eau du robinet et une trémie avec une collation agréable au goût sur les supports de la cage.
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Representative Results
Pour tester la distribution des données, le test Kolmogorov-Smirnov a été utilisé. Les tests T ont été utilisés lorsque les données étaient normalement distribuées et que le test Mann-Whitney-U était utilisé, sinon. ANOVA uni-sens suivi d’un test post-hoc Tukey a été utilisé pour la comparaison de groupe multiple normalement distribuée. ANOVA uni sensée suivi du test de comparaison multiple de Dunn a été utilisé en cas de distribution non normale. Les différences entre les groupes ont été considérées comme significatives lorsque p < 0,05.
Le SPT a été exécuté sur des rats naïfs dans cette étude. La consommation de solution de saccharose a augmenté et la consommation d’eau a diminué au cours de la périoded’entraînement ( figure 3). Le premier jour d’entraînement, les rats buvaient 24,40 mL ± 3,48 mL de solution saccharose (figure 3A) et 4,83 mL ± 0,89 mL d’eau ordinaire (figure 3B), ce qui donne un rapport de préférence de saccharose de 0,80 ± 0,06(figure 3C). Le deuxième jour de formation, les rats ont augmenté la consommation de solution saccharose jusqu’à 33,77 mL ± 4,49 mL (non significatif, p = 0,17 vsjour 1) et diminution de la consommation d’eau à 0,42 mL ± 0,13 mL(p < 0,001 vsjour 1), ce qui donne un ratio de 0,99 ± 0,004(p < 0,05 vs. jour 1; Figure 3C). Huit rats ont été étudiés ici; ainsi, chaque point de données est dérivé de huit animaux. L’apport en liquide, y compris sa microstructure, a été enregistré automatiquement. Les données ont été extraites de PSC Totals à l’aide de la visionneuse de données.
Au cours de l’essai de 60 minutes, les animaux ont consommé entre 0 et 6,18 mL de solution saccharose d’une valeur moyenne de 2,91 mL ± 0,66 (n =8) sans consommer d’eau, ce qui a entraîné un rapport de préférence de saccharose de 0,99 ± 0,00. Les animaux qui n’ont consommé aucun liquide pendant l’essai ont été exclus de l’analyse. Huit rats ont été étudiés. La prise de fluide a été enregistrée automatiquement.
Le système automatisé de surveillance des prises a fourni des données sur la microstructure de prise de saccharose évaluées automatiquement au cours des essais, qui ont été extraites des totaux de la CFP à l’aide de la visionneuse de données. Ces paramètres étaient la taille des repas (figure 4A), la durée des repas (figure 4B), le temps passé dans les repas en quelques secondes (figure 4C) et les pourcentages (figure 4D), la fréquence des repas (figure 4E), la latence au premier repas (Figure 4F), intervalle entre les repas (figure 4G), taux de consommation d’alcool (figure 4H), durée du combat (figure 4I), taille du combat (figure 4J), et temps passé dans les combats en quelques secondes (Figure 4K) et les pourcentages (Figure 4L).
Afin d’étudier davantage les avantages du système automatisé de surveillance des prises, les données illustrées ci-dessus ont été comparées aux données obtenues à l’aide d’évaluations manuelles conventionnelles (pesage manuel des bouteilles avant et après la période de formation/test, tableau 1). Le premier jour de formation, le saccharose(p < 0,01) et la prise d’eau(p < 0,01) étaient significativement plus élevés lorsqu’ils étaient évalués manuellement par rapport à automatiquement. Le deuxième jour de formation, la consommationd’eau (p < 0,001) et le rapport de préférence pour le saccharose(p < 0,01) différaient entre les deux groupes et pendant les essais. Tous les paramètres, à savoir la prise de saccharose(p < 0,001), la prised’eau (p < 0,001) et le rapport de préférence du saccharose(p < 0,001) étaient différents d’un groupe à l’autre, peut-être en raison d’une mesure ou d’un déversement erronément élevé lorsqu’ils étaient évalués manuellement.
L’apport global de la collation agréable au goût pendant l’entraînement n’a cessé d’augmenter : 0,48 g ± 0,14 g (jour 1), 1,05 g ± 0,32 g (jour 2), 1,48 g ± 0 0,56 g (jour 3), 1,1 g ± 0,39 g (jour 4) et 1,91 g ± 0,68 g (jour 5), ce qui indique une adaptation au cours des 2 à 3 premiers jours. De même, la taille des repas tendait vers une augmentation entre les joursd’entraînement (figure 5A, p = 0,12), tandis que la durée des repas (figure 5B) n’a pas (p > 0,05). De même, d’autres paramètres microstructuraux tels que le temps passé dans les repas (figure 5C), la latence au premier combat (figure 5D), la taille du combat (figure 5E), la durée du combat (Figure 5F), le temps passé dans les combats (Figure 5G), et le nombre de combats (Figure 5H) n’étaient pas significativement différents entreces jours (p > 0,05). Huit rats ont été étudiés ; ainsi, chaque point de données est dérivé de huit animaux. La prise de casse-croûte comprenant la microstructure a été enregistrée automatiquement. Les données ont été extraites de PSC Totals à l’aide de la visionneuse de données.
Le jour de l’essai, les rats naïfs exposés à la collation dans un environnement nouveau ont montré une prise de la collation agréable au goût de 0,98 g ± 0,34 g (figure 6A). Les paramètres de la microstructure de l’apport alimentaire le jour de l’essai, y compris la durée des repas (figure 6B), le temps passé dans les repas (figure 6C), la latence au premier combat (figure 6D), la taille du combat (figure 6E), la durée du combat (figure 6F), le temps passé dans les combats (figure 6G), et le nombre de combats (Figure 6H), ont été évalués automatiquement et extraits des totaux psc en utilisant la visionneuse de données.
Pour étudier la spécificité de l’essai d’hypophagie nouveauté-induite, les données décrites ci-dessus des rats naïfs et non stressés ont été comparées à ceux qui ont reçu une injection intracerebroventriculaire du facteur de corticotropin-libération, qui stimule l’axe hypothalamus-pituitary-surrénale de stress et induit le stresset l’inquiétude 11. Les données individuelles pour chaque animal ont étéobtenuesà l’aide de la «visionneusede données » et des « totaux psc », tels que décrits dans la section protocole. Les données individuelles ont ensuite été rassemblées en fonction de groupes dans un programme de feuilles de calcul et analysées pour les différences statistiques. Une différence significative dans la taille des repas(p < 0,01) et la taille du combat(p < 0,01) a été détectée entre les deux groupes (tableau 2). La différence dans la taille du combat n’aurait pas été détectable à l’aide d’une évaluation manuelle.
Figure 1 : Mise en place du test de préférence du saccharose. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Mise en place d’un test d’hypophagieinduit par la nouveauté. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 :Période de formation pour le test de préférence du saccharose. La consommation de solution de saccharose (A) et d’eau (B) a été évaluée à plus de 24 h pendant 2 jours. Le rapport de préférence saccharose (C) a été calculé en conséquence. Les données sont présentées comme des ± sem de huit rats (*p < 0,05, ***p < 0,001). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Test de préférence du saccharose. Le jour de l’essai, la microstructure d’apport liquide (ici, montré pour la prise de saccharose) a été analysé plus de 1 h pour la taille du repas inclus (A), la durée du repas (B), le temps passé dans les repas en s (C), le temps passé dans les repas en % (D), le nombre de repas (E), la latence au premier repas (F), intervalle entre les repas (G), le taux de consommation (H), durée du combat (I), la taille du combat (J), le temps passé dans les combats en s (K), et le temps passé dans les combats en % (L). Les données sont présentées comme des ± SEM, n = 8 rats. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Période de formation pour le test d’hypophagie induit par la nouveauté. La taille durepas( A ), la durée du repas (B), le temps passé dans les repas en s (C), la latence au premier combat (D), la taille du combat (E), la durée du combat (F), le temps passé dans les combats (G), et le nombre de combats (H) ont été évalués sur une période de 5 jours. Les données sont présentées comme des ± SEM, n = 8 rats. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: Test d’hypophagie induit par la nouveauté. Le jour de l’essai, la microstructure d’apport alimentaire a été analysée sur 1 h pour la taille des repas (A), la durée des repas (B), le temps passé dans les repas (C), la latence au premier combat (D), la taille du combat (E), la durée du combat (F), le temps passé dans les combats (G) et le nombre de combats (H). Les données sont présentées comme des ± SEM, n = 8 rats. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Paramètre | Évaluation manuelle | Surveillance automatisée des prises |
| Période d’entraînement (jour 1) | ||
| Prise de saccharose (ml) | 63,46 ± 10,2 | 24,4 ± 3,48** |
| Inakte d’eau (ml) | 12 07 ± 1 62 | 4,83 ± 0,89** |
| Rapport de préférence saccharose | 0,83 ± 0,03 | 0,8 ± 0,06 |
| Période d’entraînement (jour 2) | ||
| Prise de saccharose (ml) | 45,49 ± 5,75 | 33,77 ± 4,49 |
| Inakte d’eau (ml) | 4,92 ± 0,80 | 0,42 ± 0,13*** |
| Rapport de préférence saccharose | 0,89 ± 0,02 | 0,99 ± 0,004** |
| Test de préférence saccharose | ||
| Prise de saccharose (ml) | 10h15 ± 0,53 | 2,91 ± 0,66**** |
| Inakte d’eau (ml) | 6,65 ± 0,68 | 0 *** |
| Rapport de préférence saccharose | 0,61 ± 0,04 | 0,99 ± 0,001*** |
Tableau 1 : Test de préférence du saccharose chez les rats naïfs à l’aide d’une évaluation manuelle par rapport au système automatisé de surveillance des prises.. La distribution des données a été déterminée à l’aide du test Kolmogorov-Smirnov. Les données sont exprimées en ± moyenne sem et les différences ont été analysées à l’aide de t-tests ou du test Mann-Whitney U selon la distribution des données (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vsévaluation manuelle).
| Paramètre | non stressé | stressé |
| (n=8) | (n=11) | |
| Taille du repas (g/300g bw) | 0,98 ± 0,29 | 0,35 ± 0,07** |
| Durée du repas (sec) | 998,29 ± 163,87 | 1209,11 ± 114,67 |
| Temps passé dans les repas (sec) | 998,29 ± 163,87 | 989,27 ± 174,73 |
| Temps passé dans les repas (%) | 55.46± 9.10 | 54,96 ± 9,71 |
| Latence au premier combat (sec) | 241,25 ± 45,96 | 185,50 ± 57,52 |
| Taille du combat (g) | 0,21 ± 0,03 | 0,08 ± 0,01** |
| Durée du combat (sec) | 70,70 ± 14,12 | 45,59 ± 4,20 |
| Temps passé dans les combats (sec) | 439,75 ± 125,94 | 208,73 ± 45,01 |
| Temps passé dans les combats (%) | 24.43 ± 7.00 | 11,6 ± 2,50 |
| Bouts (nombre) | 5,63 ± 0,67 | 4,64 ± 0,80 |
Tableau 2 : Test d’hypophagie induit par la nouveauté chez les rats naïfs non stressés et stressés (injectés par le CRF). Dans le groupe de stress, les rats icv-cannulated ont été injectés avec 0.6 μg/5 μL CRF et soumis à l’hypophagie nouveauté-induite après. La distribution des données a été déterminée à l’aide du test Kolmogorov-Smirnov. Les différences ont été analysées à l’aide de t-tests ou du test Mann-Whitney U en fonction de la distribution des données. Pour une meilleure comparabilité, toutes les données sont exprimées en ± SEM (**p < 0,01 vsnon stressé).
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Discussion
La préférence de saccharose et les essais d’hypophagie novelty-induits sont deux techniques établies pour évaluer l’anhédonie chez les rats. Leur combinaison avec le système automatisé de surveillance de l’apport alimentaire permet une analyse plus détaillée chez les rats non perturbés et réduit les mesures erronées.
L’incidence des erreurs est réduite par différentes approches. Tout d’abord, pour remédier à l’erreur due au déversement, l’écart entre la trémie et la porte permet aux miettes générées pendant le rongement de tomber sur le plateau intégré. En recueillant ce déversement sur les supports de cage, ils sont inclus dans la mesure (puisque le déversement est toujours dans la balance, il n’affecte pas la mesure). Deuxièmement, pour éviter la thésaurisation, l’ouverture de la cage à rats est suffisamment grande pour permettre à l’animal de manger de la trémie de nourriture avec sa tête à l’intérieur de l’ouverture, mais assez petite pour limiter la capacité de l’animal à utiliser ses mains pendant qu’il mange. Cela limite leur capacité d’enlever les aliments et de les mettre dans la cage.
Troisièmement, le système réduit la perte involontaire de liquide parce que la bouteille liquide, après amorçage, ne fuit pas, et l’évaporation ne se produit que lentement (environ <10 mg/h) à l’interface précision boule en acier inoxydable / tube sipper. En outre, parce que le système pèse automatiquement les bouteilles, la manipulation des bouteilles pendant l’enregistrement n’est pas nécessaire, ce qui est une cause fréquente d’erreurs. Les différences observées dans la comparaison entre les mesures manuelles etautomatisées (tableau 1) sont soupçonnées d’être dues à une perte involontaire lors de la manipulation manuelle des bouteilles.
L’utilisation du système automatisé de surveillance de l’apport alimentaire offre plusieurs avantages, tels que l’analyse détaillée de l’apport alimentaire solide et liquide et l’évaluation de la microstructuresous-jacente de l’apport alimentaire 10. Le terme « microstructure » décrit plus en détail le modèle d’apport alimentaire ou liquide. Dans les études sans système automatisé de surveillance des prises, l’apport est mesuré en pesant les aliments et les liquides au début et à la fin d’un point d’intérêt. La seule information obtenue par cette approche est la consommation totale sur une certaine période de temps.
En revanche, le système de surveillance automatisé fournit plus d’informations sur la consommation au cours de cette période, car il enregistre les changements de poids des microbalances chaque seconde. Les enregistrements peuvent détailler quand le rongeur commence à manger, combien de fois il mange, combien de temps il mange, combien il mange, combien de temps les pauses entre manger sont, etc. Pour obtenir des données similaires au système automatisé à l’aide de mesures manuelles, les utilisateurs doivent mesurer fréquemment le contenu pendant les essais et la formation et ainsi perturber considérablement les animaux. Avec le système automatisé, les rongeurs restent intacts pendant les séances d’entraînement et les tests.
Compte tenu du grand nombre de systèmes d’admission automatisés disponibles pour les rongeurs, il est important de noter qu’aucun modèle spécifique n’est nécessaire pour le protocole décrit ici. Cependant, ce système est très sensible. Pour éviter les erreurs dues au bruit environnemental (vibration de faible niveau ou tremblement de la masse sur l’échelle), l’algorithme du système évalue les valeurs collectées seconde par seconde, et n’accepte que celles qui sont inférieures à un point fixe pour le « bruit » afin de moyennes 10 valeurs. Si le système dépasse ce seuil de bruit, les valeurs ne sont pas utilisées pour calculer les poids stables, qui sont utilisés pour calculer les épisodes d’alimentation.
En ce qui concerne l’exécution des tests, plusieurs points critiques doivent être gardés à l’esprit. Tous les tests comportementaux doivent être effectués à la même heure de la journée, car les altérations circadiennes peuvent affecter lecomportement des animaux 12,13. La plupart des études effectuent des tests comportementaux pendant la phase de lumière, tandis qu’ici, tous les tests ont été effectués pendant la phase sombre. Les rongeurs sont des animaux nocturnes et donc actifs dans la phase sombre, alors qu’ils dorment ou moinsactifs 12 avec une activité exploratoire inférieure13 pendant la phase de lumière. Ainsi, les tests comportementaux sont plus physiologiquement appriopriate pendant la période de photo sombre.
Il est important de noter que pour le test de préférence saccharose, différentes concentrations de la solution saccharose ont été utilisées, allant de 0,5%-10%4,7,14. Ils sont principalement choisis en fonction de l’espèce, de la souche, du sexe et de l’âge, mais surtout en fonction du comportement de consommation observé pendant l’entraînement (tous les animaux devraient boire à peu près la même quantité avant le traitement ou l’intervention). Toutefois, des concentrations élevées (p. ex., 10 %) peut l’emporter sur l’anhédonie, puisque même les animaux ayant un comportement dé depression-like boivent encore des liquides trèssucrés 4.
En outre, la teneur calorique élevée due à des concentrations élevées peut affecter plus en évidence la préférence pour la solution de saccharose. Par conséquent, une solution de saccharose de 1% a été choisie pour ce protocole. Certaines études recommandent l’utilisation de la saccharine au lieu dusaccharose 15 pour éviter toute influence calorique. Toutefois, la teneur calorique moyenne de la quantité consommée de % de solution saccharose (2 g de solution saccharose de 1 % contient 0,08 kcal) est considérablement inférieure à celle de la même quantité de chow standard (2 g contient 7,8 kcal). Ainsi, ce point semble secondaire.
Il est également important de noter que le rapport de préférence de saccharose de base évalué ici à l’aide du système automatisé de surveillance de l’apport alimentaire est plus élevé (0,99) que les études précédentes utilisant une évaluation manuelle (avec 0,7 chezla souris 8, 0,8 chez les jeunes rats adultes, 0,6 chez les rats sprague dawleymâles âgés 16). Cela peut être dû à la manipulation des bouteilles, puisque la pesée conventionnelle provoque probablement une perte de liquide lors de l’insertion et de l’enlèvement des cages. Cela est encore corroboré par les résultats présentés dans le tableau 1. Par conséquent, l’utilisation du système automatisé de surveillance peut être plus adaptée à la détection de l’anhédonie, tandis que la stimulation supplémentaire des aspects hédoniques de l’apport alimentaire peut être manquée en raison des effets du plafond.
En ce qui concerne le test d’hypophagie induite par la nouveauté, il est crucial de permettre aux rats de développer une base stable pour la prise de la collation agréable au goût avant d’effectuer le test. Ce n’est que lorsqu’une base de référence stable est atteinte à l’intérieur et entre les rats que le test proprement dit doit être effectué. Dans le cas contraire, les effets de l’intervention (c.-à-d. drogue, stress, etc.) peuvent être manqués, ou les fluctuations de la ligne de base peuvent être mal interprétées. Il est également important de s’assurer que la cage nouvelle induit un stress de nouveauté entraînant l’hypophagie. Bien que plusieurs protocoles suggèrent que l’utilisation d’une nouvelle cage est suffisante en soi, nous avons observé que les cages non utilisées auparavant, mais contenant de la literie et de l’enrichissement peuvent ne pas induire de stress, puisque les rats sont souvent habitués au nettoyage/changement hebdomadaire de cage. Par conséquent, une nouvelle cage vide doit être utilisée. Étant donné que l’apport alimentaire avant le test peut également avoir une incidence sur les résultats, l’apport alimentaire doit être surveillé avant le test. Cela peut être facilement fait d’une manière automatisée.
Dans la littérature, divers tests alternatifs sont utilisés pour évaluer différents aspects du comportement de dépression (souvent le désespoir au lieu de l’anhédonie); cependant, les méthodes illustrées dans ce manuscrit ont plusieurs avantages. Une autre méthode couramment utilisée pour évaluer le désespoir comportemental dans le cadre d’un comportement de dépression est le test de natation forcé4. Par la présente, aucune consommation alimentaire n’est évaluée; il n’y a donc aucun risque de mesurer l’inexactitude.
Ce protocole présente plusieurs autres inconvénients. Un examen récent a conclu que le test de natation forcée est un test qui mesure réellement les stratégies d’adaptation au stress et non le comportement de dépression17. En outre, si une conception de croisement est préférable pour réduire le nombre d’animaux selon les « trois R » du bien-être animal, le test de natation forcée ne peut pas être appliqué, car il peut exercer un effet durable (traumatisant) sur le comportement des animaux testés18.
En revanche, le SPT et les NIH n’ont pas d’aspects traumatisants et peuvent être répétés. Il convient également de noter que la phase de formation avant le SPT et les NIH établit une accoutumabilité à la consommation; par conséquent, il est possible de répéter le protocole. Après le test, les aliments savoureux (solution saccharose ou collation) sont enlevés, et la formation est réintroduite environ 24 h après l’essai; ainsi, les rongeurs ont une pause sans accès au stimulus agréable au goût. On suppose qu’après la pause, une nouvelle période d’entraînement avec adaptation devrait avoir lieu pour assurer un rapport de préférence d’environ 1 ou qu’un apport stable en collation de base est atteint avant de répéter les tests.
Un essai semblable à l’essai forcé de natation est l’essai de suspension de queue, une période de stress à court terme et inévitable dans laquelle les animaux sont suspendus par leur queue et développent une posture immobile interprétée comme signe de comportement dépression-comme19. Ce test ne peut être utilisé que chez la souris, puisque les rats ne doivent pas être suspendus par leur queue en raison d’un poids moyenplus élevé de 20, tandis que le SPT et les NIH peuvent être utilisés chez les souris et les rats.
D’autres avantages des essais présentés dans ce manuscrit sont que le test d’hypophagie induit par la nouveauté affiche une bonne validité de construction ; par conséquent, il mesure jusqu’à ses revendicationsbien 21,22. Par conséquent, la quantité de la substance acceptable consommée est corrélée avec l’intensité de l’anhédonie, corroborée par la conformité des résultats du SPT et des NIH avec d’autres tests comportementaux12. En outre, le test de préférence de saccharose et le test d’hypophagie induite par la nouveauté ont une bonne validité de visage. Ils sont subjectivement considérés comme mesurant ce qui est prévu (ici, anhédonie évaluée comme consommation réduite de substances acceptables)21,22.
Les principales limitations du système automatisé de surveillance des prises sont les exigences d’une formation adéquate et de l’entretien/nettoyage quotidien du système, ce qui le rend plus laborieux que les protocoles manuels. Dans les expériencesprécédentes 10, il a été observé que bien que les jeunes rats s’adaptent au système automatisé, les rats plus âgés parfois pas. Ces animaux devraient évidemment être exclus de l’expérience.
En ce qui concerne les limites du test comportemental, il convient de mentionner que la formation prend également beaucoup de temps, en particulier les NIH. En outre, les protocoles sont à court terme, et l’application à long terme peut conduire à la malnutrition. Jusqu’à présent, la littérature ne fait pas état de l’utilisation de ces tests dans les états de famine (par exemple, un modèle pour l’anorexie mentale, un trouble de l’alimentation couramment associé à des symptômes de dépression), il n’y a donc aucune recommandation de leur utilisation pour les états de famine.
Avec ce protocole, il n’est possible de détecter qu’il y a anhédonie (consommation réduite de liquide/collation). Cependant, il n’est pas en mesure de quantifier spécifiquement le degré d’anhédonie. À l’avenir, l’introduction de plusieurs bouteilles avec différentes concentrations de saccharose pourrait être un ajout possible pour quantifier davantage l’anhédonie. Dans l’ensemble, l’utilisation de la surveillance automatisée de l’admission peut être utile dans toute expérience où une détection précise de l’apport est nécessaire, par exemple en surveillant l’apport oral de médicaments dissous dans l’eau potable pour des études pharmaceutiques.
En résumé, le test de préférence de saccharose et le test d’hypophagie induite par la nouveauté sont des protocoles bien établis pour évaluer l’anhédonie comme une partie du comportement dépression-comme chez les rongeurs. Lorsqu’elles sont combinées avec le système automatisé de surveillance de l’apport alimentaire, même des différences subtiles peuvent être détectées d’une manière fiable et reproductible.
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Disclosures
A.S. est consultant pour un & r Berlin, Boehringer-Ingelheim, Takeda et Schwabe. Il n’y a pas de conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par le financement de la Fondation allemande pour la recherche (STE 1765/3-2) et du Financement universitaire de la Charité (UFF 89/441-176, A.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Assembly LH Cage Mount - RAT-FOOD - includes Stainless cage mount, hopper, blocker, coupling | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCMPRF01 | |
| Assembly LH Cage Mount unplugged - RAT - FOOD includes stainless steel cage mount, hopper, blocker, unplugged adapter, coupling | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCMUPRF01 | |
| cage w/ 2 openings - RAT - costum modified cage - includes cage top and standard water bottle | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCR02 | single housing |
| Data collection Laptop Windows - Configured w/ BioDAQ Software | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BLT003 | |
| enrichment (plastic tubes, gnawing wood) | distributed by the animal facility | ||
| HoneyMaid Graham Cracker Crumbs | Nabisco, East Hanover, NJ, USA | ASIN: B01COWTA98 | palatable snack for NIH test |
| low vibration polymer rack | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BRACKR | |
| male Sprague Dawley rats | Envigo | Order Code: 002 | |
| Model #2210 32x Port BioDAQ Central Controller - includes cables, and calibration kit | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCC32_03 | |
| Peripheral sensor Controller - includes cable | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BPSC01 | |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | statistical analysis | |
| Stainless steel blocker | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BBLKR | |
| standard rodent diet with 10 kcal% fat | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | D12450B | |
| sucrose powder | Roth | 4621.1 | for SPT |
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