Summary
Presenteras här är ett protokoll för att studera depression-liknande och anhedonic beteende hos råttor. Den kombinerar två väletablerade beteendemetoder, sackaros preferens och nyhet-inducerad hypofagi tester, med en automatiserad mat och flytande intag övervakningssystem, att indirekt undersöka gnagare beteende med hjälp av surrogat parametrar.
Abstract
Prevalensen och incidensen av depressiva störningar ökar över hela världen, vilket påverkar cirka 322 miljoner individer, vilket understryker behovet av beteendestudier i djurmodeller. I detta protokoll, att studera depression-liknande och anhedonic beteende hos råttor, den etablerade sackaros preferens och nyhet-inducerad hypofagi tester kombineras med en automatiserad mat och flytande intag övervakningssystem. Före testning, i sackaros preferens paradigm, hanråttor tränas i minst 2 dagar att konsumera en sackaros lösning förutom kranvatten. Under testet utsätts råttor återigen för vatten- och sackaroslösning. Förbrukningen registreras varje sekund av det automatiserade systemet. Förhållandet mellan sackaros och totalt vattenintag (sackaros preferensförhållandet) är en surrogatparameter för anhedonia. I det nya hypofagitestet genomgår hanråttorna en träningsperiod där de utsätts för ett välsmakande mellanmål. Under träningen visar gnagare ett stabilt baslinje mellanmål intag. På testdagen överförs djuren från hemburar till en fräsch, tom bur som representerar en ny okänd miljö med tillgång till det kända välsmakande mellanmålet. Det automatiserade systemet registrerar det totala intaget och dess underliggande mikrostruktur (t.ex. latens till närmar sig mellanmål), vilket ger insikt i anhedonic och oroliga beteenden. Kombinationen av dessa paradigm med ett automatiserat mätsystem ger mer detaljerad information, tillsammans med högre noggrannhet genom att minska mätfel. Testerna använder dock surrogatparametrar och skildrar bara depression och anhedonia på ett indirekt sätt.
Introduction
I genomsnitt drabbas 4,4 % av världens befolkning av depression. Dessa står för 322 miljoner människor världen över, en ökning med 18% jämfört med för tio år sedan1. Enligt uppskattningar från Världshälsoorganisationen, depression kommer att vara tvåa i rangordningen av funktionshinder justerade livsår i 20202. För att ta itu med den ökande prevalensen av affektiva störningar och fastställa nya interventionella strategier, är det nödvändigt att ytterligare studera detta beteende. Före och utöver undersökning på människor är djurstudier nödvändiga.
Flera modeller har fastställts för att studera komponenter av depressiv beteende (dvs, forcerad simma test, svans suspension test, sackaros preferenstest, och nyhet-inducerad hypofagi)3,4. Sackaros preferenstestet (SPT) och nyhet-inducerad hypofagi (NIH) kan upptäcka depression-liknande beteende hos djur. Dessa tester själva inducerar inte ett tillstånd av depression hos gnagare men skildrar akuta förändringar i beteende. Både SPT och NIH bedöma en karakteristisk drag av depression kallas anhedonia, som är förlusten av intresse för följande: givande verksamhet, aktiviteter som en gång haft av denenskilde 5, och en aspekt av den komplexa fenomenet bearbetning och svara på belöning6. Båda testerna studerar svaret på en givande stimulans i form av välsmakande mat. Omfattningen av konsumtionen fungerar som en surrogat parameter för anhedonia7,8,9.
Värdet av tester som undersöker anhedonia är starkt beroende av den exakta bestämningen av förbrukningen som är ett resultat av exakt mätning av ämnets vikt. Konventionellt bedrivs denna mätning manuellt en gång före och en gång efter testet. Detta är dock benägna att felaktiga mätningar av flera skäl. Först tenderar gnagare att hamstra mat, vilket innebär att de tar bort mat utan att konsumera det omedelbart sedan dölja det på en säker plats. Således kan denna förlust av livsmedel ingå i beräkningen av den totala konsumtionen. Andra, råttor spill mat och vatten, vilket resulterar i viktminskning utan respektive konsumtion. För det tredje uppstår oavsiktlig vätskeförlust på grund av hanteringen av flaskorna genom att de förs in och avlägsnas från burar.
I ett tillvägagångssätt för att minska dessa felkällor, kombinerade vi de två vanliga testerna bedöma anhedonia (SPT3,4 ochNIH 9 ) med mätning av mat och vattenintagmed hjälp av en automatiserad mat och flytande intag övervakningssystem. Detta förfarande möjliggör korrekt undersökning av konsumtion av välsmakande ämnen samt ger information om upplevelsen av njutning hos råttor som en funktion av depression-liknande beteende. De ovannämnda felen i samband med manuell mätning minskas genom att använda olika tillvägagångssätt, som illustreras senare mer i detalj.
För att ge information om mikrostruktur väger det automatiska intagsövervakningssystem som användsi detta protokoll 10 livsmedlet (±0,01 g) varje sekund. Således är en stabil vikt dokumenteras som "inte äta", och en instabil vikt som "äta". En "bout" definieras som förändring i stabil vikt före och efter en händelse. En måltid består av en eller flera skjutningar och dess minsta storlek hos råtta definierades som 0,01 g. En måltid separeras från en annan måltid i råtta med 15 min (standardiserat värde). Således anses födointag vara en måltid när skjutningarna inträffade inom 15 min och viktförändringen är lika lika med eller större än 0,01 g. Måltidsparametrar som bedöms i detta protokoll inkluderar måltidslängd, tid i måltider, anfallsstorlek, matchlängd, tid i anfall, latens till första skjutningen och antal skjutningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurvård och experimentella förfaranden följde de särskilda institutionella etiska riktlinjerna och godkändes av den statliga myndigheten för djurforskning.
1. Drift av det automatiserade övervakningssystemet
OBS: Vid drift av det automatiska övervakningssystemet är det avgörande att dokumentera varje åtgärd i kommentarsfältet som ingår i programvaran omedelbart före åtgärden. Beskrivningen ska skrivas in i kommentarsrutan och genom att trycka på Sparasparas den med en viss tidspunkt. Tidspunkterna är betydande vid analys av data, eftersom systemet registrerar kontinuerligt och perioden av intresse måste anges för analys.
- Installera, använda och underhålla det automatiserade övervakningssystemet
OBS: Detta protokoll använder vuxna manliga Sprague Dawley råttor som väger 250–300 g (~ 10 veckor gammal). Det rekommenderas att hus råttor i grupper under acklimatiseringsperioden. Miljöförhållandena bör kontrolleras med följande parametrar: 12 h/12 h dark/light-cykel med lampor på kl 6:00 A.M., luftfuktighet på 45%–65%, och temperatur på 21–23 °C, och ad libitum tillgång till vatten och gnagare standard diet. Daglig hantering gör det möjligt för djuren att vänja sig vid utredarna.- Separera råttorna så att varje djur har en individuell bur. Se till att varje råtta stannar separerad under protokollet.
- Fyll bostadsburarna med vanligt sängkläder med ett 1–2 cm tjockt lager. Denna (reducerade) mängd minskar möjligheten till kontaminering av mikrobalanser och trattar med spill, och minskar därmed mätfel. Lägg till plaströr (t.ex. en 20 cm lång bit av en plastspuprör med diameter på 8 cm) och gnaga trä som anrikning, samtidigt som pappersvävnader utelämnas för att minska mätfel.
- Förbered burarna för den automatiserade fasta och flytande födointagsmätningen genom att fästa två slutna burfästen med mikrobalanser på specialtillverkade hål i burens främre sida. Placera två tomma trattrar på burfästena, en för chow och en för flaskan.
OBS: Mikrobalanserna ansluts via kablar till ett inspelningssystem som är fäst vid en dator och respektive programvara är installerad på datorn. - För att börja spela in, öppna" Monitor" och tryck på" Start", välj sedan en plats där data sparas.
- Med hjälp av kalibreringen (tryck "Kalibrera") funktion av det automatiserade intag övervakningssystemet, kalibrera varje balans genom att ta bort trattarna och placera två olika mätare vikter på buren fästen med balanser. Gör detta med jämna tidsintervall (varje vecka rekommenderas).
- Fyll en hopper helt med chow (~ 100 g) och ta bort chow bitar och smular som är för små i storlek. Fyll vatten i flaskan (~ 100 mL) och placera den i den andra hopper.
- Dokumentera placeringen av mat och vatten (t.ex., balans 1: matdjur 1, balans 2: vattendjur 1).
- Placera råttan i buren och öppna burfästenas alla portar så att den kan äta och dricka ad libitum.
OBS: För en noggrann mätning är det nödvändigt att upprätthålla balanserna och trattar dagligen genom att rengöra försiktigt med en borste från spill och ta bort små matsmulor från matbehållaren. Detta kommer att minska felaktiga mätningar kraftigt. Stäng alla portar under det dagliga underhållet.
- Åtkomst till data efter experimenten
- Sök i kommentarsfältet efter början och slutet tidspunkter för en period (t.ex. utbildning, test) som måste analyseras.
- Klicka på "Visa data" på programvaran för att öppna Data Viewer.
- Infoga tidspunkterna i rutorna nedan "Begin time" och "Sluttid". Tryck på fyrkanten i det vänstra övre hörnet som anger den balans som spelade in informationen.
- Klicka på "PSC Totals" för att komma åt mikrostrukturdata. Tryck på knappen "Exportera PSC-tabell" för att exportera data.
OBS: För att jämföra mikrostrukturen hos enskilda djur (t.ex. ostressad kontra stressad) med hjälp av automatiserad övervakning kan enskilda djur väljas i "Data viewer" genom att trycka på lämplig fyrkant i det vänstra övre hörnet. PSC Totals visar endast mikrostrukturen för det valda djuret. Det går inte att utföra statistisk analys med systemet. Data behöver extraheras till ett kalkylprogram / analysera programvara.
2. Genomförande av sackarospreferenstestet
- Genomförande av utbildningsperioden
OBS: Före testet måste djuren vara vana vid att det finns tillgång till två flaskor för vätskor på tratare genom grindarna, medan livsmedel bör tillhandahållas från burars toppar (uppställd visas i figur 1). Denna utbildningsperiod bör pågå i minst 2 dagar. Det utförs i hemburarna i rummet där djur hålls.- Stäng alla portar. Ta bort vattenflaskan och matbehållaren från mikrobalanserna.
- Placera färdig vägd mat (~50 g) på burens ovansidan och dokumentera dess vikt dagligen med hjälp av en regelbunden balans för att bedöma daglig livsmedelskonsumtion. Fyll på, om det behövs.
- Rengör en flaska med klart vatten och fyll på med runt 100 mL vatten. Placera tillbaka den på hoppern.
- Fyll en andra ren flaska med 100 mL nygjord 1% sackaroslösning. Placera den på hoppern.
OBS: Märk flaskorna noggrant och dokumentera deras platser (t.ex. balans 1: vattendjur 1, balans 2: sackaroslösning djur 1). - Öppna alla portar. Dokumentera inledningen av utbildning i övervakningssystemet. Lämna portarna öppna i 24 h, vilket resulterar i ad libitum tillgång till båda flaskorna. Efter 24 h stänger du grindarna och dokumenterar slutet på utbildningen. Data från 24 h-intervallet kan bedömas med hjälp av det automatiserade övervakningssystemet genom att infoga "begin time" och "sluttid". Förfarandena är desamma när ett 1 h testintervall bedöms.
- Rengör och fyll på flaskorna var 24 h. Förbered färsk 1% sackaroslösning dagligen. Växla läge för vatten och sackaros lösning flaska dagligen för att undvika tillvänjning effekter.
OBS: Genomför utbildningen i alla djur minst 48 h tills preferenskvoterna når ~1. Kvoten sackarospreferens bedöms direkt efter träning med hjälp av "Data viewer". Det beräknas som förhållandet mellan sackarosintag och totalt intag (vatten plus sackarosintag). - 24 h före testet, ta bort flaskan med sackaroslösningen så att råttan har tillgång till enbart vanlig chow och vatten.
- Förbered en färsk flaska fylld med kranvatten och en fylld med en 1% sackaroslösning, båda med ~ 100 mL.
- Före testning, stäng alla grindar.
- Ta bort flaskan fylld med kranvatten från hoppern och placera de två färska flaskorna, en fylld med kranvatten och en fylld med en 1% sackaroslösning, på hoppern.
- Öppna alla grindar, dokumentera starten av testet i övervakningssystemet. Lämna portarna öppna i 60 min. Stäng grindarna efter 60 min och dokumentera testets.
- Bedöma data (t.ex. kvoten för sackaros/totalt vätskeintag).
OBS: Testet kan upprepas flera gånger med intervall av träning (minst 2 dagar) däremellan.
3. Genomförande av det nya-inducerad hypofagi test
- Genomförande av utbildningsperioden
OBS: Före testning rekommenderas en daglig 30 min träningsperiod på 5 dagar (uppställda visas i figur 2). Syftet är att uppnå en stabil baslinje för välsmakande mellanmål intag före experimentet. Det utförs i hemburarna i rummet där djur hålls.- Stäng alla grindar och ta bort hoppern med standard chow.
- Fyll en färsk hopper med det välsmakande mellanmålet (~50 g). Sätt in kexen försiktigt i hoppern för att förhindra att sönderfalla. Placera hoppern på burfästet ovanpå mikrobalansen.
- Öppna portarna i 30 min så att råttan har ad libitum tillgång till mellanmål och vatten. Dokumentera början av utbildning i övervakningssystemet.
OBS: Råttan ska inte ha tillgång till standard chow under träningsperioden. - Stäng grindarna efter 30 min och dokumentera slutet på utbildningen i övervakningssystemet. Byt ut mellanmålet mot vanlig chow.
- Upprepa detta dagligen tills ett 1) stabilt intag av baslinjen för välsmakande mellanmål uppnås (t.ex. 1,5–2,0 g/30 min) och 2) intag skiljer sig inte statistiskt mellan träningsdagarna.
- Utföra det nya hypofagitestet
- Bered en tom, nyrengjord bur utan strö eller berikning som är fäst vid det automatiserade övervakningssystemet för födointag. Placera en hopper med en flaska kranvatten och hopper med ett smakligt mellanmål på burfästena.
OBS: Den nya buren bör placeras i samma rum där råttorna hålls och utbildning genomförs. Håll portarna stängda. - Ta bort råttan från hemburen och placera i romanburen.
- Öppna alla portar i 30 min. Dokumentera början av testning i övervakningssystemet.
OBS: Under de 30 min tillgång till mellanmål, storleken på mellanmål intag och underliggande mikrostruktur parametrar (t.ex. latens till första måltid) registreras med hjälp av automatiserade födointag övervakningssystem. - Stäng grindarna efter 30 min och dokumentera slutet av testningen. Placera tillbaka råttan i hemburen.
OBS: Testet kan upprepas flera gånger med intervall av träning (minst 5 dagar) i mellan.
- Bered en tom, nyrengjord bur utan strö eller berikning som är fäst vid det automatiserade övervakningssystemet för födointag. Placera en hopper med en flaska kranvatten och hopper med ett smakligt mellanmål på burfästena.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att testa datafördelning användes Kolmogorov-Smirnov-testet. T-tester användes när data normalt distribuerades och Mann-Whitney-U-test användes, om så inte var fallet. Enkelriktad ANOVA följt av Tukey post-hoc test användes för normalt distribuerade flera grupp jämförelse. Enkelriktad ANOVA följt av Dunns multipel jämförelse test användes i fall av icke-normala fördelning. Skillnader mellan grupper ansågs betydande när p < 0,05.
SPT utfördes på naiva råttor i denna studie. Förbrukningen av sackaroslösning ökade och intaget av vatten minskade under utbildningsperioden (figur 3). På den första dagen av utbildningen, råttor drack 24,40 mL ± 3,48 mL sackaroslösning (Figur 3A) och 4,83 mL ± 0,89 mL av vanligt vatten (Figur 3B), vilket ger en sackaros preferensförhållandet 0,80 ± 0,06 (Figur 3C). På den andra dagen av utbildning, råttor ökade sackaros lösning konsumtion upp till 33.77mL ± 4.49 mL (inte betydande, p = 0,17 mot.dag 1) och minskat vattenintag till 0,42 mL ± 0,13 mL (p < 0,001 vs.dag 1), vilket ger ett förhållande på 0,99 ± 0,004 (p < 0,05 vs. dag 1; Bild 3C). Här studerades åtta råttor; sålunda härleds varje datapunkt från åtta djur. Vätskeintag inklusive dess mikrostruktur registrerades automatiskt. Datan extraherades från PSC Totals med hjälp av Data viewer.
Under 60 min-testen konsumerade djuren mellan 0–6,18 mL sackaroslösning med ett medelvärde på 2,91 mL ± 0,66 (n =8) utan att förbruka vatten, vilket gav ett sackaros preferensförhållande på 0,99 ± 0,00. De djur som inte konsumerade någon vätska under testet uteslöts från analysen. Åtta råttor studerades. Vätskeintaget registrerades automatiskt.
Det automatiska intagsövervakningssystemet lämnade data om mikrostruktur för sackaros som bedömdes automatiskt under testningen, som extraherades från PSC Totals med hjälp av Data viewer. Dessa parametrar var måltidsstorlek (figur 4A), måltidens varaktighet (figur 4B), tid som tillbringas i måltider i sekunder (figur 4C) och procentsatser (Figur 4D), måltidsfrekvens (Figur 4E), latens till första måltiden (Figur 4F), mellanmåltidsintervall (figur 4G), dryckesfrekvens (figur 4H), längd för skjutningar (figur 4I), skjutningens storlek (figur 4J), och tid som tillbringas i skjutningar i sekunder (Figur 4K) och procenttal (Figur 4L).
För att ytterligare studera fördelar med det automatiska systemet för övervakning av intag jämfördes de data som illustrerades ovan med uppgifter som vunnits med hjälp av konventionella manuella bedömningar (vägning av flaskor manuellt före och efter träning/testperiod, tabell 1). På den första dagen av träningen var sackaros (p < 0,01) ochvattenintag ( p < 0,01) betydligt högre vid manuell bedömning jämfört med automatiskt. På utbildningsdagen andra dagen skilde sig vattenintaget (p < 0,001) och sackarospreferensförhållandet (p < 0,01) mellan de två grupperna och under testningen. Alla parametrar, nämligen sackarosintag (p < 0,001), vattenintag (p < 0,001), och sackaros preferensförhållandet (p < 0,001) var olika mellan grupper, möjligen på grund av felaktigt hög mätning eller spill vid manuell bedömning.
Det totala intaget av det välsmakande mellanmålet under utbildningen ökade stadigt: 0,48 g ± 0,14 g (dag 1), 1,05 g ± 0,32 g (dag 2), 1,48 g ± 0 56 g (dag 3), 1,1 g ± 0,39 g (dag 4), och 1,91 g ± 0,68 g (dag 5), vilket indikerar en anpassning under de första 2–3 dagarna. På samma sätt trendade måltidsstorleken mot en ökning mellan träningsdagarna (figur 5A, p = 0.12), medan måltidens varaktighet (figur 5B) inte gjorde det (p > 0.05). Likaså andra mikrostrukturella parametrar såsom tid i måltider (Figur 5C), latens till första skjutningen (Figur 5D), bout storlek (Figur 5E), bout varaktighet (Figur 5F), tid i anfall (Figur 5G), och antal skjutningar (Figur 5H) var inte signifikant annorlunda mellan dessa dagar (p > 0,05). Åtta råttor studerades; sålunda härleds varje datapunkt från åtta djur. Snack intag inklusive mikrostrukturen spelades in automatiskt. Datan extraherades från PSC Totals med hjälp av Data viewer.
På testdagen visade naiva råttor som exponerades för mellanmålet i en ny miljö ett intag av det välsmakande mellanmålet på 0,98 g ± 0,34 g (Figur 6A). Parametrar för födointagsmikrostruktur på testdagen, inklusive måltidens varaktighet (Figur 6B), tid i måltider (Figur 6C), latens till första skjutningen (Figur 6D), Skjutningens storlek (Figur 6E), Bout varaktighet (Figur 6F), tid i anfall (Figur 6G), och antal anfall (Figur 6H), bedömdes automatiskt och utvinns ur PSC Totals med hjälp av Data viewer.
För att studera specificitet av det nya-inducerad hypofagi test, de uppgifter som beskrivs ovan från naiva och ostressade råttor jämfördes med dem som fick en intracerebroventricular injektion av kortikotropin-släppa faktor, som stimulerar hypotalamus-hypofys-adrenal stress axeln och framkallar stress och ångest11. De individuella uppgifterna för varje djur erhölls med hjälp av "Data viewer" och "PSC Totals", som beskrivs i protokollsektionen. De enskilda uppgifterna sattes sedan ihop enligt grupper i ett kalkylprogram och analyserades för statistiska skillnader. En signifikant skillnad i måltidsstorlek (p < 0,01) och boutstorlek (p < 0,01) upptäcktes mellan båda grupperna (Tabell 2). Skillnaden i anfallsstorlek skulle inte ha kunnat upptäckas med hjälp av manuell bedömning.
Bild 1: Uppläggning av sackaros preferenstest. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Uppställda av nymodigt-inducerad hypofagitest. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Träningsperiod för sackarospreferenstestet. Förbrukningen av sackaroslösning (A) och vatten (B) bedömdes under 24 h under 2 dagar. Sackarospreferensförhållandet (C) beräknades därefter. Data presenteras som medelvärde ± SEM från åtta råttor (*p < 0,05, ***p < 0,001). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Sackaros preferenstest. På testdagen, mikrostrukturen för vätskeintag (här, visas för sackaros intag) analyserades över 1 h för omfattade måltid storlek (A), måltid varaktighet (B), tid i måltider i s (C), tid i måltider i % (D), antal måltider (E), latens till första måltiden (F), inter-måltid intervall (G), drickshastighet (H), anfall varaktighet (I), skjutningen storlek (J), tid i bouts i s (K), och tid i anfall i % (L). Data presenteras som medelvärde ± SEM, n = 8 råttor. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Träningsperiod för det nyinducerade hypofagitestet. Måltidsstorlek (A), måltidslängd (B), tid som tillbringas i måltider i s (C), latens till första skjutningen (D), bout storlek (E), bout varaktighet (F), tid i bouts (G), och antal skjutningar (H) bedömdes under en period av 5 dagar. Data presenteras som medelvärde ± SEM, n = 8 råttor. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Nyinducerat hypofagitest. På testdagen analyserades födointaget mikrostruktur över 1 h för omfattade måltid storlek (A), måltid varaktighet (B), tid i måltider (C), latens till första skjutningen (D), skjutningen storlek (E), skjutningen varaktighet (F), tid i anfall (G) och antalet skjutningar (H). Data presenteras som medelvärde ± SEM, n = 8 råttor. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Parametern | Manuell bedömning | Automatiserad övervakning av intag |
| Träningsperiod (dag 1) | ||
| Sackaros intag (ml) | 63,46 ± 10,2 | 24,4 ± 3,48** |
| Vatten inakte (ml) | 12,07 ± 1,62 | 4,83 ± 0,89** |
| Sackaros preferensförhållande | 0,83 ± 0,03 | 0,8 ± 0,06 |
| Träningsperiod (dag 2) | ||
| Sackaros intag (ml) | 45,49 ± 5,75 | 33,77 ± 4,49 |
| Vatten inakte (ml) | 4,92 ± 0,80 | 0,42 ± 0,13*** |
| Sackaros preferensförhållande | 0,89 ± 0,02 | 0,99 ± 0,004** |
| Sackaros preferenstest | ||
| Sackaros intag (ml) | 10,15 ± 0,53 | 2,91 ± 0,66**** |
| Vatten inakte (ml) | 6,65 ± 0,68 | 0 *** |
| Sackaros preferensförhållande | 0,61 ± 0,04 | 0,99 ± 0,001*** |
Tabell 1: Sackaros preferenstest hos naiva råttor med hjälp av manuell bedömning kontra system för övervakning av automatiserat intag. Fördelningen av data fastställdes med hjälp av Kolmogorov-Smirnov testet. Data uttrycks som medelvärde ± SEM och skillnader analyserades med hjälp av t-tester eller Mann-Whitney U-testet beroende på distribution av data (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs. manuell bedömning).
| Parametern | Obetonade | Betonade |
| (n=8) | (n=11) | |
| Måltidsstorlek (g/300g bw) | 0,98 ± 0,29 | 0,35 ± 0,07** |
| Måltidens varaktighet (sek) | 998,29 ± 163,87 | 1209.11 ± 114,67 |
| Tid i måltider (sek) | 998,29 ± 163,87 | 989,27 ± 174,73 |
| Tid i måltider (%) | 55,46 ± 9,10 | 54,96 ± 9,71 |
| Latens till första skjutningen (sek) | 241,25 ± 45,96 | 185,50 ± 57,52 |
| Bout storlek (g) | 0,21 ± 0,03 | 0,08 ± 0,01** |
| Längd för skjutningar (sek) | 70,70 ± 14,12 | 45,59 ± 4,20 |
| Tid i bouts (sek) | 439,75 ± 125,94 | 208,73 ± 45,01 |
| Tid i bouts (%) | 24,43 ± 7,00 | 11,6 ± 2,50 |
| Skjutningar (antal) | 5,63 ± 0,67 | 4,64 ± 0,80 |
Tabell 2: Nyutlöst hypofagitest hos naiva icke stressade och stressade (CRF-injicerade) råttor. I stressgruppen injicerades icv- kanylerade råttor med 0,6 μg/5 μL CRF och utsattes för nyhet-inducerad hypofagi efteråt. Fördelningen av data fastställdes med hjälp av Kolmogorov-Smirnov testet. Skillnader analyserades med hjälp av t-tester eller Mann-Whitney U-testet beroende på distribution av data. För bättre jämförbarhet uttrycks alla data som medelvärde ± SEM (**p < 0,01 jämförtmed . ostressad).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den sackaros preferens och nyhet-inducerad hypofagi tester är två etablerade tekniker för att utvärdera anhedonia hos råttor. Deras kombination med det automatiserade övervakningssystemet för födointag möjliggör mer detaljerad analys hos ostörda råttor och minskar felaktiga mätningar.
Förekomsten av fel minskas med olika tillvägagångssätt. För att ta itu med felet som inträffar på grund av spill, gör gapet mellan matbehållaren och grinden att smulor som genereras under gnagande faller på den integrerade brickan. Genom att samla detta spill på burfästen ingår de i mätningen (eftersom spill fortfarande är på saldot påverkar det inte mätningen). För det andra, för att förhindra hamstring, råtta bur montera öppningen är tillräckligt stor för att djuret ska kunna äta från mat hopper med huvudet inuti öppningen, men tillräckligt liten för att begränsa djurets förmåga att använda sina händer medan du äter. Detta begränsar deras förmåga att ta bort mat och föra in den i buren.
För det tredje minskar systemet oavsiktlig förlust av vätska eftersom vätskeflaskan, efter priming, inte läcker, och avdunstning sker endast långsamt (cirka <10 mg/h) vid precisionen rostfria kula / sipper rör gränssnitt. Dessutom, eftersom systemet väger flaskorna automatiskt, hantering av flaskorna under inspelningen är inte nödvändigt, vilket är en vanlig orsak till fel. Skillnaderna i jämförelsen mellan manuella och automatiserade mätningar (tabell 1) misstänks bero på oavsiktlig förlust vid manuell hantering av flaskorna.
Användningen av det automatiserade övervakningssystemet för födointag ger flera fördelar, såsom detaljerad analys av fast och flytande födointag och bedömning av den underliggande födointagsmikrostrukturen10. Termen "mikrostruktur" beskriver mönstret för mat eller vätskeintag mer i detalj. I studier utan ett automatiserat system för övervakning av intag mäts intaget genom att man väger mat/vätska i början och slutet av en tidspunkt av intresse. Den enda information som vunnits genom detta tillvägagångssätt är den totala förbrukningen under en viss tidsperiod.
I motsats till detta ger det automatiserade övervakningssystemet mer information om förbrukningen under denna period, eftersom det registrerar viktförändringar för mikrobalanserna varje sekund. Inspelningarna kan detalj när gnagaren börjar äta, hur ofta den äter, hur länge den äter för, hur mycket den äter, hur länge pauserna mellan att äta är, etc. För att få fram data som liknar det automatiserade systemet med hjälp av manuell mätning, skulle användarna behöva mäta innehållet ofta under testning/utbildning och därigenom avsevärt störa djuren. Med det automatiserade systemet förblir gnagare ostörda under träningspassen och testningen.
Med tanke på det stora antalet automatiserade intagssystem som finns tillgängliga för gnagare är det viktigt att notera att ingen specificerad modell krävs för det protokoll som beskrivs här. Detta system är dock mycket känsligt. För att undvika fel på grund av omgivningsbuller (låg nivå vibrationer eller skakningar av massan på skalan), utvärderar systemets algoritm de värden som samlats in sekund för sekund, och den accepterar endast de som ligger under ett börvärde för "brus" för att i genomsnitt 10 värden. Om systemet överskrider detta bullertröskel används inte värdena för att beräkna stabila vikter, som används för att beräkna anfall av utfodring.
När det gäller utförandet av testerna bör flera kritiska punkter hållas i åtanke. Alla beteendetester bör utföras vid samma tidpunkt på dagen, eftersom dygnsrytm ändringar kan påverka beteendet hos djuren12,13. De flesta studier utför beteendetestning under ljusfasen, medan här utfördes alla tester under den mörka fasen. Gnagare är nattdjur och därför aktiva i den mörka fasen, medan de sover eller mindre aktiva12 med lägre undersökande aktivitet13 under ljusfasen. Således är beteendetest mer fysiologiskt appriopriate under den mörka fotoperioden.
Det är viktigt att notera att för sackaros preferenstestet har olika koncentrationer av sackaroslösningen använts, allt från 0,5%–10%4,7,14. De väljs främst beroende på art, stam, kön, och ålder, men särskilt baserat på observerat drickbeteende under träning (alla djur ska dricka ungefär samma mängd före behandling/intervention). Dock kan höga koncentrationer (t.ex. 10 %) kan åsidosätta anhedonia, eftersom även djur med depression-liknande beteende fortfarande dricker mycket söta vätskor4.
Dessutom kan högt kaloriinnehåll på grund av höga koncentrationer mer framträdande påverka preferensen för sackaroslösning. Därför valdes en 1% sackaros lösning för detta protokoll. Vissa studier rekommenderar användning av sackarin istället för sackaros15 för att undvika eventuell kalori inflytande. Den genomsnittliga kalorihalten i den förbrukade mängden av % sackaroslösning (2 g av 1%-sackaroslösning innehåller 0,08 kcal) är dock betydligt lägre än den för samma mängd standard chow (2 g innehåller 7,8 kcal). Således verkar denna punkt sekundär.
Det är också viktigt att notera att baslinjen sackaros preferensförhållandet bedömas här med hjälp av automatiserade födointag övervakningssystem är högre (0,99) jämfört med tidigare studier som använder en manuell bedömning (med 0,7 hos möss8, 0,8 i unga vuxna råttor, 0,6 i åldern manliga Spra Dawley råttor16). Detta kan bero på hantering av flaskorna, eftersom konventionella vägning sannolikt orsakar förlust av vätska under insättning i och ta bort från burarna. Detta styrks ytterligare av de resultat som visas i tabell 1. Därför kan användning av det automatiserade övervakningssystemet vara mer lämpade för att upptäcka anhedonia, medan ytterligare stimulering av hedoniska aspekter av födointag kan missas på grund av takeffekter.
När det gäller det nya-inducerad hypofagi test, Det är avgörande att låta råttor att utveckla en stabil baslinje för intag av välsmakande mellanmål innan du utför testet. Först när en stabil baslinje nås inom och mellan råttorna ska det faktiska testet utföras. Annars kan effekterna av interventionen (dvs. drogen, stressen etc.) missas, eller fluktuationer i utgångsvärdet kan misstolkas. Det är också viktigt att se till att den nya buren inducerar en nyhet stress som resulterar i hypofagi. Även om flera protokoll tyder på att användningen av en ny bur är tillräcklig av sig själv, observerade vi att burar som inte används tidigare men som innehåller sängkläder och anrikning kan misslyckas med att framkalla stress, eftersom råttor ofta används för att veckovis bur rengöring / ändra. Därför bör en tom, ny bur användas. Eftersom födointag före test även kan påverka resultaten, bör födointag övervakas före testet. Detta kan enkelt göras på ett automatiserat sätt.
I litteraturen används olika alternativa tester för att bedöma olika aspekter av depressionsliknande beteende (ofta förtvivlan istället för anhedonia); men de metoder som illustreras inom detta manuskript har flera fördelar. Ett alternativ som vanligen används metod för att bedöma beteendemässiga förtvivlan som en del av depression-liknande beteende är den påtvingade simma test4. Härmed utvärderas ingen livsmedelskonsumtion; således finns det ingen risk för att man mäter felaktighet.
Detta protokoll har flera andra nackdelar. En nyligen genomgång slutsatsen att den påtvingade simma testet är ett test som faktiskt mäter stress coping strategier och inte depression-liknande beteende17. Dessutom, om en crossover design är att föredra för att minska antalet djur enligt "tre R: s" av djurskydd, den påtvingade simma testet inte kan tillämpas, eftersom det kan utöva en långvarig (traumatiserande) effekt på beteendet hos testade djur18.
Däremot har SPT och NIH båda inga traumatiserande aspekter och kan upprepas. Också, att notera, den utbildningsfasen, för SPTEN och NIH upprättar en tillvänjning till förbrukningen; därför är upprepa protokollet möjligt. Efter testet avlägsnas den välsmakande maten (sackaroslösning eller mellanmål), och träning återinförs ungefär 24 h efter provning; således har gnagarna en paus utan tillgång till den tilltalande stimulansen. Det antas att efter pausen bör en ny träningsperiod med anpassning ske för att säkerställa ett preferensförhållande på omkring 1 eller att ett stabilt intag av mellanmål vid baslinjen uppnås innan testerna upprepas.
Ett test som liknar det påtvingade simtestet är svansfjädringstestet, en kortsiktig och ofrånkomlig stressperiod där djur suspenderas av svansen och utvecklar en orörlig hållning som tolkas som ett tecken på depressionsliknande beteende19. Detta test kan endast användas på möss, eftersom råttor inte bör suspenderas av sina svansar på grund av en högre genomsnittlig vikt20, medan SPT och NIH kan användas både på möss och råttor.
Ytterligare fördelar med de tester som presenteras i detta manuskript är att den nya-inducerad hypofagi test visar god konstruktion giltighet; därför mäter den upp till sina fordringar väl21,22. Följaktligen korrelerar mängden av det välsmakande ämnet med intensiteten hos anhedonia, styrkt genom överensstämmelse av SPT- och NIH-resultat med andra beteendetest12. Dessutom har både sackaros preferenstest och nyhet-inducerad hypofagi test bra ansikte giltighet. De betraktas subjektivt som att mäta vad som är avsett (här bedöms anhedonia som minskat intag av välsmakande ämnen)21,22.
Stora begränsningar av det automatiserade intag övervakningssystemet är kraven på korrekt utbildning och dagliga upprätthålla / rengöring av systemet, vilket gör det arbetskrävande än manuella protokoll. I tidigare experiment10, Det har observerats att även om unga råttor anpassa sig till det automatiserade systemet, äldre råttor ibland inte. Dessa djur bör naturligtvis uteslutas från experimentet.
Angående begränsningar av beteendetestet bör det nämnas att träning också är tidskrävande, särskilt NIH. Dessutom är protokollen både kortsiktiga, och långsiktig tillämpning kan leda till undernäring. Hittills rapporterar litteraturen inte användningen av dessa tester i tillstånd av svält (t.ex. en modell för anorexia nervosa, en ätstörning som vanligen förknippas med symtom på depression), så det finns ingen rekommendation deras användning för tillstånd av svält.
Med detta protokoll är det endast möjligt att upptäcka om det finns anhedonia (minskat intag av vätska/mellanmål). Det är dock inte i stånd att specifikt kvantifiera graden av anhedonia. I framtiden skulle införandet av flera flaskor med olika sackaroskoncentrationer kunna vara ett möjligt tillägg till att ytterligare kvantifiera anhedonia. Sammantaget kan användning av den automatiserade intagsövervakningen vara användbar i alla experiment där en korrekt upptäckt av intaget är nödvändigt, till exempel genom att övervaka det orala intaget av läkemedel som upplösts i dricksvattnet för läkemedelsstudier.
Sammanfattningsvis är sackaros preferenstest och nyhet-inducerad hypofagi test väletablerade protokoll för att bedöma anhedonia som en del av depression-liknande beteende hos gnagare. I kombination med det automatiserade systemet för övervakning av födointag kan även subtila skillnader upptäckas på ett tillförlitligt och repeterbart sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.S. är konsult för en & r Berlin, Boehringer-Ingelheim, Takeda och Schwabe. Inga intressekonflikter finns.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av finansiering av den tyska forskningsstiftelsen (STE 1765/3-2) och Charité University Funding (UFF 89/441-176, A.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Assembly LH Cage Mount - RAT-FOOD - includes Stainless cage mount, hopper, blocker, coupling | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCMPRF01 | |
| Assembly LH Cage Mount unplugged - RAT - FOOD includes stainless steel cage mount, hopper, blocker, unplugged adapter, coupling | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCMUPRF01 | |
| cage w/ 2 openings - RAT - costum modified cage - includes cage top and standard water bottle | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCR02 | single housing |
| Data collection Laptop Windows - Configured w/ BioDAQ Software | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BLT003 | |
| enrichment (plastic tubes, gnawing wood) | distributed by the animal facility | ||
| HoneyMaid Graham Cracker Crumbs | Nabisco, East Hanover, NJ, USA | ASIN: B01COWTA98 | palatable snack for NIH test |
| low vibration polymer rack | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BRACKR | |
| male Sprague Dawley rats | Envigo | Order Code: 002 | |
| Model #2210 32x Port BioDAQ Central Controller - includes cables, and calibration kit | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCC32_03 | |
| Peripheral sensor Controller - includes cable | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BPSC01 | |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | statistical analysis | |
| Stainless steel blocker | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BBLKR | |
| standard rodent diet with 10 kcal% fat | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | D12450B | |
| sucrose powder | Roth | 4621.1 | for SPT |
References
- World Health Organization. Depression. , Available from: https://www.who.int/health-topics/depression (2018).
- Reddy, M. S.
- Cryan, J. F., Mombereau, C. In search of a depressed mouse: utility of models for studying depression-related behavior in genetically modified mice. Molecular Psychiatry. 9 (4), 326-357 (2004).
- Overstreet, D. H.
- Moreau, J. -L. Simulating the anhedonia symptom of depression in animals. Dialogues in Clinical Neuroscience. 4 (4), 351-360 (2002).
- Scheggi, S., De Montis, M. G., Gambarana, C. Making Sense of Rodent Models of Anhedonia. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 21 (11), 1049-1065 (2018).
- Liu, M. Y., et al. Sucrose preference test for measurement of stress-induced anhedonia in mice. Nature Protocol. 13 (7), 1686-1698 (2018).
- Serchov, T., van Calker, D., Biber, K. Sucrose Preference Test to Measure Anhedonic Behaviour in Mice. Bio-Protocol. 6 (19), 1958 (2016).
- Dulawa, S. C., Hen, R. Recent advances in animal models of chronic antidepressant effects: the novelty-induced hypophagia test. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 771-783 (2005).
- Teuffel, P., et al. Treatment with the ghrelin-O-acyltransferase (GOAT) inhibitor GO-CoA-Tat reduces food intake by reducing meal frequency in rats. Journal of Physiology and Pharmacology. 66 (4), 493-503 (2015).
- Binder, E. B., Nemeroff, C. B. The CRF system, stress, depression and anxiety-insights from human genetic studies. Molecular Psychiatry. 15 (6), 574-588 (2010).
- Marques, M. D., Waterhouse, J. M. Masking and the evolution of circadian rhythmicity. Chronobiology International. 11 (3), 146-155 (1994).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Locomotor response to an open field during C57BL/6J active and inactive phases: differences dependent on conditions of illumination. Physiology and Behavior. 69 (3), 269-275 (2000).
- Madiha, S., Haider, S. Curcumin restores rotenone induced depressive-like symptoms in animal model of neurotoxicity: assessment by social interaction test and sucrose preference test. Metabolic Brain Disorder. 34 (1), 297-308 (2019).
- Strouthes, A.
- Inui-Yamamoto, C., et al. Taste preference changes throughout different life stages in male rats. PloS One. 12 (7), 0181650 (2017).
- Commons, K. G., Cholanians, A. B., Babb, J. A., Ehlinger, D. G. The Rodent Forced Swim Test Measures Stress-Coping Strategy, Not Depression-like Behavior. ACS Chemical Neuroscience. 8 (5), 955-960 (2017).
- Slattery, D. A., Cryan, J. F. Using the rat forced swim test to assess antidepressant-like activity in rodents. Nature Protocols. 7 (6), 1009-1014 (2012).
- Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Review. 29 (4-5), 571-625 (2005).
- Can, A., et al.
- Chadman, K. K., Yang, M., Crawley, J. N. Criteria for validating mouse models of psychiatric diseases. American Journal of Medical Genetics B Neuropsychiatric Genetics. 150 (1), 1-11 (2009).
- Powell, T. R., Fernandes, C., Schalkwyk, L. C.
