Summary
Здесь представлен протокол для изучения депрессии, как и ангедоническое поведение у крыс. Он сочетает в себе два устоявшихся поведенческих методов, предпочтения сахарозы и новизны индуцированных гипофагии испытаний, с автоматизированной системой мониторинга потребления пищи и жидкости, чтобы косвенно исследовать поведение грызунов с использованием суррогатных параметров.
Abstract
Распространенность и частота депрессивных расстройств растет во всем мире, затрагивая около 322 миллионов человек, что является основой для поведенческих исследований в животных моделях. В этом протоколе, для изучения депрессии, как и ангедоническое поведение у крыс, установленные предпочтения сахарозы и новизны индуцированных гипофагии тесты в сочетании с автоматизированной системой мониторинга потребления пищи и жидкости. До тестирования, в парадигме предпочтения сахарозы, крысы мужского пола обучаются, по крайней мере 2 дней, чтобы потреблять раствор сахарозы в дополнение к водопроводной воде. Во время теста крысы снова подвергаются воздействию воды и раствора сахарозы. Потребление регистрируется каждую секунду автоматизированной системой. Соотношение сахарозы к общему водозабору (коэффициент предпочтения сахарозы) является суррогатным параметром для анхедонии. В новизне индуцированной гипофагии тест, мужчины крысы проходят период обучения, в котором они подвергаются воздействию вкусной закуски. Во время тренировки грызуны показывают стабильный базовый прием закусок. В день испытаний животных переводят из домашних клеток в свежую, пустую клетку, представляющую собой новую неизвестную среду с доступом к известной приятной закуске. Автоматизированная система фиксирует общее потребление и лежащую в его основе микроструктуру (например, задержку приближения к закуске), обеспечивая понимание ангедонического и тревожного поведения. Сочетание этих парадигм с автоматизированной системой измерения предоставляет более подробную информацию, наряду с более высокой точностью за счет уменьшения ошибок измерения. Тем не менее, тесты используют суррогатные параметры и изображают только депрессию и анхедонию косвенным образом.
Introduction
В среднем 4,4% населения мира страдает от депрессии. На их долю приходится 322 миллиона человек во всем мире, что на 18% больше, чем десять летназад. По оценкам Всемирной организации здравоохранения, депрессия будет второй в рейтинге инвалидов скорректированной жизни лет в 2020году 2. Для решения проблемы растущей распространенности аффективных расстройств и разработки новых интервенционных стратегий необходимо продолжить изучение такого поведения. До и в дополнение к изучению на людях, исследования на животных необходимы.
Несколько моделей были созданы для изучения компонентов депрессивного поведения (т.е. принудительного плавания тест, хвост подвески тест, тест предпочтения сахарозы, и новизна индуцированной гипофагии)3,4. Тест предпочтений сахарозы (SPT) и гипофагия, вызванная новизной (NIH), могут обнаруживать депрессию у животных. Эти тесты сами по себе не вызывают состояние депрессии у грызунов, но изображают острые изменения в поведении. Оба SPT и NIH оценить характерную черту депрессии, известной как anhedonia, которая является потеря интереса к следующему: награждение деятельности, деятельности, которыекогда-то пользовались отдельные 5, и один аспект сложного явления обработки и реагирования навознаграждение 6. Оба теста изучают реакцию на полезный стимул в виде вкусной пищи. Степень потребления служит суррогатным параметром для анхедонии7,,8,,9.
Значение тестов, исследуя ангедонию, сильно зависит от точного определения потребления в результате точного измерения веса вещества. Условно, это измерение проводится вручную один раз до и один раз после испытания. Однако это подвержено ошибочным измерениям по нескольким причинам. Во-первых, грызуны, как правило, копить пищу, а это означает, что они удаляют пищу, не потребляя его сразу же, то скрыть его в безопасном месте. Таким образом, эта потеря продовольствия может быть включена в расчет общего потребления. Во-вторых, крысы разлива пищи и воды, в результате чего потеря веса без соответствующего потребления. В-третьих, непреднамеренная потеря жидкости происходит из-за обработки бутылок путем вставки и удаления их из клеток.
В подходе к сокращению этих источников ошибок, мы объединили два общих теста оценки anhedonia (SPT3,4 и NIH 9 ) сизмерением потребленияпищи и воды с использованием автоматизированной системы мониторинга потребления пищи и жидкости. Эта процедура позволяет точное исследование потребления приятных веществ, а также предоставляет информацию об опыте удовольствия у крыс, как особенность депрессии, как поведение. Вышеупомянутые ошибки, связанные с ручным измерением, сокращаются с помощью различных подходов, которые иллюстрируются позже более подробно.
Для предоставления информации о микроструктуре автоматизированная система мониторинга потребления, используемаяв этом протоколе 10, взвешивает пищу (±0,01 г) каждую секунду. Таким образом, стабильный вес задокументирован как «не есть», а нестабильный вес – как «еда». "Бой" определяется как изменение стабильного веса до и после события. Еда состоит из одного или нескольких приступов, и ее минимальный размер у крыс был определен как 0,01 г. Еда отделяется от другого приема пищи у крыс на 15 минут (стандартизированное значение). Таким образом, потребление пищи считается одним приемом пищи, когда приступы произошли в течение 15 минут, а изменение веса равно или больше, чем 0,01 г. Параметры питания, оцениваемые в этом протоколе, включают продолжительность приема пищи, время, проведенное в еде, размер боя, продолжительность боя, время, проведенное в боях, задержку до первого боя, и количество поединков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за животными и экспериментальные процедуры следовали конкретным руководящим принципам институциональной этики и были одобрены государственным органом по исследованиям на животных.
1. Работа автоматизированной системы мониторинга
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе автоматизированной системы мониторинга крайне важно задокументировать каждое действие в поле комментариев, включенном в программное обеспечение непосредственно перед действием. Описание должно быть наколено в поле комментариев, и, нажав Сохранить, он сохраняется с определенной точки времени. Сроки являются значительными при анализе данных, так как система записывает непрерывно, и период интереса должен быть указан для анализа.
- Установка, использование и обслуживание автоматизированной системы мониторинга
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются взрослые самцы крыс Sprague Dawley весом 250–300 г (10 недель). Рекомендуется разготовить крыс группами в период акклиматизации. Экологические условия должны контролироваться следующими параметрами: 12 ч/12 ч темного/светлого цикла с включенным светом в 6:00 А.M., влажность 45%-65%, температура 21-23 градуса по Цельсию, а также доступ к воде и стандартной диете грызунов. Ежедневная обработка позволяет животным привыкнуть к следователям.- Разделить крыс так, что каждое животное имеет индивидуальную клетку. Убедитесь, что каждая крыса остается отдельной во время протокола.
- Заполните жилые клетки обычными постельными принадлежностями слоем толщиной 1-2 см. Это (уменьшенное) количество уменьшает вероятность загрязнения микробалансов и бункеров с разливом, тем самым уменьшая ошибки измерения. Добавьте пластиковые трубки (например, 20-сантиметровый кусок пластиковой водосточной трубы диаметром 8 см) и грызут древесину в качестве обогащения, опуская бумажные ткани, чтобы уменьшить ошибки в измерении.
- Подготовьте клетки для автоматизированного измерения потребления твердой и жидкой пищи, прикрепив две закрытые крепления клетки с микробалансами к изготовленным на заказ отверстиям в передней части клеток. Поместите два пустых бункера на крепления клетки, один для чау и один для бутылки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микробалансы соединены кабелями к системе записи, прикрепленной к компьютеру, и соответствующее программное обеспечение устанавливается на компьютере. - Чтобы начать запись, откройте«Монитор»и нажмите«Старт»,а затем выберите место для сохранения данных.
- Используя функцию калибровки(нажмите« Calibrate ») автоматизированной системы мониторинга потребления, откалибровать каждый баланс, удалив бункеры и поместив два различных взвешенных веса на крепления клетки с балансами. Делайте это через регулярные промежутки времени (еженедельнорекомендуется).
- Заполните один бункер полностью чау (100 г) и удалить чау штук и крошится, которые слишком малы по размеру. Заполните воду в бутылку (100 мл) и поместите ее в другой бункер.
- Документировать положение пищи и воды (например, баланс 1: пищевое животное 1, баланс 2: водное животное 1).
- Поместите крысу в клетку и откройте все ворота клетки монтирует так, что она может есть и пить объявление libitum.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для точного измерения необходимо ежедневно поддерживать балансы и бункеры, мягко очищая щеткой от разлива и удаляя мелкие пищевые крошки из пищевого контейнера. Это значительно уменьшит ошибочное измерение. Закройте все ворота во время ежедневного обслуживания.
- Доступ к данным после экспериментов
- Поиск в поле комментариев для начала и конечных точек времени периода (например, обучение, тест), который должен быть проанализирован.
- Нажмите накнопку "Посмотретьданные" на программное обеспечение, чтобы открыть Data Viewer.
- Вставьте точки времени в ящики ниже "Время начала" и "Конец времени". Нажмите на квадрат в левом верхнем углу с указанием баланса, который зафиксировал информацию.
- Нажмите на"PSC Totals",чтобы получить доступ к данным микроструктуры. Нажмите кнопку"Экспорт PSC Таблица"для экспорта данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения микроструктуры отдельных животных (например, без стресса против подчеркнул) с помощью автоматизированного мониторинга, отдельные животные могут быть выбраны в"Data viewer", нажав соответствующий квадрат в левом верхнем углу. PSC Totals показывает только микроструктуру для выбранного животного. Статистический анализ не может быть выполнен с системой. Данные должны быть извлечены в электронную таблицу программы / анализа программного обеспечения.
2. Осуществление теста предпочтений сахарозы
- Проведение учебного периода
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед испытанием, животные должны быть привыкли к наличию двух бутылок для жидкостей на бункерах через ворота, в то время как пища должна быть предоставлена из верхней части клеток (настройка показана на рисунке 1). Этот тренировочный период должен длиться не менее 2 дней. Он выполняется в домашних клетках в комнате, где животные проводятся.- Закройте все ворота. Удалите бутылку с водой и контейнер для пищевых продуктов из микробалансов.
- Поместите предварительно взвешенную пищу (50 г) на верхнюю часть клетки и документировать ее вес ежедневно, используя регулярный баланс для оценки ежедневного потребления пищи. При необходимости пополнить запасы.
- Очистите бутылку чистой водой и пополнить около 100 мл воды. Поместите его обратно в бункер.
- Заполните вторую чистую бутылку 100 мл свежеприготовленного раствора сахарозы. Поместите его на бункер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отметьте бутылки тщательно и документировать их местоположение (например, баланс 1: водное животное 1, баланс 2: сахарозный раствор животного 1). - Откройте все ворота. Документировать начало обучения в системе мониторинга. Оставьте ворота открытыми на 24 ч, что приведет к доступу к обеим бутылкам. После 24 ч закройте ворота и заветмите окончание тренировки. Данные из интервала 24 ч можно оценить с помощью автоматизированной системымониторинга,вставив "время начала" и"время окончания". Процедуры одинаковы при оценке интервала теста 1 ч.
- Очищать и пополнять бутылки каждые 24 ч. Приготовьте свежий 1% раствор сахарозы ежедневно. Переключитесь на положение бутылки раствора сахарозы ежедневно, чтобы избежать последствий привыкания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение обучения у всех животных, по крайней мере 48 ч, пока предпочтения отношения достигают No 1. Коэффициент предпочтений сахарозы оценивается непосредственно после обучения с использованием"Data viewer". Он рассчитывается как отношение потребления сахарозы к общему потребление (вода плюс потребление сахарозы). - 24 ч до теста, удалить бутылку с раствором сахарозы, чтобы крыса имеет доступ к стандартной чау и воды только.
- Приготовьте одну свежую бутылку, наполненную водопроводной водой, и одну, наполненную раствором сахарозы 1%, как с 100 мл.
- Перед тестированием закройте все ворота.
- Удалите бутылку, наполненную водопроводной водой, из бункера и поместите две свежие бутылки, одна заполнена водопроводной водой, а другая заполнена раствором сахарозы 1% на бункере.
- Откройте все ворота, заветмите начало теста в системе мониторинга. Оставьте ворота открытыми на 60 минут. Закройте ворота через 60 минут и заветмите конец теста.
- Оцените данные (например, соотношение потребления сахарозы/общей жидкости).
ПРИМЕЧАНИЕ: Тест может быть повторен несколько раз с интервалами обучения (не менее 2 дней) между ними.
3. Осуществление теста гипофагии, вызванного новизной
- Проведение учебного периода
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед тестированием рекомендуется ежедневный 30-минутный тренировочный период в 5 дней (настройка показана на рисунке 2). Цель состоит в том, чтобы достичь стабильного базового уровня приемлемого потребления закусок перед экспериментом. Он выполняется в домашних клетках в комнате, где животные проводятся.- Закройте все ворота и удалите бункер стандартным чау.
- Заполните свежий бункер вкусной закуской (50 г). Вставьте крекеры тщательно в бункер, чтобы предотвратить рушится. Поместите бункер на клетку горе на верхней части микробаланса.
- Откройте ворота на 30 минут, чтобы крыса имеет доступ к закуске и воде. Документ начала обучения в системе мониторинга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крыса не должна иметь доступа к стандартной чау во время тренировочного периода. - Закройте ворота через 30 минут и заветмите окончание обучения в системе мониторинга. Замените закуску стандартным чау.
- Повторяйте это ежедневно до тех пор, пока не будет достигнута стабильная базовая приемлемая доза (например, 1,5–2,0 г/30 мин.) и 2) потребление не будет статистически отличаться между учебными днями.
- Выполнение теста гипофагии, вызванного новизной
- Приготовьте пустую, свежеочищенной клетку без постельных принадлежностей или обогащения, прикрепленную к автоматизированной системе мониторинга потребления пищи. Поместите бункер с бутылкой водопроводной воды и бункера с приятной закуской на крепления клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Роман клетка должна быть помещена в той же комнате, где крысы проводятся и обучение проводится. Держите ворота закрытыми. - Удалите крысу из домашней клетки и поместите в новую клетку.
- Откройте все ворота на 30 мин. Документировать начало тестирования в системе мониторинга.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение 30 минут доступа к закуске, размер приема закусок и основные параметры микроструктуры (например, задержка с первым приемом пищи) регистрируются с помощью автоматизированной системы мониторинга приема пищи. - Закройте ворота через 30 минут и заветмите окончание тестирования. Поместите крысу обратно в домашнюю клетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тест может быть повторен несколько раз с интервалами обучения (не менее 5 дней) между ними.
- Приготовьте пустую, свежеочищенной клетку без постельных принадлежностей или обогащения, прикрепленную к автоматизированной системе мониторинга потребления пищи. Поместите бункер с бутылкой водопроводной воды и бункера с приятной закуской на крепления клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для проверки распределения данных использовался тест Колмогорова-Смирнова. T-тесты использовались при обычном распределении данных и использовании теста Манн-Уитни-У, если нет. Для обычно распределенного многократного многократного группового сравнения использовалась однократная ANOVA с последующим пост-специальным тестом Tukey. В случаях ненормального распределения использовалась одноразовая ANOVA, за которой последовал многократный сравнительный тест Данна. Различия между группами считались значительными, когда p lt; 0.05.
SPT был выполнен на наивных крыс в этом исследовании. Потребление раствора сахарозы увеличилось, а потребление воды уменьшилось за период обучения(рисунок 3). В первый день тренировки крысы выпили 24,40 мл ± 3,48 мл раствора сахарозы(рисунок 3А)и 4,83 мл ± 0,89 мл обычной воды(рисунок 3B),что дает соотношение предпочтений сахарозы 0,80 ± 0,06(рисунок 3C). На второй день тренировки крысы увеличили потребление раствора сахарозы до 33,77 мл ± 4,49 мл (не значительный, р - 0,17 против1-го дня) и снижение водозабора до 0,42 мл ± 0,13 мл(р/л; 0,001 vsпротив . день 1), в результате чего соотношение 0,99 ± 0,004 (стр. 0,05 против. Рисунок 3C). Восемь крыс были изучены здесь; таким образом, каждая точка данных получена из восьми животных. Потребление жидкости, включая ее микроструктуру, было записано автоматически. Данные были извлечены из PSC Totals с помощью просмотра данных.
В ходе 60-минутного тестирования животные потребляли от 0 до 6,18 мл раствора сахарозы со средним значением 2,91 мл ± 0,66 (n No8) без потребления воды, что привело к соотношению предпочтений сахарозы 0,99 ± 0,00. Из анализа были исключены животные, которые не потреблял никакой жидкости во время теста. Было изучено восемь крыс. Потребление жидкости было записано автоматически.
Автоматизированная система мониторинга потребления предоставила данные о микроструктуре потребления сахарозы, автоматически оцениваемой во время тестирования, которые были извлечены из PSC Totals с помощью просмотра данных. Эти параметры были размер еды (Рисунок 4A), продолжительность еды (Рисунок 4B), время, проведенное в еде в секундах (Рисунок 4C) и проценты (Рисунок 4D), частота приема пищи (Рисунок 4E), задержка к первому приему пищи (Рисунок 4F), меж-еда интервал (Рисунок 4G), скорость питья (Рисунок 4H), продолжительность боя (Рисунок 4I), размер боя (Рисунок 4J), и время, проведенное в боях в секундах(рисунок 4K) и проценты (Рисунок 4L).
Для дальнейшего изучения преимуществ автоматизированной системы мониторинга потребления данные, иллюстрированные выше, были сопоставлены с данными, полученными с использованием обычных ручных оценок (взвешивание бутылок вручную до и после периода обучения/испытания, таблица 1). В первый день обучения сахароза(p lt; 0.01) и водозабор(p lt; 0.01) были значительно выше при оценке вручную по сравнению с автоматически. На второй день обучения, водозабор(p lt; 0.001) и коэффициент предпочтения сахарозы(p lt; 0.01) отличались между двумя группами и во время тестирования. Все параметры, а именно потребление сахарозы(p lt; 0.001), водозабор(p lt; 0.001) и коэффициент предпочтения сахарозы(p lt; 0.001) были разными между группами, возможно, из-за ошибочно высокого измерения или разлива при оценке вручную.
Общее потребление вкусной закуски во время тренировки неуклонно увеличивалось: 0,48 г ± 0,14 г (день 1), 1,05 г ± 0,32 г (день 2), 1,48 г ± 0 56 г (день 3), 1,1 г ± 0,39 г (день 4) и 1,91 г ± 0,68 г (день 5), что свидетельствует об адаптации в течение первых 2-3 дней. Аналогичным образом, размер еды тенденция к увеличению между учебнымиднями (рисунок 5A, р 0,12), в то время какпродолжительность еды ( Рисунок 5B) не (стр. 0,05). Аналогичным образом, другие микроструктурные параметры, такие как время, проведенное в еде (Рисунок 5C), задержка до первого боя (Рисунок 5D), размер боя (Рисунок 5E), продолжительность боя (Рисунок 5F), время, проведенное в боях (Рисунок 5G), и количество поединков (Рисунок 5H) не были существенно отличаются между этими днями (стр. Восемь крыс были изучены; таким образом, каждая точка данных получена из восьми животных. Прием закусок, включая микроструктуру, был записан автоматически. Данные были извлечены из PSC Totals с помощью просмотра данных.
В тестовый день наивные крысы, подвергшиеся воздействию закуски в новой среде, показали потребление вкусной закуски 0,98 г ± 0,34 г(рисунок 6А). Параметры микроструктуры приема пищи в день тестирования, включая продолжительностьприема пищи (рисунок 6B), время, проведенное веде (рисунок 6C), задержка до первого боя (Рисунок 6D), размер боя (Рисунок 6E), продолжительность боя (Рисунок 6F), время, проведенное в боях (Рисунок 6G), и количество поединков (Рисунок 6H), были оценены автоматически и извлечены из PSC Итоги с помощью data viewer.
Для изучения специфики новизны индуцированной гипофагии тест, данные, описанные выше от наивных и неподстрессовых крыс были по сравнению с теми, которые получили intracerebroventricular инъекции кортикотропина-выпуская фактор, который стимулирует гипоталамус-гипофиза надпочечников стресс оси и вызывает стресс и беспокойство11. Индивидуальные данные для каждого животного были получены спомощью «Просмотраданных» и«PSC Totals»,как описано в разделе протокола. Индивидуальные данные затем собирались в соответствии с группами в программе электронных таблиц и анализировались на статистические различия. Значительная разница в размере еды(p lt; 0.01) и размере боя(p lt; 0.01) была обнаружена между обеими группами(таблица 2). Разница в размере боя не была бы обнаружена с помощью ручной оценки.
Рисунок 1: Настройка теста предпочтений сахарозы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Настройка новизны индуцированной гипофагии тест. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Учебный период для теста предпочтений сахарозы. Потребление раствора сахарозы(A) иводы(B) оценивалось более 24 ч в течение 2 дней. Коэффициент предпочтений сахарозы(C)был рассчитан соответствующим образом. Данные представлены как среднее ± SEM от восьми крыс(р-л; 0,05, p lt; 0,001).p Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Тест предпочтений сахарозы. В день тестирования микроструктура приема жидкости (здесь, показано для потребления сахарозы) был проанализирован в течение 1 ч для всеобъемлющего размераеды( A ), продолжительность еды (B), время, проведенное в еде в s (C), время, проведенное в едев %( D ), количество блюд (E), задержка с первым приемом пищи (F), межразмитный интервал ( G ), скорость питья (H), продолжительность боя (I), размер боя (J), время, проведенное в бояхвs.H Данные представлены как среднее ± SEM, n No 8 крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Учебный период для новизны индуцированной гипофагии тест. Размер еды (A), продолжительность еды (B), время, проведенное в еде в s (C), задержка до первого боя (D), размер боя (E), продолжительность боя (F), время, проведенное вбоях( G ), и количество поединков (H) были оценены в течение 5 дней. Данные представлены как среднее ± SEM, n No 8 крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Новизна индуцированной гипофагии тест. В день тестирования, микроструктура приема пищи была проанализирована более 1 ч для охвата размер еды (A), продолжительность еды (B), время, проведенное в еде (C), задержка до первого боя (D), размер боя (E), продолжительность боя (F), время, проведенное в боях (G) и количество поединков (H). Данные представлены как среднее ± SEM, n No 8 крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Параметр | Ручная оценка | Автоматизированный мониторинг потребления |
| Тренировочный период (день 1) | ||
| Потребление сахарозы (мл) | 63,46 ± 10,2 | 24,4 ± 3,48 евро |
| Водяной инакте (мл) | 12,07 ± 1,62 | 4,83 ± 0,89 евро |
| Коэффициент предпочтений сахарозы | 0,83 ± 0,03 | 0,8 ± 0,06 |
| Тренировочный период (день 2) | ||
| Потребление сахарозы (мл) | 45,49 ± 5,75 | 33,77 ± 4,49 |
| Водяной инакте (мл) | 4.92 ± 0,80 | 0,42 ± 0,13 |
| Коэффициент предпочтений сахарозы | 0,89 ± 0,02 | 0,99 ± 0,004 " |
| Тест предпочтений сахарозы | ||
| Потребление сахарозы (мл) | 10.15 ± 0,53 | 2,91 ± 0,66 |
| Водяной инакте (мл) | 6,65 ± 0,68 | 0 *** |
| Коэффициент предпочтений сахарозы | 0,61 ± 0,04 | 0,99 ± 0,001 |
Таблица 1: Тест предпочтений сахарозы у наивных крыс с использованием ручной оценки по сравнению с автоматизированной системой мониторинга потребления.. Распределение данных было определено с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Данные выражаются как среднее значение ± SEM, и различия были проанализированы с помощью t-тестов или теста Манн-Уитни U в зависимости от распределения данных(p'lt; 0.05,p'lt; 0.01, plt; 0.001 vs. ручная оценка).
| Параметр | без стресса | Подчеркнул |
| (n-8) | (n-11) | |
| Размер еды (g/300g bw) | 0,98 ± 0,29 | 0,35 ± 0,07 евро |
| Продолжительность еды (sec) | 998,29 ± 163,87 | 1209.11 ± 114.67 |
| Время, проведенное в еде (sec) | 998,29 ± 163,87 | 989,27 ± 174,73 |
| Время, проведенное в еде (%) | 55.46± 9.10 | 54,96 ± 9,71 |
| Задержка до первого боя (sec) | 241.25 ± 45.96 | 185.50 ± 57.52 |
| Размер бута (г) | 0,21 ± 0,03 | 0,08 ± 0,01 евро |
| Длительность бута (sec) | 70.70 ± 14.12 | 45.59 ± 4.20 |
| Время, проведенное в боях (sec) | 439,75 ± 125,94 | 208.73 ± 45.01 |
| Время, проведенное в боях (%) | 24.43 ± 7.00 | 11.6 ± 2.50 |
| Буты (число) | 5,63 ± 0,67 | 4,64 ± 0,80 |
Таблица 2: Новизна индуцированной гипофагии тест на наивных неподкрепляется и подчеркнул (CRF-инъекций) крыс. В группе стресса, icv-cannulated крысы были введены с 0,6 мкг / 5 йл CRF и подвергаются новизне индуцированной гипофагии потом. Распределение данных было определено с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Различия были проанализированы с помощью t-тестов или теста Манн-Уитни U в зависимости от распределения данных. Для лучшей сопоставимости, все данные выражаются как среднее ± SEM(p lt; 0.01 против. unstressed).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предпочтение сахарозы и новизна индуцированных гипофагии тесты два установленных методов для оценки ангедонии у крыс. Их сочетание с автоматизированной системой мониторинга потребления пищи позволяет более детальный анализ в спокойно крыс и уменьшает ошибочные измерения.
Частота ошибок уменьшается с помощью различных подходов. Во-первых, для устранения ошибки, возникают из-за разлива, разрыв между пищевой бункер и ворота позволяет крошки, генерируемые во время грызть упасть на интегрированный лоток. Собирая этот разлив на крепления клетки, они включаются в измерение (так как разлив все еще находится на балансе, это не влияет на измерение). Во-вторых, чтобы предотвратить накопление, крысиная клетка горе открытия достаточно велика, чтобы позволить животному есть из пищевого бункера с головой внутри отверстия, но достаточно мал, чтобы ограничить способность животного использовать свои руки во время еды. Это ограничивает их способность удалять пищу и приносить ее в клетку.
В-третьих, система уменьшает непреднамеренную потерю жидкости, потому что жидкая бутылка, после грунтовки, не протекает, и испарение происходит только медленно (примерно 10 мг/ч) при точности интерфейса трубки из нержавеющей стали. Кроме того, поскольку система взвешивает бутылки автоматически, обработка бутылок во время записи не является необходимым, что является распространенной причиной ошибок. Различия, замеченные в сравнении между ручными и автоматизированными измерениями(таблица 1), как подозреваются, обусловлены непреднамеренной потерей при ручном обращении с бутылками.
Использование автоматизированной системы мониторинга приема пищи обеспечивает ряд преимуществ, таких как подробный анализ потребления твердой и жидкой пищи и оценка микроструктуры потребления пищи10. Термин "микроструктура" описывает структуру потребления пищи или жидкости более подробно. В исследованиях без автоматизированной системы мониторинга потребления, потребление измеряется путем взвешивания пищи / жидкости в начале и в конце времени интересно. Единственной информацией, полученной в результате такого подхода, является общее потребление в течение определенного периода времени.
Автоматизированная система мониторинга, напротив, предоставляет больше информации о потреблении в этот период, поскольку каждую секунду фиксирует изменения веса микробалансов. Записи могут подробно, когда грызун начинает есть, как часто он ест, как долго он ест, сколько он ест, как долго перерывы между едой и т.д. Для получения данных, аналогичных автоматизированной системе с использованием ручных измерений, пользователи должны будут часто измерять содержание во время тестирования/обучения и тем самым значительно беспокоить животных. С автоматизированной системой, грызуны остаются нетронутыми во время тренировок и испытаний.
Учитывая большое количество автоматизированных систем потребления, доступных для грызунов, важно отметить, что для протокола, описанного здесь, не требуется никакой конкретной модели. Тем не менее, эта система очень чувствительна. Чтобы избежать ошибок из-за шума окружающей среды (низкая вибрация уровня или встряхивание массы на шкале), алгоритм системы оценивает значения, собранные на второй за второй основе, и принимает только те, которые находятся ниже установленной точки для "шума", чтобы в среднем 10 значений. Если система превышает этот порог шума, значения не используются для расчета стабильных весов, которые используются для расчета приступов кормления.
Что касается выполнения тестов, то следует иметь в виду несколько критических моментов. Все поведенческие тесты должны проводиться в одно и то же время суток, так как циркадные изменения могут повлиятьна поведение животных 12,,13. Большинство исследований выполняют поведенческие испытания во время фазы света, в то время как здесь, все тесты были выполнены во время темной фазы. Грызуны являются ночными животными и поэтому активны в темной фазе, в то время как ониспят или менее активны 12 с более низкой исследовательскойактивностью 13 во время световой фазы. Таким образом, поведенческое тестирование более физиологически присваивает в темный период фото.
Важно отметить, что для теста предпочтений сахарозы, различные концентрации раствора сахарозы были использованы, начиная от 0,5%-10%4,7,14. Они в основном выбираются в зависимости от вида, деформации, пола и возраста, но особенно на основе наблюдаемого поведения питьевой во время тренировки (все животные должны пить примерно одинаковое количество до лечения / вмешательства). Однако высокие концентрации (например, 10%) может переопределить anhedonia, так как даже животные с депрессией, как поведение по-прежнему пить очень сладкиежидкости 4.
Кроме того, высокое содержание калорий из-за высоких концентраций может более заметно повлиять на предпочтение раствора сахарозы. Таким образом, для этого протокола было выбрано решение для 1% сахарозы. Некоторые исследования рекомендуют использовать сахарин вместо сахарозы15, чтобы избежать какого-либо калорийного воздействия. Однако среднее калорийность потребляемого количества раствора сахарозы (2 г раствора сахарозы 1% содержит 0,08 ккал) значительно ниже, чем у того же количества стандартного чау (2 г содержит 7,8 ккал). Таким образом, этот момент кажется второстепенным.
Важно также отметить, что базовое соотношение предпочтений сахарозы оценивается здесь с помощью автоматизированной системы мониторинга потребления пищи выше (0,99) по сравнению с предыдущими исследованиями с использованием ручной оценки (с 0,7у мышей 8, 0,8 у молодых взрослых крыс, 0,6 в возрасте мужчин Sprague Доуликрыс 16). Это может быть связано с обработкой бутылок, так как обычное взвешивание, вероятно, приводит к потере жидкости во время вставки и удаления из клеток. Это подтверждается результатами, показанным в таблице 1. Таким образом, использование автоматизированной системы мониторинга может быть более подходящим для обнаружения ангедонии, в то время как дальнейшая стимуляция гедонических аспектов приема пищи может быть пропущена из-за потолочного эффекта.
Что касается новизны индуцированной гипофагии тест, очень важно, чтобы крысы разработать стабильный базовый уровень для потребления вкусной закуски перед выполнением теста. Только тогда, когда стабильный базовый достигнут внутри и между крысами должны быть выполнены фактические испытания. В противном случае последствия вмешательства (т.е. наркотиков, стресса и т.д.) могут быть пропущены, или колебания базового уровня могут быть неправильно истолкованы. Важно также, чтобы убедиться, что новая клетка вызывает новизну стресса в результате гипофагии. Хотя несколько протоколов предполагают, что использование новой клетки является достаточным само по себе, мы заметили, что клетки, не используемые ранее, но содержащие постельные принадлежности и обогащение может не вызвать стресс, так как крысы часто используются для еженедельной очистки клетки / изменения. Поэтому следует использовать пустую, новую клетку. Поскольку предварительное тестирование приема пищи может также повлиять на результаты, потребление пищи должно контролироваться до теста. Это можно легко сделать в автоматическом режиме.
В литературе, различные альтернативные тесты используются для оценки различных аспектов депрессии, как поведение (часто отчаяние вместо anhedonia); однако методы, иллюстрированные в этой рукописи, имеют ряд преимуществ. Альтернативный широко используемый метод для оценки поведенческого отчаяния, как часть депрессии, как поведение принудительного плаватьтест 4. В соответствии с этой проблемой потребление продовольствия не оценивается; таким образом, нет риска измерения неточности.
Этот протокол имеет ряд других недостатков. Недавний обзор пришел к выводу, что принудительный тест плавать является тест, который на самом деле меры стресса стратегии преодоления, а не депрессия, какповедение 17. Кроме того, если конструкция кроссовера предпочтительнее уменьшить количество животных в соответствии с "три R" благополучия животных, принудительный тест плавать не может быть применен, так как это может оказать длительное (травмирующее) влияние на поведение проверенныхживотных 18.
В отличие от этого, SPT и NIH оба не имеют травмирующих аспектов и могут быть повторены. Кроме того, следует отметить, что этап обучения до дня СПТ и НИЗ устанавливает привыкание к потреблению; поэтому повторение протокола возможно. После теста, вкусная пища (раствор сахарозы или закуска) удаляется, и обучение вновь вводится примерно 24 ч после тестирования; таким образом, грызуны имеют перерыв без доступа к приемлемым стимулом. Предполагается, что после перерыва, новый период обучения с адаптацией должно произойти, чтобы обеспечить соотношение предпочтений около 1 или что стабильный базовый прием закуски достигается, прежде чем повторять тесты.
Тест похож на принудительный тест плавать является хвост подвески тест, краткосрочный и неизбежный период стресса, в котором животные приостановлены их хвост и развивать неподвижные позы интерпретируется как признак депрессии, какповедение 19. Этот тест может быть использован только у мышей, так как крысы не должны быть приостановлены их хвосты из-за болеевысокого среднего веса 20, в то время как SPT и NIH могут быть использованы как у мышей и крыс.
Дальнейшие преимущества тестов, представленных в этой рукописи, заключается в том, что тест гипофагии, вызванный новизной, показывает хорошую действительность конструкции; таким образом, он измеряет до своих претензийхорошо 21,22. Следовательно, количество потребляемого вещества коррелирует с интенсивностью ангедонии, подтвержденной соответствием результатов SPT и NIH другим поведенческимтестам 12. Кроме того, как тест предпочтения сахарозы и новизны индуцированной гипофагии тест имеют хорошую действительность лица. Они субъективно рассматриваются как измерение того, что предназначено (здесь, анхедония оценивается как снижениепотребления приятных веществ) 21,22.
Основными ограничениями автоматизированной системы мониторинга потребления являются требования к надлежащей подготовке и ежедневному обслуживанию/очистке системы, что делает ее трудоемкой, чем ручные протоколы. В предыдущихэкспериментах 10, было отмечено, что, хотя молодые крысы адаптироваться к автоматизированной системе, старые крысы иногда нет. Эти животные, очевидно, должны быть исключены из эксперимента.
Что касается ограничений поведенческого теста, следует отметить, что обучение также много времени, особенно NIH. Кроме того, протоколы являются краткосрочными, и долгосрочное применение может привести к недоеданию. До сих пор в литературе не сообщается об использовании этих тестов в состояниях голода (например, модель нервной анорексии, расстройство пищевого поведения, обычно связанное с симптомами депрессии), поэтому нет рекомендации их использования для состояния голода.
С помощью этого протокола, можно только определить, есть ли анхедония (снижение потребления жидкости / закуски). Тем не менее, он не в состоянии конкретно количественно степень анхедонии. В будущем введение нескольких бутылок с различными концентрациями сахарозы может стать возможным дополнением к дальнейшей количественной оценке анхедонии. В целом, использование автоматизированного мониторинга потребления может быть полезным в любом эксперименте, где точное обнаружение потребления необходимо, например, путем мониторинга перорального приема лекарств, растворенных в питьевой воде для фармацевтических исследований.
Таким образом, тест предпочтений сахарозы и тест гипофагии, вызванный новизной, являются устоявшимися протоколами для оценки ангедонии как части депрессии, как поведение у грызунов. В сочетании с автоматизированной системой мониторинга приема пищи, даже тонкие различия могут быть обнаружены в надежной и повторяемой моды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
А.С. является консультантом по Берлину, Бурингер-Ингелхайму, Такеде и Швабе. Конфликта интересов не существует.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансированием Немецкого научно-исследовательского фонда (STE 1765/3-2) и финансирования Университета Шарите (UFF 89/441-176, A.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Assembly LH Cage Mount - RAT-FOOD - includes Stainless cage mount, hopper, blocker, coupling | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCMPRF01 | |
| Assembly LH Cage Mount unplugged - RAT - FOOD includes stainless steel cage mount, hopper, blocker, unplugged adapter, coupling | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCMUPRF01 | |
| cage w/ 2 openings - RAT - costum modified cage - includes cage top and standard water bottle | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCR02 | single housing |
| Data collection Laptop Windows - Configured w/ BioDAQ Software | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BLT003 | |
| enrichment (plastic tubes, gnawing wood) | distributed by the animal facility | ||
| HoneyMaid Graham Cracker Crumbs | Nabisco, East Hanover, NJ, USA | ASIN: B01COWTA98 | palatable snack for NIH test |
| low vibration polymer rack | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BRACKR | |
| male Sprague Dawley rats | Envigo | Order Code: 002 | |
| Model #2210 32x Port BioDAQ Central Controller - includes cables, and calibration kit | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCC32_03 | |
| Peripheral sensor Controller - includes cable | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BPSC01 | |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | statistical analysis | |
| Stainless steel blocker | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BBLKR | |
| standard rodent diet with 10 kcal% fat | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | D12450B | |
| sucrose powder | Roth | 4621.1 | for SPT |
References
- World Health Organization. Depression. , Available from: https://www.who.int/health-topics/depression (2018).
- Reddy, M. S. Depression: the disorder and the burden. Indian Journal of Psychological Medicine. 32 (1), 1-2 (2010).
- Cryan, J. F., Mombereau, C. In search of a depressed mouse: utility of models for studying depression-related behavior in genetically modified mice. Molecular Psychiatry. 9 (4), 326-357 (2004).
- Overstreet, D. H. Modeling depression in animal models. Methods in Molecular Biology. 829, 125-144 (2012).
- Moreau, J. -L. Simulating the anhedonia symptom of depression in animals. Dialogues in Clinical Neuroscience. 4 (4), 351-360 (2002).
- Scheggi, S., De Montis, M. G., Gambarana, C. Making Sense of Rodent Models of Anhedonia. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 21 (11), 1049-1065 (2018).
- Liu, M. Y., et al. Sucrose preference test for measurement of stress-induced anhedonia in mice. Nature Protocol. 13 (7), 1686-1698 (2018).
- Serchov, T., van Calker, D., Biber, K. Sucrose Preference Test to Measure Anhedonic Behaviour in Mice. Bio-Protocol. 6 (19), 1958 (2016).
- Dulawa, S. C., Hen, R. Recent advances in animal models of chronic antidepressant effects: the novelty-induced hypophagia test. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 771-783 (2005).
- Teuffel, P., et al. Treatment with the ghrelin-O-acyltransferase (GOAT) inhibitor GO-CoA-Tat reduces food intake by reducing meal frequency in rats. Journal of Physiology and Pharmacology. 66 (4), 493-503 (2015).
- Binder, E. B., Nemeroff, C. B. The CRF system, stress, depression and anxiety-insights from human genetic studies. Molecular Psychiatry. 15 (6), 574-588 (2010).
- Marques, M. D., Waterhouse, J. M. Masking and the evolution of circadian rhythmicity. Chronobiology International. 11 (3), 146-155 (1994).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Locomotor response to an open field during C57BL/6J active and inactive phases: differences dependent on conditions of illumination. Physiology and Behavior. 69 (3), 269-275 (2000).
- Madiha, S., Haider, S. Curcumin restores rotenone induced depressive-like symptoms in animal model of neurotoxicity: assessment by social interaction test and sucrose preference test. Metabolic Brain Disorder. 34 (1), 297-308 (2019).
- Strouthes, A. Thirst and saccharin preference in rats. Physiology and Behavior. 6 (4), 287-292 (1971).
- Inui-Yamamoto, C., et al. Taste preference changes throughout different life stages in male rats. PloS One. 12 (7), 0181650 (2017).
- Commons, K. G., Cholanians, A. B., Babb, J. A., Ehlinger, D. G. The Rodent Forced Swim Test Measures Stress-Coping Strategy, Not Depression-like Behavior. ACS Chemical Neuroscience. 8 (5), 955-960 (2017).
- Slattery, D. A., Cryan, J. F. Using the rat forced swim test to assess antidepressant-like activity in rodents. Nature Protocols. 7 (6), 1009-1014 (2012).
- Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Review. 29 (4-5), 571-625 (2005).
- Can, A., et al. The tail suspension test. Journal of Visualized Experiments. (59), e3769 (2012).
- Chadman, K. K., Yang, M., Crawley, J. N. Criteria for validating mouse models of psychiatric diseases. American Journal of Medical Genetics B Neuropsychiatric Genetics. 150 (1), 1-11 (2009).
- Powell, T. R., Fernandes, C., Schalkwyk, L. C. Depression-Related Behavioral Tests. Current Protocols in Mouse Biology. 2 (2), 119-127 (2012).
