Summary
Descrevemos a criação de um modelo de rato de sobrecarga de pressão induzida remodelação moderada e disfunção sistólica precoce onde as vias de transdução de sinal envolvidas no início do processo de remodelação são ativadas. Este modelo animal ajudará na identificação de alvos moleculares para a aplicação de estratégias terapêuticas precoces anti-remodelação para insuficiência cardíaca.
Abstract
Em resposta a uma lesão, como infarto do miocárdio, hipertensão prolongada ou agente cardiotóxico, o coração se adapta inicialmente através da ativação de vias de transdução de sinal, para neutralizar, a curto prazo, a perda de miócitos cardíacos e ou o aumento do estresse na parede. No entanto, a ativação prolongada dessas vias torna-se prejudicial levando à iniciação e propagação da remodelagem cardíaca levando a mudanças na geometria ventricular esquerda e aumentos nos volumes ventriculares esquerdos; um fenótipo visto em pacientes com insuficiência cardíaca sistólica (HF). Aqui, descrevemos a criação de um modelo de rato de sobrecarga de pressão induzida por remodelação moderada e disfunção sistólica precoce (MOD) por banda aórtica ascendente (AAB) através de um clipe vascular com uma área interna de 2 mm2. A cirurgia é realizada em 200 g de ratos Sprague-Dawley. O fenótipo MOD HF desenvolve-se 8-12 semanas após a AAB e é caracterizado não invasivamente por meio de ecocardiografia. Trabalhos anteriores sugerem a ativação de vias de transdução de sinal e a expressão genética alterada e modificação pós-translacional de proteínas no fenótipo MOD HF que imitam aquelas vistas em HF sistólico humano; portanto, tornando o fenótipo MOD HF um modelo adequado para pesquisas translacionais para identificar e testar potenciais alvos terapêuticos anti-remodelação em HF. As vantagens do fenótipo MOD HF em comparação com o fenótipo hf sistólico é que permite a identificação de alvos moleculares envolvidos no processo de remodelação precoce e a aplicação precoce de intervenções terapêuticas. A limitação do fenótipo MOD HF é que ele pode não imitar o espectro de doenças que levam ao HF sistólico em humanos. Além disso, é um fenótipo desafiador a ser criado, pois a cirurgia AAB está associada a altas taxas de mortalidade e falha com apenas 20% dos ratos operados desenvolvendo o fenótipo HF desejado.
Introduction
A insuficiência cardíaca (FF) é uma doença prevalente e está associada à alta morbidade e mortalidade1. Os modelos de sobrecarga de pressão de roedores (PO) de HF, produzidos por bandas aórticas ascendentes ou transversais, são comumente usados para explorar mecanismos moleculares que levam ao HF e para testar potenciais novos alvos terapêuticos em HF. Eles também imitam mudanças observadas no HF humano secundário à hipertensão sistêmica prolongada ou estenose aórtica grave. Após po, a parede ventricular esquerda (LV) aumenta gradualmente em espessura, um processo conhecido como hipertrofia LV concêntrica (LVH), para compensar e adaptar-se ao aumento do estresse da parede LV. No entanto, isso está associado à ativação de uma série de vias de sinalização mal adaptáveis, que levam a desarranjos no ciclismo de cálcio e homeostase, remodelação da matriz metabólica e extracelular e alterações na expressão genética, bem como apoptose e autofagiaaprimoradas 2,3,4,5,6. Essas mudanças moleculares constituem o gatilho para a iniciação e propagação da remodelagem do miocárdio e transição para um fenótipo HF decompensado.
Apesar do uso de cepas de roedores inadeados e da padronização do tamanho do clipe e da técnica cirúrgica, há uma tremenda variabilidade phenotípica na estrutura da câmara lv e função nos modelos de banda aórtica7,8,9. A variabilidade faitípica encontrada após po em rato, cepa Sprague-Dawley, é descrita em outro lugar10,11. Desses, dois fenótipos de HF são encontrados com evidências de remodelação do miocárdio e ativação de vias de transdução de sinal levando a um estado de estresse oxidativo aumentado. Isso está associado à remodelação metabólica, à expressão genética alterada e às alterações na modificação pós-tralácida das proteínas, desempenhando um papel no processo de remodelação10,12. O primeiro é um fenótipo de remodelação moderada e disfunção sistólica precoce (MOD) e o segundo é um fenótipo de HF sistólico sobreaberto (HFrEF).
O modelo PO de HF é vantajoso sobre o modelo de infarto do miocárdio (MI) de HF porque as tensões de parede circunferencial e merirental induzidas por PO são distribuídas de forma homogênea em todos os segmentos do miocárdio. No entanto, ambos os modelos sofrem de variabilidade na gravidade da PO10,11 e no tamanho do infarto13,14 juntamente com inflamação intensa e cicatrizes no local do infarto15, bem como adesão à parede torácica e tecidos circundantes, que são observados no modelo MI de HF. Além disso, o modelo hf induzido por perfto de rato po é desafiador de criar, pois está associado a altas taxas de mortalidade e falha10, com apenas 20% dos ratos operados desenvolvendo o fenótipo MOD HF10.
O MOD é um fenótipo HF atraente e constitui uma evolução do fenótipo HFrEF tradicionalmente criado, pois permite o direcionamento precoce de vias de transdução de sinal que desempenham um papel na remodelação do miocárdio, especialmente quando se refere a perturbações na dinâmica e função mitocondrial, metabolismo miocárdico, ciclismo de cálcio e remodelação da matriz extracelular. Estes processos fisiopatológicos são altamente evidentes no fenótipo MOD HF11. Neste manuscrito, descrevemos como criar os fenótipos MOD e HFrEF e abordamos armadilhas enquanto executamos o procedimento de banda aórtica ascendente (AAB). Também elaboramos sobre como melhor caracterizar pela ecocardiografia os dois fenótipos hf, MOD e HFrEF, e como diferenciá-los de outros fenótipos que não desenvolvem PO grave ou que desenvolvem po severo e remodelação concêntrica, mas sem remodelagem excêntrica significativa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os métodos e procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Tulane.
1. Ferramentas e instrumentos para criação de modelos AAB
- Obter desinfetantes, como 70% álcool isopropílico e povidone-iodo.
- Obtenha cetamina e xilazina para anestesia e buprenorfina para analgesia.
- Obtenha uma almofada de aquecimento e subpad descartável de absorção pesada com as dimensões de 18 polegadas x 30 polegadas.
- Obtenha um rolo de fio de algodão 100%, uma fita e um cortador de cabelo.
- Obter uma placa plástica de 20 cm x 25 cm, faixa de espessura entre 3-5 mm.
- Obtenha um iluminador de fibra óptica Z-LITE.
- Obter um ventilador mecânico para animais de pequeno porte (por exemplo, SAR-830/AP).
- Obtenha suturas de aper de vicryl 2-0 e 3-0 e sutura de monofilamento de nylon 3-0, almofadas de gaze estéreis e pontas de algodão extra grandes estéreis e luvas estéreis.
- Obtenha angiocath de 16 G para intubação.
- Compre as seguintes ferramentas cirúrgicas.
- Obtenha uma ligadura hemoclip de aço inoxidável Weck e clipes de ligadura de aço inoxidável.
- Obter uma tesoura de íris fina endurecida.
- Obtenha fórceps Adson.
- Obtenha dois fórceps graefe curvos.
- Obtenha um hemostats-hemostats-straight de mosquito halsted.
- Obtenha um suporte de agulha Mayo-Hegar.
- Obtenha um retrátil alm com dentes contundentes.
- Utilize e obtenha uma autoclave e um esterilizador de bicos.
2. Procedimento cirúrgico de banda aórtica ascendente
- Anestesiar o animal com uma injeção intraperitoneal de uma mistura de 75-100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de Xilazina.
NOTA: Aguarde alguns minutos para que o animal esteja completamente sedado e flácido. Se a dose anestéstica não for suficiente e o animal ainda estiver se movendo na gaiola, reinje o animal com a mesma dose anestéstica depois de permitir tempo suficiente, cerca de 5-10 minutos entre as injeções subsequentes. A maioria dos animais necessita de 1-2 injeções para alcançar sedação profunda e anestesia. - Raspe o cabelo no local cirúrgico localizado na área torácica lateral direita sob a axila direita.
- Estabilize o animal batendo suavemente todos os quatro membros na placa de plástico. Em seguida, realize a intubação endotraqueal com um angiocath de 16 G. Após a intubação do animal, inicie a ventilação mecânica com volumes de maré de 2 mL a 50 ciclos/min e FiO2 de 21%. Procure o aumento simétrico na parede torácica a cada respiração.
- Gire o animal lentamente para deitar no lado esquerdo lateral e, em seguida, dobre a cauda de forma em U e estabilize-o batendo-o suavemente na placa de plástico. Em seguida, vá em frente e desinfete a área raspada com aplicação tópica de povidone-iodo.
- Infiltrar-se na pele no local da incisão com mistura de 50/50 em volume de 1-2% lidocaína/0,25-0,5 % bupivacaína como analgesia preventiva antes de fazer a incisão.
- Realize uma incisão horizontal da pele direita, de 1-2 centímetros de comprimento, na área axilar direita 1 cm abaixo da axila direita. Em seguida, disseque a camada muscular torácica até atingir a caixa torácica. Faça uma toracotomia de 1 cm entre a caixatorácica 2 e3.
- Ao dissecar a camada muscular do peito, tenha cuidado e evite lesões na artéria axilar direita, que corre por baixo da axila direita.
NOTA: A toracotomia realizada entre a1ª e a2ª costela traz o risco de agrupar a artéria braquicefálica direita em vez da aorta ascendente. A toracotomia entre a3ª e a quarta costela dificulta a visualização e a banda da aorta ascendente, pois o operador estará olhando para o átrio certo.
NOTA: Evite estender a toracotomia muito mediadamente em direção ao esterno para evitar dissecar e ferir a artéria mamária interna direita.
- Ao dissecar a camada muscular do peito, tenha cuidado e evite lesões na artéria axilar direita, que corre por baixo da axila direita.
- Disseque os dois lóbulos da glândula timo suavemente e empurre-os para longe do lado. Em seguida, identifique a aorta ascendente e isole-a da veia cava superior por dissecção contundente através de um fórceps graefe curvo.
NOTA: A manipulação significativa da glândula timo a deixará inchada e dificultará a visualização da aorta ascendente.- Disseque a veia cava superior da aorta com cuidado extra para evitar lesões ou ruptura da veia cava superior, que é fatal. Esta pode ser a parte mais complicada do procedimento e espera-se que aconteça de tempos em tempos mesmo nas mãos mais experientes, mas muitas vezes com iniciantes e aprendizes.
- Levante suavemente a aorta ascendente com um fórceps graefe curvo e coloque o clipe vascular em torno da aorta ascendente.
- Ajuste a ferramenta de ligadura do hemoclipe vascular através de uma peça plástica pré-cortada de 7" para obter um clipe vascular da área interna desejada de 1,5 mm2 ou 2 mm2, dependendo do modelo HF desejado.
- Suturar o tórax através de uma sutura de monofilamento Vicryl 2-0. Em seguida, sutura a camada muscular do peito através de uma sutura 3-0 Vicryl. Em seguida, sutura a incisão da pele através de uma sutura de monofilamento nylon 3-0.
- Administrar uma combinação dos seguintes medicamentos após a conclusão da cirurgia por 48-72 horas para servir como analgesia no período pós-operatório: 1) Buprenorfina 0,01-0,05 mg/kg subcutâneamente a cada 8-12h, 2) Meloxicam 2 mg/kg subcutâneamente a cada 12h, e 3) Morfina 2,5 mg/kg subcutâneamente a cada 2-4h conforme necessário para dor severa.
NOTA: Deixe o animal se recuperar em uma almofada de aquecimento sob monitoramento regular. Uma vez que o animal apareça sinais de recuperação da anestesia (capaz de respirar espontaneamente - sem evidência de ofegante ou uso de músculos acessórios por mais de dois minutos - e tiver bons reflexos, extremidades vermelhas e quentes), extubar o animal e devolvê-lo à gaiola.
3. Ecocardiografia
- Sedao o animal com injeção intraperitoneal de 80-100 mg/kg de cetamina. Garantir sedação adequada para aquisição adequada de imagens eco de boa qualidade.
NOTA: O uso de isoflurano como anestésico é desencorajado para seu efeito cardiodepressor, especialmente na configuração de sobrecarga de pressão severa e pode dar uma falsa impressão de dilatação lv e disfunção sistólica que resolve uma vez que o animal está fora anestésico.- Tenha cuidado e administre metade ou até mesmo um terço da dose de cetamina em animais que parecem disspneicos e taquipneicos com a suspeita de que eles desenvolveram o fenótipo HFrEF.
- Raspe o cabelo do peito, anteriormente, no animal completamente sedado.
- Coloque o animal de costas e estabilize-o na placa de plástico.
- Adquira eixo longo parasternal 2D e clipes de visão de eixo curto parasternal 2D ao nível do músculo papilar. Além disso, obtenha imagens do modo M a partir da visão curta do eixo parasternal ao nível do músculo papilar para medir a espessura da parede septal e posterior de LV em diastole, bem como lv extremidade-diastólica e diâmetro sistólica final.
- Adquira imagens ou clipes a uma freqüência cardíaca de 370 - 420 batidas por minuto para garantir uma avaliação adequada do tamanho e função de LV. A aquisição de imagens a taxas cardíacas mais baixas levará a uma falsa impressão de função LV deprimida e dilatação lv.
NOTA: A aquisição de imagens/clipes de visualização de eixoparasternal 2D encurtados por abreviação de 2D levam a medições falsas. Para fins de controle de qualidade, certifique-se de que o ápice LV e o ângulo aorto-mitral sejam visualizados dentro do mesmo corte de plano. - Adquira imagens/clipes de visualização de eixo parasternal curto 2D ao nível do músculo papilar médio. Isso servirá como referência para obter medições de LV seriais e subseqüentes confiáveis enquanto acompanha os animais ao longo do tempo durante o período de estudo.
- Adquira imagens ou clipes a uma freqüência cardíaca de 370 - 420 batidas por minuto para garantir uma avaliação adequada do tamanho e função de LV. A aquisição de imagens a taxas cardíacas mais baixas levará a uma falsa impressão de função LV deprimida e dilatação lv.
- Obter imagens do modo M em uma visão de eixo parasternal longo no nível da válvula aórtica para avaliar o diâmetro relativo do ártrico a esquerdo (LA) na sístole final.
NOTA: Os animais com os fenótipos MOD e HFrEF devem apresentar evidências de dilatação la com razão LA/Ao sendo ≥1,25 e <1,5 no fenótipo MOD HF e ≥1,5 no fenótipo HFrEF10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A caracterização dos fenótipos de HF, que se desenvolvem de 8 a 12 semanas após a AAB, poderia ser facilmente realizada através da ecocardiografia. Imagens representativas do modo M de Sham, Semana 3 pós-AAB, MOD e hfref fenótipos são apresentadas na Figura 1A. A Figura 1B e a Figura 1C estão mostrando o tamanho do clipe vascular para a criação do fenótipo MOD HF e do fenótipo HFrEF, respectivamente. Os volumes de LV end-diastólica (LVEDV) e sistólica final (LVESV) poderiam ser calculados utilizando-se as fórmulas do método de comprimento da área: V=5/6×A×L, onde V é o volume em ml; A é a área transversal da cavidade LV em cm2, obtida a partir da visão curta do eixo parasternal ao nível do músculo médio-papilar em diastole (Ad) e em sístole (As); e L é o comprimento da cavidade LV em cm, medido a partir da visão do eixo parasternal longo como a distância do ápice endocárdico LV até a junção mitral-aórtica em diastole (Ld) e em sístole (Ls). São apresentadas imagens de ecocardiografia de eixo parasternal longo sumiço 2D e curto eixo parasternal, com ilustração sobre como medir Ld, Ls, Ad e As, em Sham e MOD HF fenótipo são apresentados na Figura 2. O LVEDV no fenótipo MOD HF geralmente varia entre 600 - 700 μL, com muito poucos animais com LVEDV maior que 700 μL e até 1000 μL; enquanto, o LVESV no fenótipo MOD varia entre 120 - 160 μL(Tabela 1). A partir da visão de parasternal de curto curto parasternal 2D imagens de ecocardiografia apresentadas na Figura 2, pode-se apreciar o grau de LVH no fenótipo MOD em comparação com a farsa. Os traçados representativos de loop de volume de pressão dos fenótipos Sham, Semana 3 pós-AAB, MOD e HFrEF são apresentados na Figura 3. A pressão máxima lv é de pelo menos 200 mmHg, mesmo na semana 3 pós-AAB, e aumenta ainda mais na semana 8 pós-AAB devido à incompatibilidade entre o crescimento do animal e a aorta e a estenose criada fixana mente na aorta ascendente. Observe que os animais na semana 3 pós-AAB são totalmente compensados com a mudança do LVEDV e LVESV para a esquerda em comparação com a farsa. Com hipertrofia progressiva excêntrica e remodelação, há uma mudança em LVEDV e LVESV para a direita nos fenótipos MOD e HFrEF em comparação com a semana 3 pós-AAB. Pode-se apreciar também o aumento significativo do LVESV no fenótipo MOD e o aumento profundo do LVESV no fenótipo HFrEF, o que reflete as reduções significativas e profundas no volume de derrame e LVEF nos fenótipos MOD e HFrEF, respectivamente, em comparação com a semana 3 pós-AAB. Além disso, pode-se apreciar o aumento significativo do LVEF na semana 3 pós-AAB e a diminuição significativa do LVEF no fenótipo HFrEF em comparação com a farsa.
O modelo de HF induzido por rato está associado a altas taxas de mortalidade e falha. Apenas cerca de 20% dos ratos submetidos à AAB, com um clipe vascular de 2 mm2 de diâmetro interno, farão a transição para desenvolver o fenótipo MOD HF. Imagens representativas do modo M dos fenótipos com falha são apresentadas na Figura 4. A Figura 4A apresenta imagens representativas do modo M de animais que não desenvolveram LVH na semana 8 pós-AAB, e perderam completamente o PO com regressão completa de LVH (sham-like) ou tiveram grau variável de LVH e PO na semana 8 pós-AAB causando um fenótipo LVH levemente moderado. O segundo grupo de fenótipo falho é apresentado na Figura 4B mostrando imagens representativas do modo M de animais com po severo (LV pressão máxima >200 mmHg) e LVH severo que permaneceram compensados sem evidência de remodelação excêntrica, grupo de remodelagem concêntrica (CR) ou com uma leve (grupo MILD) remodelação excêntrica. Os dados ecocardiográficos e hemodinâmicos dos fenótipos falsos, falhos e bem sucedidos/desejados são apresentados na Figura 5 e na Tabela 1. Note os aumentos progressivos no peso cardíaco e no peso de LV à medida que os animais transitam de um fenótipo compensado para um fenótipo mais excêntrico e remodelado. Além disso, há um aumento exponencial do LVESV e diminuição do LVEF à medida que os animais passam de uma remodelagem concêntrica compensada para um fenótipo excêntrico decompensado. De particular interesse é que tanto os fenótipos MOD quanto hFrEF HF têm um grau semelhante de rigidez miocárdica medida pela rigidez-coeficiente β da relação de volume de pressão diastólica final (EDPVR (mmHg/μL)) em comparação com todos os outros fenótipos, enquanto há uma diminuição gradual na eficiência de LV à medida que os animais transitam para um fenótipo mais excêntrico. A eficiência da LV é calculada a partir da relação de volume de pressão sistólico final (ESPVR) dividida pela elastance arterial (EA). Apesar de que não há diferença estatística significativa no ESPVR e ESPVR/EA entre os fenótipos MOD e HFrEF e o grupo sham, este é falsamente o caso, pois os fenótipos MOD e HFrEF têm uma pressão lv final-sistólica significativamente maior em comparação com a farsa, tornando a inclinação ESPVR falsamente mais íngreme com mudança em V0 para a direita em comparação com a farsa. Além disso, quando os fenótipos MOD e HFrEF são comparados com os fenótipos compensados e concentricamente remodelados, que têm o mesmo grau de PO, então pode-se apreciar o aumento significativo e progressivo do LVESV e a queda no ESPVR e ESPVR/EA com remodelação progressiva excêntrica, como observado nos fenótipos MOD e HFrEF em comparação com os fenótipos CR e MILD(Figura 5 e Tabela 1).
Figura 1: Fenótipos representativos de insuficiência cardíaca na semana 8 após a banda aórtica ascendente. (A) Imagens representativas do modo M de animais falsos, animais três semanas após a banda aórtica ascendente (AAB) e oito semanas após a AAB. A Figura 1A foi modificada de Chaanine et al., American Journal of Physiology-Heart and Circulatory physiology, 2016. (B) Tamanho do clipe vascular para a criação de hipertrofia ventricular esquerda grave (LVH) com remodelagem excêntrica moderada (MOD). (C) Tamanho do clipe vascular para a criação de LVH grave com insuficiência cardíaca sistólica franca (HFrEF). As figuras 1B e 1C foram obtidas e modificadas a partir de Chaanine et al., Métodos em Biologia Molecular, 2018. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cálculo dos volumes ventriculares esquerdos por ecocardiografia utilizando o método de comprimento de área. Representante 2D parasternal longo e eixo parasternal curto 2D visualizam imagens de ecocardiografia para medir o comprimento da cavidade ventricular esquerda (LV) em diastole (Ld) e em sístole (Ls) e cavidade LV área transversal transversal em diastole (Ad) e em sístole (As) a fim de calcular volumes de LV no final de diastole e sístole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os traçados de loop de volume de pressão foram obtidos através de um cateter de volume de pressão de rato de 1,9 F usando o peito aberto e a abordagem de punção apical ventricular esquerda. Rastreamentos representativos de loop de volume de pressão em Sham, semana 3 seguindo fenótipos AAB, MOD e HFrEF na semana 8 após AAB. Figura foi modificada de Chaanine et al., Circulation: Heart Failure, 2013. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Encontrado fenótipos na semana 8 após AAB com falha no desenvolvimento do fenótipo de insuficiência cardíaca desejado. (A) Imagens representativas do modo M de animais que perderam a sobrecarga de pressão (PO) e não desenvolveram LVH (Sham-like) e aqueles com fenótipos de PO e LVH variável (LVH leve-moderada). (B) Imagens representativas do modo M de animais que desenvolveram po severo, LVH e remodelagem concêntrica (CR), mas sem (CR) ou com fenótipos de remodelação leve (MILD) excêntricos. A Figura 4B foi modificada de Chaanine et al., Journal of American Heart Association, 2017. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Ecocardiografia e parâmetros de loop de volume de pressão nos diferentes fenótipos. Os dados são apresentados como valores individuais (pontuais) com mediana (linha horizontal) nos diferentes fenótipos na semana 8 pós-AAB. Os resultados da análise estatística dos dados apresentados nos diferentes fenótipos são mostrados na tabela 1. LVESV: volume sistólico final ventricular esquerdo, LVEF: fração de ejeção ventricular esquerda, EDPVR: relação de volume de pressão diastólica final, ESPVR: relação de volume de pressão sistólica final, EA: elastance arterial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Sham (n=5) | Sham-like (n=5) | LVH mild-mod (n=8) | CR (n=11) | MILD (n=14) | MOD (n=14) | HFrEF (n=5) | |
| Peso corporal (g) | 594 ± 37 | 466 ± 66 | 464 ± 22 | 497 ± 43 | 530 ± 59 | 478 ± 39 | 546 ± 18 |
| HW (mg) | 1269 ± 124,5 | 1328 ± 119 | 1614 ± 177 | 1645 ± 191a | 1821 ± 169a,b | 2106 ± 292a,b,c,d,e | 2897 ± 182a,b,c,d,e,f |
| LVW (mg) | 897 ± 94 | 968 ± 91 | 1161 ± 144 | 1222 ± 152a | 1372 ± 135a,b | 1580 ± 219a,b,c,d,e | 1726 ± 82a,b,c,d,e |
| RVW (mg) | 218± 22 | 218 ± 23 | 266 ± 24 | 239 ± 26 | 249 ± 26 | 283 ± 42a,b | 565 ± 76a,b,c,d,e,f |
| IVSD (cm) | 0,19 ± 0,01 | 0,21 ± 0,01 | 0,23 ± 0,01a | 0,29 ± 0,01a,b,c | 0,28 ± 0,02a,b,c | 0,28 ± 0,01a,b,c | 0,28 ± 0,02a,b,c |
| LVPWd (cm) | 0,20 ± 0,01 | 0,21 ± 0,02 | 0,24 ± 0,01a,b | 0,29 ± 0,02a,b,c | 0,28 ± 0,02a,b,c | 0,28 ± 0,01a,b,c | 0,30 ± 0,02a,b,c |
| LVEDV (μl) | 560,5 ± 25,8 | 570 ± 32 | 668 ± 143 | 442 ± 42,c | 583 ± 45d | 697 ± 129d,e | 881,5 ± 55,7a,b,c,d,e,f |
| LVESV (μl) | 105,9 ± 8,9 | 93 ± 15 | 111 ± 20 | 59 ± 7a,b,c | 85,3 ± 10,6d | 139,7 ± 22,5a,b,c,d,e | 319,2 ± 51,5a,b,c,d,e,f |
| LVEF (%) | 81,1 ± 1,2 | 83,7 ± 2,9 | 83,1 ± 2,5 | 86,5 ± 2,2a,c | 85,4 ± 1,7a | 79,8 ± 1,9b,c,d,e | 64,1 ± 3,6a,b,c,d,e,f |
| LVPmax (mmHg) | 121 ± 19 | 126 ± 23 | 186 ± 23a,b | 218 ± 18a,b | 221 ± 22a,b,c | *234 ± 25a,b,c | 262 ± 16a,b,c,d,e |
| EDPVR (mmHg/μl) | 0,018 ± 0,005 | 0,017 ± 0,004 | 0,041 ± 0,013 | 0,043 ± 0,017 | 0,039 ± 0,015 | *0,068 ± 0,025a,b,c,d,e | 0,079 ± 0,017a,b,c,d,e |
| ESPVR/EA | 1,57 ± 0,67 | 1,96 ± 0,61 | 2,63 ± 1,52 | 3,35 ± 1,23a | 2,62 ± 0,55 | *1,63 ± 0,41d | 0,82 ± 0,24c,d,e |
| Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. A análise estatística foi realizada utilizando-se a ANOVA unidirecional. P < 0,05 foi considerado significativo. | |||||||
| aP < 0,05 vs Sham | |||||||
| bP < 0,05 vs Sham-like | |||||||
| cP < 0,05 vs Mild-modearte LVH | |||||||
| dP < 0,05 vs CR | |||||||
| eP < 0,05 vs MILD | |||||||
| fP < 0,05 vs MOD | |||||||
| *n=6 | |||||||
| Abreviaturas: HW: peso cardíaco, LVW: peso ventricular esquerdo, RVW: peso ventricular direito, IVSd: espessura da parede septal em diastole, LVPWd: espessura da parede posterior ventricular esquerda em diastole. LVEDV: volume de diástélico final ventricular esquerdo, LVESV: volume sistólica final ventricular esquerdo, LVEF: fração de ejeção ventricular esquerda, LVPmax: pressão máxima ventricular esquerda, EDPVR: relação de volume de pressão de fim-diastélico, ESPVR: relação de volume de pressão sistólica final, EA: eelastance arterial. | |||||||
Tabela 1: Echocardiografia e parâmetros de volume de pressão em phenotypes Sham, Sham-like, Mild-moderate LVH, CR, MILD, MOD e HFrEF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Após po relacionado à AAB em rato, o LV passa por remodelação concêntrica aumentando a espessura da parede LV, conhecida como LVH concêntrica, como um mecanismo compensatório para neutralizar o aumento do estresse da parede LV. O aumento da espessura da parede LV torna-se perceptível durante a primeira semana após a AAB e atinge sua espessura máxima em 2-3 semanas após o AAB. Durante esse período, a ativação de vias de transdução de sinal mal adaptáveis leva ao alargamento progressivo do LV com aumentos nos volumes de LV, um processo conhecido como hipertrofia excêntrica ou remodelação. Espera-se que o fenótipo HF em ratos se desenvolva em torno de 8 semanas após a AAB na maioria dos animais, com poucos deles desenvolvendo HF na semana 12 após a AAB. Dois fenótipos hf surgem dependendo da gravidade da AAB. O fenótipo MOD é obtido através da criação de banda aórtica ascendente (AAB) com um clipe vascular de 2 mm2 de diâmetro interno, enquanto a criação do fenótipo HFrEF requer AAB com um clipe vascular mais apertado de 1,5 mm2 de diâmetro interno. É importante realizar a ecocardiografia em 2-3 semanas após a banda aórtica ascendente para verificar a presença de LVH concêntrico grave. A LVH grave é definida como lv septal e posterior de espessura da parede ≥1,5 vezes normal (0,19 cm), e geralmente varia entre 0,27 - 0,3 cm. Animais que não desenvolvem LVH grave na semana 3 seguinte à AAB, serão considerados como tendo AAB mal sucedido e não devem ser seguidos posteriormente. Aqueles que desenvolveram LVH grave na semana 3 após a AAB, serão submetidos à ecocardiografia na semana 8 após a AAB para avaliar o desenvolvimento do fenótipo HF desejado. Não é raro encontrar animais que tiveram LVH grave na semana 3 após a AAB ter regressão ou resolução de LVH na semana 8 seguinte à AAB, por razões que abordaremos na última seção da discussão. Animais com LVH grave e remodelação concêntrica sem ou com leve remodelação excêntrica na semana 8 após a AAB, portanto, os fenótipos CR e MILD, respectivamente, são improváveis de desenvolver mais remodelação excêntrica, mesmo que sejam seguidos por um ou dois meses prolongados. Aqueles que estão entre o fenótipo MILD e MOD, podem desenvolver o fenótipo MOD HF se forem seguidos por mais um mês.
O modelo de rato PO pode ser frustrante devido às altas taxas de mortalidade e falha associadas10, apesar do uso de um tamanho de clipe vascular padronizado e técnica cirúrgica, o que também aumenta a despesa de pesquisa, devido ao grande número de animais que precisam se submeter à AAB para alcançar o número de alvo desejado (n), e o tempo que os animais precisam ser seguidos antes de desenvolverem o hfótipo desejado. A falha no desenvolvimento de LVH grave está relacionada com a banda mal sucedida ou a banda da artéria braquicefálica direita em vez da aorta, o que não é incomum. A regressão e/ou resolução de LVH severa em avaliações subsequentes de seguimento está relacionada à formação de aneurisma e remodelação aórtica peri-banda que leva à perda na gravidade do PO9. Ainda não está claro por que animais com LVH e PO severos desenvolvem variabilidade ferocêtípica em relação à remodelagem excêntrica, apesar de terem o mesmo tamanho, sexo e tensão do clipe. Recomenda-se visualizar a aorta ascendente para tela para remodelação aórtica peri-banda e formação aneurisma. Animais que desenvolvem aneurisma aórtico ascendente ≥1 cm de diâmetro devem ser eutanizados, pois isso causará dissépsia e angústia ao animal devido ao impacto nas estruturas circundantes. Além disso, recomenda-se verificar se há fluxo turbulento através da banda por doppler de cor, mas infelizmente a estimativa precisa do gradiente de pressão em toda a banda por Doppler contínuo não é viável devido à incapacidade de alinhar o Doppler contínuo com a direção do fluxo sanguíneo na aorta ascendente.
O MOD é um fenótipo HF atraente e constitui uma evolução do fenótipo HFrEF tradicionalmente criado, pois permite direcionar vias de transdução de sinal que desempenham papel na remodelação do miocárdio no início do processo da doença, especialmente quando se refere a perturbações na dinâmica e função mitocondrial, metabolismo miocárdio e ciclo de cálcio e remodelação da matriz extracelular e rigidez miocárdica; características que são altamente evidentes no fenótipo MOD HF11. Além disso, a mortalidade pós-operatória precoce (definida como mortalidade nos primeiros 7 dias pós-AAB) é menor com o tamanho do clipe de 2 mm2, para a criação do fenótipo MOD, do que o tamanho do clipe de 1,5 mm2, para a criação do fenótipo HFrEF10, (5% vs 21%, P = 0,009 usando o teste exato de Fisher). No entanto, a taxa de sucesso entre os dois tamanhos de clipe, para a criação de fenótipos MOD e HFrEF, não é estatisticamente significante10, (20% vs 13%, P = 0,56 usando o teste exato de Fisher). Além disso, a banda aórtica por clipe vascular é vantajosa sobre a banda aórtica apertando uma sutura de nylon contra uma agulha de 27 G, uma técnica frequentemente usada para constrição da aorta transversal em camundongos, pois há menos variação no tamanho do clipe e menos trauma na aorta em comparação com a técnica de sutura.
O modelo PO de HF é vantajoso sobre o modelo de infarto do miocárdio (MI) de HF porque o estresse da parede circunferencial e meridiana induzida por PO é distribuído de forma homogênea em todos os segmentos do miocárdio. No entanto, ambos os modelos sofrem de variabilidade na gravidade da PO10,11 e no tamanho do infarto13,14 juntamente com inflamação intensa e cicatrizes no local do infarto15, bem como adesão à parede torácica e tecidos circundantes observados no modelo MI de HF. Além disso, o modelo hf induzido por perfto de rato po é desafiador de criar, pois está associado a altas taxas de mortalidade e falha10, com apenas 20% dos ratos operados desenvolvendo o fenótipo MOD HF10. Quando comparado ao modelo de rato espontaneamente hipertensivo (SHR), o modelo de HF induzido por PO é um modelo melhor para estudar caminhos relacionados à remodelagem do miocárdio. O aumento do estresse da parede pós-carga e do miocárdio em sístole é muito maior no modelo HF induzido por PO do que no modelo SHR. Leva cerca de dois anos para o SHR desenvolver hf sistólico e o mecanismo do HF sistólico não é inteiramente conhecido e é confundido pelo envelhecimento16. O modelo shr e outros modelos de hipertensão, como o modelo de sal DOCA, são mais utilizados para investigar mecanismos e terapias relacionadas à hipertensão arterial e possivelmente disfunção diastólica16.
Em conclusão, o fenótipo MOD HF é um modelo atraente para estudar vias de transdução de sinais no contexto da remodelagem do miocárdio e pode ser utilizado para aplicação e teste de estratégias terapêuticas potenciais, antes da validação de sua eficácia em grandes modelos animais e na insuficiência cardíaca humana.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Todos os autores não relatam conflito de interesses.
Acknowledgments
NIH conceder HL070241 à Polícia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adson forceps | F.S.T. | 11019-12 | surgical tool |
| Alm chest retractor with blunt teeth | ROBOZ | RS-6510 | surgical tool |
| Graefe forceps, curved | F.S.T. | 11152-10 | surgical tool |
| Halsted-Mosquito Hemostats, straight | F.S.T. | 13010-12 | surgical tool |
| Hardened fine iris scissors, straight | Fine Science Tools F.S.T. | 14090-11 | surgical tool |
| hemoclip traditional-stainless steel ligating clips | Weck | 523735 | surgical tool |
| Mayo-Hegar needle holder | F.S.T. | 12004-18 | surgical tool |
| mechanical ventilator | CWE inc | SAR-830/AP | mechanical ventilator for small animals |
| Weck stainless steel Hemoclip ligation | Weck | 533140 | surgical tool |
References
- McMurray, J. J., Petrie, M. C., Murdoch, D. R., Davie, A. P. Clinical epidemiology of heart failure: public and private health burden. European Heart Journal. 19 (Suppl P), P9-P16 (1998).
- Berk, B. C., Fujiwara, K., Lehoux, S. ECM remodeling in hypertensive heart disease. Journal of Clinical Investigation. 117 (3), 568-575 (2007).
- Frey, N., Olson, E. N. Cardiac hypertrophy: the good, the bad, and the ugly. Annual Review of Physiology. 65, 45-79 (2003).
- Hill, J. A., Olson, E. N. Cardiac plasticity. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).
- Kehat, I., Molkentin, J. D. Molecular pathways underlying cardiac remodeling during pathophysiological stimulation. Circulation. 122 (25), 2727-2735 (2010).
- Rothermel, B. A., Hill, J. A. Autophagy in load-induced heart disease. Circulation Research. 103 (12), 1363-1369 (2008).
- Barrick, C. J., et al. Parent-of-origin effects on cardiac response to pressure overload in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (3), H1003-H1009 (2009).
- Barrick, C. J., Rojas, M., Schoonhoven, R., Smyth, S. S. Cardiac response to pressure overload in 129S1/SvImJ and C57BL/6J mice: temporal- and background-dependent development of concentric left ventricular hypertrophy. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 292 (5), H2119-H2130 (2007).
- Lygate, C. A., et al. Serial high resolution 3D-MRI after aortic banding in mice: band internalization is a source of variability in the hypertrophic response. Basic Research in Cardiology. 101 (1), 8-16 (2006).
- Chaanine, A. H., Hajjar, R. J. Characterization of the Differential Progression of Left Ventricular Remodeling in a Rat Model of Pressure Overload Induced Heart Failure. Does Clip Size Matter? Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1816, 195-206 (2018).
- Chaanine, A. H., et al. Mitochondrial Integrity and Function in the Progression of Early Pressure Overload-Induced Left Ventricular Remodeling. Journal of the American Heart Association. 6 (6), (2017).
- Chaanine, A. H., et al. Potential role of BNIP3 in cardiac remodeling, myocardial stiffness, and endoplasmic reticulum: mitochondrial calcium homeostasis in diastolic and systolic heart failure. Circulation: Heart Failure. 6 (3), 572-583 (2013).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology (Bethesda, Md. : 1985). 102 (6), 2104-2111 (2007).
- Vietta, G. G., et al. Early use of cardiac troponin-I and echocardiography imaging for prediction of myocardial infarction size in Wistar rats. Life Sciences. 93 (4), 139-144 (2013).
- Frangogiannis, N. G. The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling. Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).
- Doggrell, S. A., Brown, L. Rat models of hypertension, cardiac hypertrophy and failure. Cardiovascular Research. 39 (1), 89-105 (1998).
