Un modello di pressione indotto moderate rimodellamenti e disfunzione stolica rispetto al sovraccarico di insufficienza cardiaca systolica

Summary

Descriviamo la creazione di un modello di ratto di sovraccarico di pressione indotto moderato rimodellamento e disfunzione sistolica precoce in cui vengono attivati i percorsi di trasduzione del segnale coinvolti nell'avvio del processo di rimodellamento. Questo modello animale aiuterà a identificare gli obiettivi molecolari per l'applicazione di strategie terapeutiche anti-rimodellamento precoce per l'insufficienza cardiaca.

Abstract

In risposta a una lesione, come l'infarto miocardico, l'ipertensione prolungata o un agente cardiotossico, il cuore inizialmente si adatta attraverso l'attivazione di percorsi di trasduzione del segnale, per contrastare, a breve termine, per la perdita di miociti cardiaci e o l'aumento dello stress della parete. Tuttavia, l'attivazione prolungata di questi percorsi diventa dannosa che porta all'avvio e alla propagazione del rimodellamento cardiaco che porta a cambiamenti nella geometria ventricolare sinistra e all'aumento dei volumi ventricolari sinistro; un fenotipo visto in pazienti con insufficienza cardiaca sistolica (HF). Qui, descriviamo la creazione di un modello di ratto di sovraccarico di pressione indotto rimodellamento moderato moderato e disfunzione sistolica precoce (MOD) salendo bande aortiche (AAB) tramite una clip vascolare con un'area interna di 2 mm². L'intervento viene eseguito in 200 g di ratti Sprague-Dawley. Il fenotipo MOD HF si sviluppa a 8-12 settimane dopo l'AAB ed è caratterizzato in modo non invasivo per ecocardiografia. Il lavoro precedente suggerisce l'attivazione delle vie di trasduzione del segnale e l'espressione genica alterata e la modifica post-traduzionale delle proteine nel fenotipo MOD HF che imitano quelle osservate nell'HF sistolico umano; pertanto, rendendo il fenotipo MOD HF un modello adatto per la ricerca traslazionale per identificare e testare potenziali obiettivi terapeutici anti-rimodellamento in HF. I vantaggi del fenotipo MOD HF rispetto al palese fenotipo HF sistolico sono che consente l'identificazione di obiettivi molecolari coinvolti nel processo di rimodellamento precoce e l'applicazione precoce di interventi terapeutici. La limitazione del fenotipo MOD HF è che non può imitare lo spettro di malattie che portano alla sistolica HF nell'uomo. Inoltre, è un fenotipo impegnativo da creare, in quanto la chirurgia AAB è associata ad alti tassi di mortalità e fallimento con solo il 20% dei ratti operai che sviluppano il fenotipo HF desiderato.

Introduction

L'insufficienza cardiaca (HF) è una malattia prevalente ed è associata ad alta morbilità e mortalità¹. I modelli di pressione-sovraccarico (PO) del roditore di HF, prodotti da bande aortiche ascendenti o trasversali, sono comunemente usati per esplorare i meccanismi molecolari che portano all'HF e per testare potenziali nuovi bersagli terapeutici in HF. Essi imitano anche i cambiamenti osservati nell'HF umano secondario a ipertensione sistemica prolungata o stenosi aortica grave. Dopo po, la parete ventricolare sinistra (LV) aumenta gradualmente di spessore, un processo noto come ipertrofia lV concentrica (LVH), per compensare e adattarsi all'aumento della sollecitazione della parete LV. Tuttavia, questo è associato con l'attivazione di una serie di vie di segnalazione disadattative, che portano a squilibramenti nel ciclismo di calcio e omeostasi, rimodellamento della matrice metabolica ed extracellulare e cambiamenti nell'espressione genica, nonché apoptosi migliorata e autofagia^2,3,4,5,6. Questi cambiamenti molecolari costituiscono l'innesco per l'avvio e la propagazione del rimodellamento miocardico e la transizione in un fenotipo HF scompensato.

Nonostante l'uso di ceppi di roditori inbred e la standardizzazione delle dimensioni della clip e della tecnica chirurgica, c'è un'enorme variabilità fenotipica nella struttura della camera LV e funzione nei modelli di fasciatura aortica^7,8,9. La variabilità fenotipica riscontrata dopo il PO nel ratto, ceppo Sprague-Dawley, è descritta altrove^10,11. Di questi, due fenotipi HF sono incontrati con prove di rimodellamento miocardico e attivazione di percorsi di trasduzione del segnale che portano ad uno stato di maggiore stress ossidativo. Ciò è associato al rimodellamento metabolico, all'espressione genica alterata e ai cambiamenti nella modifica post-traduzionale delle proteine, svolgendo complessivamente un ruolo nel processo di rimodellamento^10,12. Il primo è un fenotipo di rimodellamento moderato e disfunzione sistolica precoce (MOD) e il secondo è un fenotipo dell'HF sistolica palese (HFrEF).

Il modello PO di HF è vantaggioso rispetto al modello di infarto miocardico (MI) di HF perché le sollecitazioni circonferenziali e meridionali della parete indotta da PO sono distribuite omogeneamente in tutti i segmenti del miocardio. Tuttavia, entrambi i modelli soffrono di variabilità nella gravità di PO^10,11 e nella taglia infarto^13,14 insieme a infiammazione intensa e cicatrici nel sito infarto¹⁵ così come l'adesione alla parete toracica e ai tessuti circostanti, che sono osservati nel modello MI di HF. Inoltre, il modello HF indotto dal ratto PO è difficile da creare in quanto è associato ad alti tassi di mortalità e fallimento¹⁰, con solo il 20% dei ratti operati che sviluppano il fenotipo MOD HF¹⁰.

Il MOD è un fenotipo HF attraente e costituisce un'evoluzione del fenotipo HFrEF tradizionalmente creato in quanto consente di indirizzare precocemente le vie di trasduzione del segnale che svolgono un ruolo nel rimodellamento miocardico, soprattutto quando riguarda le perturbazioni nella dinamica mitocondriale e nella funzione, nel metabolismo miocardio, nel ciclismo a matrice del calcio e nel rimodellamento extracellulare. Questi processi patofisiologici sono altamente evidenti nel fenotipo MOD HF¹¹. In questo manoscritto, descriviamo come creare i fenotipi MOD e HFrEF e affrontiamo le insidie durante l'esecuzione della procedura di bande aortiche ascendenti (AAB). Elaboriamo anche su come caratterizzare al meglio con l'ecocardiografia i due fenotipi HF, MOD e HFrEF, e su come differenziarli da altri fenotipi che non riescono a sviluppare PO grave o che sviluppano PO e rimodellamento concentrico grave, ma senza significative rimodellate eccentriche.

Protocol

Tutti i metodi e le procedure qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Tulane University School of Medicine.

1. Strumenti e strumenti per la creazione di modelli AAB

1. Ottenere disinfettanti, come 70% alcool isopropile e povidone-iodio.
2. Ottenere chetamina e xilazina per l'anestesia e buprenorphine per l'analgesia.
3. Ottenere un pad di riscaldamento e pesante assorbimento sottosolo usa e getta con le dimensioni di 18 pollici x 30 pollici.
4. Ottieni un rotolo di spago 100% di cotone, un nastro e un tagliacapelli.
5. Ottenere una scheda di plastica 20 cm x 25 cm, spessore gamma tra 3-5 mm.
6. Ottenere un illuminatore in fibra ottica z-LITE.
7. Ottenere un ventilatore meccanico per piccoli animali (ad esempio, SAR-830/AP).
8. Ottenere 2-0 e 3-0 Vicryl conici e sutura di molazione in nylon 3-0, pastiglie di garza sterili e sterili punte di cotone extra large e guanti sterili.
9. Ottieni 16 Ggiocath per l'intubazione.
10. Acquistare i seguenti strumenti chirurgici.
    1. Ottieni una legatura Hemoclip in acciaio inox Weck e clip di ligating in acciaio inox.
    2. Ottenere forbici iride fini indurite.
    3. Ottenere pinze Adson.
    4. Ottenere due pinze Graefe curve.
    5. Ottieni una pinza Halsted-Mosquito Hemostats-straight.
    6. Ottenere un portaago Mayo-Hegar.
    7. Ottenere un retrattore toracico Alm con denti smussati.
11. Utilizzare e ottenere un autoclave e uno sterilizzatore di perline.

2. Chirurgia chirurgica afasciatura ascendente

1. Anestesizzare l'animale con un'iniezione intraperitoneale di un mix di 75-100 mg/kg di Ketamina e 10 mg/kg Xylazine.
   NOTA: Lasciare qualche minuto per l'animale sia completamente sedato e flaccido. Se la dose anestetica non è sufficiente e l'animale è ancora in movimento nella gabbia, reiniettare l'animale con la stessa dose anestetica dopo aver concesso abbastanza tempo, circa 5-10 minuti tra le iniezioni successive. La maggior parte degli animali richiedono 1-2 iniezioni per ottenere sedazione profonda e anestesia.
2. Rasare i capelli sul sito chirurgico situato nella zona toracica laterale destra sotto l'ascella destra.
3. Stabilizzare l'animale toccando delicatamente tutti e quattro gli arti sulla scheda di plastica. Quindi eseguire l'intubazione endotracheale con un angiocath 16 G. Dopo che l'animale è stato intubato con successo, avviare la ventilazione meccanica con volumi di marea di 2 mL a 50 cicli/min e FiO₂ del 21%. Cercare l'aumento simmetrico nella parete del torace con ogni respiro.
4. Girare l'animale lentamente per sdraiarsi sul suo lato laterale sinistro, quindi piegare la coda in modo a forma di U e stabilizzarlo toccandolo delicatamente sulla scheda di plastica. Poi andare avanti e disinfettare l'area rasata con l'applicazione topica di povidone-iodio.
5. Infiltrare la pelle nel sito di incisione con 50/50 mix per volume di 1-2% Lidocaine/0.25-0.5 % Bupivacaine come analgesia preventiva prima di effettuare l'incisione.
6. Eseguire un'incisione cutanea orizzontale destra, lunga 1-2 centimetri, nell'area ascellare destra 1 cm sotto l'ascella destra. Quindi, sezionare lo strato muscolare toracico fino a raggiungere la gabbia toracica toracica. Fare una toracotomia di 1 cm tra la gabbia toracica 2^nd e 3^rd.
   1. Durante la dissezione dello strato muscolare del torace, fare attenzione ed evitare lesioni dell'arteria ascellare destra, che corre sotto l'ascella destra.
      NOTA: La toracotomia eseguita tra la 1^st e la^2nd costola comporta il rischio di fasciare l'arteria brachiocefalica destra invece dell'aorta ascendente. La toracotomia tra la 3^rd e la quarta costola rende difficile visualizzare e fascia l'aorta ascendente, come l'operatore sarà guardando l'atrio destro.
      NOTA: Evitare di estendere la toracotomia troppo medialmente verso lo sterno per evitare di sezionare e ferire l'arteria mammaria interna giusta.
7. Dissezionare delicatamente i due lobi della ghiandola del timo e spingerli a parte sul lato. Quindi identificare l'aorta ascendente e isolarla dalla vena cava superiore per dissezione smussata attraverso una pinze Graefe curve.
   NOTA: La manipolazione significativa della ghiandola del timo lo renderà gonfio e rende difficile visualizzare l'aorta ascendente.
   1. Dissezionare la vena cava superiore dall'aorta con particolare cautela per evitare lesioni o rotture della vena cava superiore, che è fatale. Questa può essere la parte più difficile della procedura e ci si aspetta che accada di volta in volta anche nelle mani più esperte, ma spesso con i principianti e gli studenti.
8. Sollevare delicatamente l'aorta ascendente con una pinze Graefe curve e posizionare la clip vascolare intorno all'aorta ascendente.
   1. Regolare l'utensile di legatura emoclip vascolare tramite un pezzo di plastica pre-tagliato da 7" per ottenere una clip vascolare dell'area interna desiderata di 1,5 mm² o 2 mm^2,a seconda di quale modello HF è desiderato.
9. Suturare il torace tramite una sutura monofilamento Vicryl 2-0. Quindi suturare lo strato muscolare del torace attraverso una sutura conica Vicryl 3-0. Quindi suturare l'incisione cutanea tramite una sutura monofilamento Nylon 3-0.
10. Somministrare una combinazione dei seguenti farmaci dopo il completamento dell'intervento chirurgico per 48-72 ore per servire come analgesia nel periodo post-operatorio: 1) Buprenorfina 0,01-0.05 mg/kg sottocutaneamente ogni 8-12h, 2) Meloxicam 2 mg/kg sottocutaneamente ogni 12h, e 3) morfina 2,5 mg/kg sottocutaneamente ogni 2-4h come necessario per un forte dolore.
    NOTA: Lasciare che l'animale si riprenda su una piastra di riscaldamento sotto regolare monitoraggio. Una volta che l'animale mostra segni di recupero dall'anestesia (in grado di respirare spontaneamente - senza prove di ansimante o uso di muscoli accessori per più di due minuti - e ha buoni riflessi, estremità rosse e calde), essetare l'animale e restituirlo alla gabbia.

3. Ecocardiografia

1. Sedare l'animale con iniezione intraperitoneale di 80-100 mg/kg di ketamina. Garantire una sedazione adeguata per una corretta acquisizione di immagini eco di buona qualità.
   NOTA: L'uso di isoflurane come anestetico è sconsigliato per il suo effetto cardiodepressore, soprattutto in impostazione di grave sovraccarico di pressione e potrebbe dare una falsa impressione di dilatazione LV e disfunzione sistolica che si risolve una volta che l'animale è fuori anestetico.
   1. Essere cauti e somministrare metà o anche un terzo della dose di chetamina negli animali che sembrano dispremocidi e tachicici con il sospetto di aver sviluppato il fenotipo HFrEF.
2. Rasare i capelli del petto, anteriormente, nell'animale completamente sedato.
3. Posare l'animale sulla schiena e stabilizzarlo sulla scheda di plastica.
4. Acquisire 2D parasternal long axis e 2D parasternal short axis view clip a livello del muscolo papillare. Inoltre, ottenere immagini in modalità M dalla breve vista dell'asse parasternale a livello del muscolo papillare per misurare lo setto LV e lo spessore della parete posteriore in diastole, nonché il diametro di diastolico finale e di fine sistolica LV.
   1. Acquisire immagini o clip a una frequenza cardiaca di 370 - 420 battiti al minuto per garantire una corretta valutazione delle dimensioni e della funzione LV. L'acquisizione di immagini a frequenza cardiaca più bassa porterà a una falsa impressione della funzione LV depressa e della dilatazione LV.
      NOTA: l'acquisizione di immagini/clip di visualizzazione dell'asse parasterna lungo accanito porta a false misurazioni. Ai fini del controllo qualità, assicurarsi che l'apice LV e l'angolo aorto-mitrale siano visualizzati all'interno dello stesso taglio piano.
   2. Acquisire immagini/clip dell'asse parasterntale corto 2D a livello del muscolo papillare medio. Questo servirà come riferimento per ottenere misurazioni seriali e successive affidabili mentre seguono gli animali nel tempo durante tutto il periodo di studio.
5. Ottenere immagini in modalità M in una vista dell'asse parasterna lungo a livello della valvola aortica per valutare il diametro dell'atrio a sinistra (Atrio) relativo all'atrio sinistro nella sistomia finale.
   NOTA: gli animali con fenotipi MOD e HFrEF dovrebbero mostrare prove di dilatazione LA/Ao con 1,25 e <1,5 nel fenotipo MOD HF e 1,5 nel fenotipo HFrEF¹⁰.

Representative Results

La caratterizzazione dei fenotipi HF, che si sviluppano 8-12 settimane dopo l'AAB, potrebbe essere facilmente eseguita tramite ecocardiografia. Le immagini rappresentative della modalità M dei fenotipi Sham, Week 3 post-AAB, MOD e HFrEF sono presentate nella Figura 1A. Figura 1B e Figura 1C mostrano la dimensione della clip vascolare per la creazione del fenotipo MOD HF e fenotipo HFrEF, rispettivamente. I volumi LV end-diastolic (LVEDV) e end-systolic (LVESV) potrebbero essere calcolati utilizzando le formule del metodo di lunghezza dell'area: V A è l'area sezionale trasversale della cavità LV in cm^2,ottenuta dalla breve vista dell'asse parasternale al livello del muscolo papillare medio in diastole (Ad) e nella sistole (As); e L è la lunghezza della cavità LV in cm, misurata dalla vista dell'asse parasterna lungo come la distanza dall'apice LV endocardioalo alla giunzione mitral-aortica in diastole (Ld) e in systole (Ls). Rappresentante dell'asse parasterntale lungo 2D e delle immagini ecocardiodell'asse parasternale corto, con illustrazione su come misurare Ld, Ls, Ad e As, nel fenotipo Sham e MOD HF sono presentati nella Figura 2. Il LVEDV nel fenotipo MOD HF di solito varia tra 600 - 700 - L, con pochissimi animali con LVEDV superiore a 700 -L e fino a 1000 l; mentre, il LVESV nel fenotipo MOD varia tra 120 - 160 l (Tabella 1). Dalla vista dell'asse parasterna corto 2D immagini echocardio presentate in Figura 2, si potrebbe apprezzare il grado di LVH nel fenotipo MOD rispetto alla farsa. Le tracce rappresentative del loop del volume di pressione dei fenotipi Sham, Week 3 post-AAB, MOD e HFrEF sono presentate nella Figura 3. La pressione massima di LV è di almeno 200 mmHg, anche alla settimana 3 post-AAB, e aumenta ulteriormente alla settimana 8 post-AAB a causa del disallineamento tra la crescita dell'animale e dell'aorta e la stenosi fissa creata nell'aorta ascendente. Si noti che gli animali alla settimana 3 post-AAB sono completamente compensati con lo spostamento del LVEDV e LVESV a sinistra rispetto alla farsa. Con l'ipertrofia e la ristrutturazione eccentriche progressive, c'è uno spostamento in LVEDV e LVESV a destra nei fenotipi MOD e HFrEF rispetto alla settimana 3 post-AAB. Si potrebbe apprezzare anche l'aumento significativo di LVESV nel fenotipo MOD e il profondo aumento di LVESV nel fenotipo HFrEF, che riflette le diminuzioni significative e profonde del volume dell'ictus e dei fenotipi LVEF nei fenotipi MOD e HFrEF, rispettivamente rispetto alla terza settimana post-AAB. Inoltre, si potrebbe apprezzare l'aumento significativo di LVEF alla settimana 3 post-AAB e la significativa diminuzione del LVEF nel fenotipo HFrEF rispetto alla farsa.

Il modello HF indotto dal ratto PO è associato ad alti tassi di mortalità e fallimento. Solo circa il 20% dei ratti che subiscono AAB, con una clip vascolare di 2 mm² in diametro interno, si sporterà per sviluppare il fenotipo MOD HF. Le immagini rappresentative in modalità M dei fenotipi falliti sono presentate nella figura 4. La figura 4A mostra immagini rappresentative in modalità M di animali che non hanno sviluppato LVH alla settimana 8 post-AAB, e aveva completamente perso l'OP con regressione completa di LVH (sham-like) o aveva grado variabile di LVH e PO alla settimana 8 post-AAB causando un fenotipo LVH lievemente moderato. Il secondo gruppo di fenotipi fallito è presentato nella Figura 4B che mostra immagini rappresentative in modalità M di animali con grave po (pressione massima LV >200 mmHg) e Grave LVH che è rimasto compensato senza alcuna prova di rimodellamento eccentrico, gruppo di rimodellamento concentrico (CR) o con un rimodellamento eccentrico (gruppo Mild). L'ecocardiografia e i dati emodinamici dei fenotipi sham, failed e success/desired sono presentati nella Figura 5 e nella Tabella 1. Si noti il progressivo aumento del peso cardiaco e del peso Di LV mentre gli animali passano da un fenotipo compensato a un fenotipo più eccentrico e rimodellato. Inoltre, vi è un aumento esponenziale di LVESV e una diminuzione di LVEF man mano che gli animali passano da un rimodellamento concentrico compensato a un fenotipo eccentricamente rimodellato scompensato. Di particolare interesse è che entrambi i fenotipi MOD e HFrEF HF hanno un grado simile di rigidità miocardiale misurato dalla rigidità-coefficiente di rigidità - della relazione del volume di pressione end-diastolico (EDPVR (mmHg /L)) rispetto a tutti gli altri fenotipi, mentre c'è una graduale diminuzione dell'efficienza LV come gli animali passano a un fenotipo più rimodellato. L'efficienza LV è calcolata dalla relazione del volume di pressione end-systolic (ESPVR) divisa per l'euforia arteriosa (EA). Nonostante ci sia una differenza statistica significativa nell'ESPVR e nell'ESPVR/EA tra i fenotipi MOD e HFrEF e il gruppo finto, questo è falsamente il caso in quanto i fenotipi MOD e HFrEF hanno una pressione lV end-systolic significativamente più alta rispetto alla finzione, rendendo il pendio ESPVR falsamente ripido con spostamento nel V0 a destra rispetto alla farsa. Inoltre, quando i fenotipi MOD e HFrEF vengono confrontati con i fenotipi compensati e rimodellati concentricamente, che hanno lo stesso grado di PO, si potrebbe apprezzare l'aumento significativo e progressivo di LVESV e il calo dell'ESPVR e dell'ESPVR/EA con eccentrici rimodellati progressivi, come osservato nei fenotipi MOD e HFrEF rispetto ai fenotipi CR e MILD (Figura 5 e tabella).

Figura 1: Fenotipi rappresentativi dell'insufficienza cardiaca alla settimana 8 dopo la fasciatura aortica ascendente. (A) Immagini rappresentative in modalità M di animali finti, animali tre settimane dopo l'ascesa delle bande aortiche (AAB) e otto settimane dopo l'AAB. Figura 1A è stato modificato da Chaanine et al., American Journal of Physiology-Heart and Circolory physiology, 2016. (B) Dimensioni della clip vascolare per la creazione di una grave ipertrofia ventricolare sinistra (LVH) con moderata rimodellamento eccentrico (MOD). (C) Dimensioni della clip vascolare per la creazione di LVH grave con insufficienza cardiaca sistolica palese (HFrEF). Le figure 1B e 1C sono state ottenute e modificate da Chaanine et al., Metodi in biologia molecolare, 2018. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Calcolo dei volumi ventricolari a sinistra mediante ecocardiografia utilizzando il metodo area-lunghezza. Rappresentativo 2D lungo parasternal e 2D breve parasternal axis view echocardiography images per misurare la lunghezza della cavità ventricolare sinistra (LV) in diastole (Ld) e in sistole (Ls) e LV cavità sezione trasversale area in diastole (Ad) e in sistole (As) al fine di calcolare i volumi LV alla fine della diastole e systole. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Le tracce del loop del volume di pressione sono state ottenute tramite un catetere di pressione-volume di pressione del ratto 1.9 F utilizzando il torace aperto e l'approccio alla puntura apicale ventricolare sinistra. Rappresentativo dei tracciamenti del circuito del volume di pressione in Sham, settimana 3 dopo fenotipi AAB, MOD e HFrEF alla settimana 8 dopo l'AAB. La figura è stata modificata da Chaanine et al., Circulation: Heart Failure, 2013. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Fenotipi incontrati alla settimana 8 dopo AAB con mancata sviluppo del fenotipo ostetrao desiderato. (A) Immagini rappresentative in modalità M di animali che hanno perso il sovraccarico di pressione (PO) e non hanno sviluppato fenotipi LVH (simile a Sham) e di quelli con fenotipi po e LVH variabili (LVH moderato-lieve). (B) Rappresentazione delle immagini in modalità M di animali che hanno sviluppato gravi PO, LVH e rimodellamento concentrico (CR), ma senza (CR) o con lievi (MILD) eccentrici fenotipi rimodellanti. La figura 4B è stata modificata da Chaanine et al., Journal of American Heart Association, 2017. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Echocardiografia e parametri del ciclo pressione-volume nei diversi fenotipi. I dati sono presentati come singoli valori (punti) con mediana (linea orizzontale) nei diversi fenotipi alla settimana 8 post-AAB. I risultati dell'analisi statistica dei dati presentati nei diversi fenotipi sono riportati nella tabella 1. LVESV: volume ventricolare sinistro end-systolic, LVEF: frazione di espulsione ventricolare sinistra, EDPVR: rapporto volume di pressione end-diastolico, ESPVR: rapporto volume di pressione end-systolic, EA: arteriosa elastance. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

	Sham (n. 5)	Simile a una farsa (n. 5)	Lieve LVH (n. 8)	CR (n. 11)	MILD (n. 14)	MOD (n. 14)	HFrEF (n. 5)
Peso corporeo (g)	594 X 37	466 e 66	464 e 22	497 X 43	530 X 59	478 X 39	546 x 18
HW (mg)	1269 x 124,5	1328 - 119	1614 X 177	1645 x 191a	1821 - 169a,b	2106 - 292a,b,c,d,e	2897 - 182a,b,c,d,e,f
LVW (mg)	897 X 94	968 x 91	1161 - 144	1222 - 152a	1372 - 135a,b	1580 x 219a,b,c,d,e	1726 - 82a,b,c,d,e
RVW (mg)	218 x 22	218 x 23	266 e 24	239 x 26	249 X 26	283 : 42a,b	565 x 76a,b,c,d,e,f
IVSd (cm)	0,19 - 0,01	0,21 - 0,01	0,23 x 0,01a	0,29 - 0,01a,b,c	0,28 - 0,02a,b,c	0,28 - 0,01a,b,c	0,28 - 0,02a,b,c
LVPWd (cm)	0,20 - 0,01	0,21 - 0,02	0,24 x 0,01a,b	0,29 x 0,02a,b,c	0,28 - 0,02a,b,c	0,28 - 0,01a,b,c	0,30 - 0,02a,b,c
LVEDV (zl)	560,5 x 25,8	570 x 32	668 X 143	442 : 42,c	583 x 45d	697 x 129d,e	881,5 x 55,7a,b,c,d,e,f
LVESV (l)	105,9 x 8,9	93 X 15	111 X 20	59 : 7a,b,c	85,3 x 10,6 anni	139,7 - 22,5a,b,c,d,e	319,2 x 51,5a,b,c,d,e,f
LVEF (%)	81,1 - 1,2	83,7 x 2,9	83,1 x 2,5	86,5 x 2,2a,c	85,4 x 1,7a	79,8 x 1,9b,c,d,e	64,1 x 3,6a,b,c,d,e,f
LVPmax (mmHg)	121 - 19	126 x 23	186 x 23a,b	218 x 18a,b	221 x 22a,b,c	234 USD - 25a,b,c	262 x 16a,b,c,d,e
EDPVR (mmHg/el)	0,018 - 0,005	0,017 - 0,004	0.041 - 0.013	0,043 - 0,017	0,039 - 0,015	0,068 USD : 0,025a,b,c,d,e	0,079 - 0,017a,b,c,d,e
ESPVR/EA	1,57 x 0,67	1,96 - 0,61	2,63 x 1,52	3,35 x 1,23a	2,62 x 0,55	1,63 USD - 0,41d	0,82 - 0,24c,d,e
I dati sono presentati come media - deviazione standard. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando ANOVA unidirezionale. P < 0,05 è stato considerato significativo.
aP < 0.05 vs Sham
bP < 0.05 vs Sham-like
cP < 0.05 vs Mild-modearte LVH
dP < 0,05 vs CR
eP < 0.05 vs MILD
fP < 0.05 vs MOD
N. n. 6 n. 6
Abbreviazioni: HW: peso cardiaco, LVW: peso ventricolare sinistro, RVW: peso ventricolare destro, IVSD: spessore della parete settale in diastole, LVPWd: spessore della parete posteriore ventricolare sinistro in diastole. LVEDV: volume di diastolico ventricolare sinistro, LVESV: volume ventricolare sinistro end-stolico, LVEF: frazione di espulsione ventricolare sinistra, LVPmax: pressione massima ventricolare sinistra, EDPVR: rapporto volume di pressione end-diastolico, ESPVR: relazione volume di pressione end-stolica, EA: elastance arteriosa.

Tabella 1: parametri di ecocardiografia e volume di pressione nei fenotipi Di Sham, Simile a Sham, LVH mild-moderate, CR, MILD, MOD e HFrEF.

Discussion

In seguito all'AAB nel ratto, l'LV subisce una rimodellamento concentrico aumentando lo spessore della parete LV, noto come LVH concentrico, come meccanismo compensativo per contrastare l'aumento della sollecitazione della parete LV. L'aumento dello spessore della parete LV diventa evidente durante la prima settimana dopo AAB e raggiunge il suo spessore massimo a 2-3 settimane dopo AAB. Durante questo periodo di tempo, l'attivazione di percorsi di trasduzione del segnale disadattativo porta ad un progressivo allargamento dell'LV con aumenti dei volumi di LV, un processo noto come ipertrofia eccentrica o rimodellamento. Si prevede che il fenotipo HF nel ratto si sviluppi circa 8 settimane dopo l'AAB nella maggior parte degli animali con pochi di loro che sviluppano HF alla settimana 12 dopo l'AAB. Due fenotipi HF ne conseguono a seconda della gravità dell'AAB. Il fenotipo MOD è ottenuto attraverso la creazione di bande aortiche ascendenti (AAB) con una clip vascolare di 2 mm² di diametro interno, mentre la creazione del fenotipo HFrEF richiede AAB con una clip vascolare più stretta di 1,5 mm² di diametro interno. È importante eseguire l'ecocardiografia a 2-3 settimane dopo la fasciatura aortica ascendente per verificare la presenza di gravi LVH concentrici. Grave LVH è definito come LV settale e spessore della parete posteriore 1,5 volte normale (0,19 cm), e di solito varia tra 0,27 - 0,3 cm. Gli animali che non sviluppano LVH grave alla settimana 3 dopo AAB, saranno considerati come non riusciti AAB e non dovrebbero essere seguiti successivamente. Quelli che hanno sviluppato Grave LVH alla settimana 3 dopo AAB, saranno sottoposti a ecocardiografia alla settimana 8 dopo AAB per valutare lo sviluppo del fenotipo HF desiderato. Non è raro incontrare animali che hanno avuto gravi LVH alla settimana 3 dopo aAB per avere regressione o risoluzione di LVH alla settimana 8 dopo AAB, per motivi che affronteremo in quest'ultima sezione della discussione. Gli animali con Grave LVH e rimodellamento concentrico senza o con lieve rimodellamento eccentrico alla settimana 8 dopo AAB, quindi i fenotipi CR e MILD, rispettivamente, difficilmente svilupperà ulteriori rimodellamento eccentrico anche se sono seguiti per un mese prolungato o due. Quelli che si trovano tra il fenotipo MILD e MOD, possono sviluppare il fenotipo MOD HF se sono seguiti per un altro mese.

Il modello di ratto PO può essere frustrante a causa dell'elevata mortalità e dei tassi di fallimento^{associati 10}, nonostante l'uso di una dimensione standardizzata della clip vascolare e della tecnica chirurgica, che aumenta anche le spese di ricerca, a causa del gran numero di animali che devono sottoporsi all'AAB per raggiungere il numero obiettivo desiderato (n), e del periodo di tempo in cui gli animali devono essere seguiti prima di sviluppare il fenotipo HF desiderato. Il mancato sviluppo di LVH grave è correlato all'insuccesso banding o alla bande dell'arteria brachiocefalica destra al posto dell'aorta, che non è raro. La regressione e/o la risoluzione di LVH grave nelle successive valutazioni di follow-up è correlata alla formazione di aneurisma e al rimodellamento aortico peri-band che porta alla perdita della gravità della PO⁹. Non è chiaro perché gli animali con Grave LVH e PO sviluppino variabilità fenotipica per quanto riguarda la rimodellamento eccentrico pur avendo la stessa dimensione della clip, sesso e ceppo. Si consiglia di visualizzare l'aorta ascendente per lo screening per la ristrutturazione aortica peri-band e la formazione aneurismica. Gli animali che sviluppano aneurisma aortico ascendente 1 cm di diametro dovrebbero essere eutanasia, in quanto ciò causerà dispnea e angoscia per l'animale a causa di impingement sulle strutture circostanti. Inoltre, si consiglia di verificare il flusso turbolento attraverso la banda per colore Doppler, ma purtroppo precisa stima del gradiente di pressione attraverso la banda da Doppler continuo non è fattibile a causa dell'incapacità di allineare il Doppler continuo con la direzione del flusso sanguigno nell'aorta ascendente.

Il MOD è un fenotipo HF attraente e costituisce un'evoluzione del fenotipo HFrEF tradizionalmente creato in quanto consente di indirizzare i percorsi di trasduzione del segnale che svolgono un ruolo nel rimodellamento miocardico nelle prime fasi del processo della malattia, soprattutto quando si tratta di perturbazioni nella dinamica e nella funzione mitocondriale, metabolismo miocardio e ciclismo del calcio e rimodellamento della matrice extracellulare e rigidità miocardiale; caratteristiche che sono molto evidenti nel fenotipo MOD HF¹¹. Inoltre, la mortalità postoperatoria precoce (definita come mortalità nei primi 7 giorni post-AAB) è inferiore alla dimensione della clip di 2 mm², per la creazione del fenotipo MOD, rispetto alla dimensione della clip di 1,5 mm², per la creazione del fenotipo HFrEF¹⁰, (5% vs 21%, P - 0,009 utilizzando il test esatto di Fisher). Tuttavia, il tasso di successo tra le due dimensioni delle clip, per la creazione di fenotipi MOD e HFrEF, non è statisticamente significativo¹⁰, (20% vs 13%, P - 0,56 utilizzando il test esatto di Fisher). Inoltre, la fasciatura aortica per clip vascolare è vantaggiosa rispetto alla fasciatura aortica stringendo una sutura di nylon contro un ago da 27 G, una tecnica spesso utilizzata per costretare l'aorta trasversale nei topi, perché c'è meno variazione nelle dimensioni della clip e meno traumi all'aorta rispetto alla tecnica di sutura.

Il modello PO di HF è vantaggioso rispetto al modello di infarto miocardico (MI) di HF perché lo stress circonferenziale e meridionale della parete indotta da PO è distribuito omogeneamente in tutti i segmenti del miocardio. Tuttavia, entrambi i modelli soffrono di variabilità nella gravità di PO^10,11 e nella taglia infarto^13,14 insieme a infiammazione intensa e cicatrici nel sito infarto¹⁵ così come l'adesione alla parete toracica e ai tessuti circostanti osservati nel modello MI di HF. Inoltre, il modello HF indotto dal ratto PO è difficile da creare in quanto è associato ad alti tassi di mortalità e fallimento¹⁰, con solo il 20% dei ratti operati che sviluppano il fenotipo MOD HF¹⁰. Rispetto al modello di ratto ipertensivo (SHR) spontaneamente ipertensivo, il modello HF indotto da PO è un modello migliore per studiare i percorsi relativi al rimodellamento miocardico. L'aumento della sollecitazione della parete post-carico e miocardico nella sistole è molto più alto nel modello HF indotto da PO rispetto al modello SHR. Ci vogliono circa due anni per la SHR per sviluppare HF sistolica e il meccanismo di sistolico HF non è del tutto noto ed è confuso da invecchiamento¹⁶. Il modello SHR e altri modelli di ipertensione, come il modello di sale DOCA, sono più frequentemente utilizzati per studiare meccanismi e terapie legate all'ipertensione e possibilmente alla disfunzione diastolica¹⁶.

In conclusione, il fenotipo MOD HF è un modello interessante per studiare i percorsi di trasduzione del segnale nel contesto della ristrutturazione miocardiale e può essere utilizzato per l'applicazione e il test di potenziali strategie terapeutiche, prima della convalida della loro efficacia nei modelli animali di grandi dimensioni e nell'insufficienza cardiaca umana.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adson forceps	F.S.T.	11019-12	surgical tool
Alm chest retractor with blunt teeth	ROBOZ	RS-6510	surgical tool
Graefe forceps, curved	F.S.T.	11152-10	surgical tool
Halsted-Mosquito Hemostats, straight	F.S.T.	13010-12	surgical tool
Hardened fine iris scissors, straight	Fine Science Tools F.S.T.	14090-11	surgical tool
hemoclip traditional-stainless steel ligating clips	Weck	523735	surgical tool
Mayo-Hegar needle holder	F.S.T.	12004-18	surgical tool
mechanical ventilator	CWE inc	SAR-830/AP	mechanical ventilator for small animals
Weck stainless steel Hemoclip ligation	Weck	533140	surgical tool