Summary
我们报告一个协议，通过掺杂脂质双层铜（II）2，9，16，23-四-特-丁基-29H，31H-邻苯二甲酸酯（CuPc）分子，在水/空气界面上生产混合脂质膜。由此产生的混合脂质膜具有脂质/CuPc/脂质夹层结构。该协议也适用于其他功能纳米材料的形成。
Abstract
由于其独特的特性，包括超薄厚度（3-4纳米），超高电阻率，流动性和自组装能力，脂质双层层可以很容易地功能化，并可用于各种应用，如生物传感器和生物器件。在这项研究中，我们引入了一个平面有机分子：铜（II）2，9，16，23-四-tert-丁基-29H，31H-邻苯二甲酸酯（CuPc）掺杂脂膜。CuPc/脂质混合膜通过自组装在水/空气界面形成。在这个膜中，疏水性CuPc分子位于脂质分子的疏水尾之间，形成脂质/CuPc/脂质夹层结构。有趣的是，通过将混合膜转移到Si基板上，可以很容易形成空气稳定的混合脂质双层体。我们报告了将纳米材料整合到脂质双层系统中的直接方法，这是制造生物传感器和生物设备的新方法。
Introduction
作为细胞膜的基本框架，细胞内部通过脂质双层系统从外部分离。该系统由两栖磷脂组成，由亲水磷酯"头"和疏水脂肪酸"尾巴"组成。由于脂质双层体在水环境中具有显著的流动性和自组装能力，1、2、人工脂质双层体可以采用简单的方法3、4形成。各种类型的膜蛋白，如离子通道，膜受体和酶，已被纳入人工脂质双层，以模仿和研究细胞膜5，6的功能。最近，脂质双层体掺杂了纳米材料（如金属纳米粒子、石墨烯和碳纳米管），形成功能性混合膜7、8、9、10、11、12、13。形成这种混合膜的广泛使用的方法涉及形成掺杂脂囊泡，其中含有疏水性材料，如改性Au-nano粒子7或碳纳米管11，然后产生的囊泡被融合到平面支持的脂质双层体。然而，这种方法是复杂和耗时的，这限制了这种混合膜的潜在用途。
在这项工作中，脂质膜掺杂有机分子，以产生混合脂质膜，通过自组装在水/空气界面形成。该协议涉及三个步骤：混合溶液的制备，在水/空气界面形成混合膜，以及将膜转移到Si基板上。与以前报告的其他方法相比，此处描述的方法更简单，不需要复杂的检测。使用这种方法，可以在更短的时间内形成空气稳定的混合脂质膜，具有较大的面积。本研究中使用的纳米材料是一种半导体有机分子，铜（II）2，9，16，23-四-tert-丁基-29H，31H-邻苯二甲酸酯（CuPc），广泛应用于许多应用，包括太阳能电池、光探测器、气体传感器和催化14，15。CuPc是一种具有平面结构的小有机分子，其疏水特性对磷脂二重奏的"尾巴"具有很高的亲和力。其他组报告说，CuPc分子可以在单晶表面上自组装，形成高有序的结构16，17。因此，通过自组装，极有可能将CuPc分子并入脂质双层体。
我们详细介绍了用于形成膜的程序，并为顺利实施此程序提供了一些建议。此外，本文还提出了混合脂膜的一些现性结果，并讨论了该方法的潜在应用。
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Protocol
1. 准备混合解决方案
- 在超声波浴中清洗四个 4 mL 一次性玻璃瓶和螺钉盖（带 PTFE 涂层密封件），在蒸馏水中清洗 10 分钟（用过滤系统净化），然后分别清洗乙醇和氯仿。在氮气流中干燥玻璃瓶和瓶盖。
- 在厌氧手套箱中，在洗净的玻璃瓶中，通过溶解氯仿中的聚氯聚氯，在洗净的玻璃瓶中准备一个CuPc库存溶液（10mg/mL）。
- 通过 0.2 μm 聚四氟乙烯 （PTFE） 膜过滤 CuPc 溶液。
- 将过滤溶液存放在装满氮气的洗玻璃瓶中，用半膜密封小瓶。
- 将购买的1，2-二磷脂-糖-3-磷胆碱（DPhPC）氯仿溶液（25毫克/mL）从-80°C冰箱中取出，让其加热至室温。
- 在 2300 rpm 转速下搅拌 DPhPC 溶液，转速为 10 秒。
- 用氯仿冲洗玻璃微注射器5次。
- 使用洗涤的注射器将 200 μL 的 DPhPC 氯仿溶液转移到预洗玻璃瓶中。用温和的氮气流蒸发小瓶中的溶剂。
- 用氯仿冲洗玻璃微注射器5次。
- 使用清洁的注射器将 202.6 μL 的氯仿加入玻璃瓶中，使用 DPhPC。
- 将 47.4 μL 过滤的 10 mg/mL CuPc 溶液加入 DPhPC 溶液中。DPhPC 与 CuPc 的摩尔比应为 10：1。
- 用氯仿冲洗玻璃微注射器5次。
- 使用注射器将 250 μL 的六烷添加到溶液中。溶液的最终浓度应为10毫克/mL。
- 在 2300 rpm 的涡流混合器下混合准备好的溶液，速度为 10 秒。
- 通过 0.2 μm 聚四氟乙烯 （PTFE） 膜过滤 CuPc 溶液。
- 用副膜密封玻璃瓶。放入装满氮气的夹紧袋中，将夹紧密封袋放入 -20 °C 的冰柜中。
注：步骤1.13后，DPhPC和CuPc溶解在混合溶剂中，混合溶剂由氯仿和六烷组成（体积比为1：1）。此外，DPhPC 与 CuPc 的摩尔比不限于 10：1。脂质浓度恒定（10毫克/mL），可使用不同的摩尔比。根据先前的实验结果，形成优质混合脂膜的范围从10：1到3：1是首选。
2. 在水/空气界面形成混合膜
- 从 Si 晶圆切割 Si 基板（3 厘米 x 3 厘米）。
- 在超声波浴中清洁 3 厘米 x 3 厘米 Si 基材 10 分钟，然后用乙醇，然后清洁氯仿。用 O 2 等离子体处理 Si基板 5 分钟，以去除表面吸附的有机材料，提高亲水性。
- 用流动的纯净水清洗内径为7.5厘米的特氟隆烧杯3分钟。
- 将清洗过的 Si 基板放入洗涤的 PTFE 烧杯中。基材以 30° 的角度向水平倾斜。
- 将足够数量的纯净水倒入特氟隆烧杯中，直到整个 Si 基板被淹没。
- 将准备好的混合溶液从冰柜中取出，并加热至室温。
- 在 2300 rpm 的涡流混合器下搅拌混合溶液 15 秒。
- 用氯仿冲洗玻璃微注射器（50 μL）5次。
- 使用注射器将混合溶液的 3-5 μL 滴到水面上，形成浮动混合脂质膜。
注：当溶液掉落时，重要的是将液滴保持接近（小于 1 厘米）的水面。还应注意的是，肉眼看不到单层杂交膜，但多层杂交膜显示为薄的蓝色薄膜。为了将多层混合膜转移到Si基板，必须尽可能将混合溶液滴到Si基板附近。
3. 将膜转移到 Si 基板上
- 有机溶剂蒸发后（需要不到 2 秒），通过由渗透泵驱动的橡胶管将水泵出水，将浮动混合膜转移到 Si 基材上，从而以 3 mm/min 的速度降低水位。
- 转移过程完成后（约 5 分钟），将 Si 基板放在洁净器雨刷器上，并允许所有残留水蒸发。
注：以如此低的速度降低水位有助于最大限度地减少水的湍流并保护膜。
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Representative Results
由于存在CuPc分子，成型膜具有均匀的浅蓝色。彩色膜的面积通常为几平方厘米。在图1A和图1B中，我们显示了Si基板上混合脂膜的微观图像和原子力显微镜（AFM）图像（包括高度轮廓）。在 AFM 图像中，左上角的膜很厚，厚度为 79.4 nm，右下角的膜很薄，厚度为 4.9 nm。薄膜显示 Ra = 0.4 nm 的表面粗糙度，接近清洁的 Si 基材。此外，基于多个测量，膜厚度显示一个离散分布，5-nm 增量为18。由于DPhPC脂质双层膜的厚度约为4纳米19，可以得出结论，5纳米的薄膜是CuPc掺杂脂脂双层膜，厚膜由掺杂脂质双层膜的堆栈组成。
利用能量分散X射线（EDX）分析进一步研究Si基板上混合膜的组成。根据图2所示的数据计算， 代表性元素（如Cu、P、N和C）的原子比为0.33%、0.97%、4.06%和68.56%。考虑到在制备杂交膜时使用了3比1（DPhPC到CuPc）的摩尔比，Cu：P：N：C的理论摩尔比应为1：3：11：192，接近杂交膜中的测量元素比，表明脂质与CuPc分子之间的比在膜形成和转移过程后保持不变。
图1：用CuPc掺杂的成型混合膜。（A） 混合膜的共体显微镜图像。（B） 混合膜的AFM图像。（B） 所示的膜包括厚度为 79.4 nm 的混合多层膜和厚度为 4.9 nm 的连续单层混合膜。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：Si基板上混合膜的EDX模式。图中显示了与要素对应的元素。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在杂交膜的前体溶液中，混合有机溶剂（氯仿和六烷）而不是纯氯仿用于溶解脂质和CuPc。如果使用纯氯仿，前体溶液的密度将高于水。因此，溶液极有可能沉入水底，而不是扩散到水面上。将低密度溶剂六烷添加到前体溶液中，可确保溶液漂浮在水面上，并在溶剂蒸发后形成均匀的混合膜。还应当指出，溶液与水面接触后，会立即观察到轻微的表面波，这可能是由于膜和有机溶剂的扩散，这将改变水的表面张力。由于混合膜是超薄和脆弱的，一个小的干扰会损害膜的完整性，形成明显的裂缝。因此，为了防止进一步的损坏，最大限度地减少膜周围的气流，避免混合膜形成后水的任何振动是非常重要的。如果可能，应将特氟龙烧杯放在振动隔离台上。
成熟的 Langmuir-Blodgett （LB） 方法被广泛用于在水/空气界面形成脂质单层，其中脂质的亲水性头朝向水，而疏水性尾部则朝向空气。与LB方法不同，通过使用CuPc分子掺杂，我们的方法允许在水/空气界面上一步形成具有双层结构的混合膜。在混合膜中，假定疏水性CuPc分子位于脂质分子的疏水"尾巴"之间，形成一种耐人寻味的脂质/CuPc/脂质夹层结构。我们通过进行荧光共振能量转移（FRET）测量18证实了这一假设。
此外，我们按照上述相同的协议，使用DPhPC与CuPC的几种不同摩尔比重复薄膜形成过程。通常，低 CuPc 比率（例如，摩尔比为 20：1）会导致颜色较浅的混合膜，其面积小于使用高 CuPc 比率（例如 3：1 和 10：1）准备的混合膜。看来，CuPc分子有助于双层形成，也作为粘合剂，导致大面积膜的形成。此外，在没有脂质分子的情况下，CuPc分子往往聚集在水面上20，并在溶剂蒸发21后在固体基材上聚集。然而，在混合膜的情况下，XRD结果表明，CuPc分子没有聚合形成混合膜18中的小晶体。这表明，由于脂质的疏水"尾巴"与CuPc的相互作用，防止了CuPc分子的聚集。然而，当更多的CuPc分子被用来准备脂质溶液（如摩尔比例为1：1）时，混合膜不仅显示深蓝色，而且CuPc分子也明显地在膜中聚合。考虑到CuPc分子（1.7纳米）的大小略大于脂质分子头组的直径（约1纳米），高于3：1的摩尔比往往会导致含有聚合的CuPc分子的薄膜。在代表性实验中使用的摩尔比为10：1，是膜面积和不良聚集之间的权衡。
按照所述方案，在水/空气界面上形成具有三明治结构的混合脂质膜。通过使用CuPc分子掺杂，混合脂质膜将具有半导体分子的一些功能，包括光电子和光催化特性，这将显著扩展脂质双层结构的应用。还应当指出，掺杂材料不限于CuPc分子。我们还使用 2，9，16，23-四-tert-丁基-29H，31H-邻苯二甲酸酯三明治结构，形成了类似的混合膜 （H2PC） 和锌 2，9，16，23-四-tert-丁基-29H，31H-邻苯二甲酸酯 （ZnPC） 作为掺杂材料。其他组已经证明，表面改性Au-nano粒子，石墨烯纳米板和富勒烯可以稳定在脂质双层7，9，12。因此，有可能将脂质双层膜与其他疏水分子和纳米材料混合使用，这将进一步扩大混合脂质膜的应用范围。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了日本科学技术厅（JPMJCR14F3）的CREST项目和日本科学促进协会（19H00846和18K14120）的赠款援助支持。这项工作部分在东北大学电气通信研究所纳米电子和自旋电子学实验室进行。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Wako Chemicals | 033-08631 | |
| CuPc | Sigma-Aldrich | 423165 | |
| DPhPc | Avanti Polar Lipids | 850356C | |
| Glass vials with screw cap | Nichiden-Rike Glass Co., Ltd | 6-29801 | |
| Hexane | Wako Chemicals | 084-03421 | |
| Membrane filters | Merck Millipore Ltd. | R8CA42836 | |
| Micro-syringe | Hamilton | 80530 | |
| Peristaltic pump | Tokyo Rikakikai Co., Ltd. | 11914199 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries, Inc. | SI-0286 |
References
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