Summary
We rapporteren een protocol voor het produceren van een hybride lipide membraan op de water/lucht interface door het smeren van de lipide bilayer met koper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) moleculen. Het resulterende hybride lipidemembraan heeft een lipide/CuPc/lipide sandwichstructuur. Dit protocol kan ook worden toegepast op de vorming van andere functionele nanomaterialen.
Abstract
Vanwege hun unieke eigenschappen, waaronder een ultradunne dikte (3-4 nm), ultrahoge weerstand, vloeibaarheid en zelfassemblagevermogen, kunnen lipidebilayers gemakkelijk worden gefunctionaliseerd en zijn ze gebruikt in verschillende toepassingen zoals biosensoren en bio-apparaten. In deze studie introduceerden we een vlakke organische molecule: koper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-fthalocyanine (CuPc) om lipidemembranen te dope. De CuPc/lipide hybride membraan vormt zich op de water/lucht interface door zelfassemblage. In dit membraan bevinden zich de hydrofobe CuPc-moleculen tussen de hydrofobe staarten van lipidemoleculen, die een lipide/CuPc/lipide sandwichstructuur vormen. Interessant is dat een lucht-stabiele hybride lipide bilayer gemakkelijk kan worden gevormd door de overdracht van het hybride membraan op een Si substraat. We rapporteren een eenvoudige methode voor het opnemen van nanomaterialen in een lipide bilayer systeem, dat een nieuwe methode voor de fabricage van biosensoren en biodevices vertegenwoordigt.
Introduction
Als essentiële kaders van celmembranen, wordt het binnenland van cellen gescheiden van de buitenkant door een lipide bilayersysteem. Dit systeem bestaat uit amphifiele fosfolipiden, die bestaan uit hydrofiele fosforische ester "hoofden" en hydrofobe vetzuren "staarten". Als gevolg van opmerkelijke vloeibaarheid en zelfassemblage vermogen van lipide bilayers in waterige omgeving1,2, kunstmatige lipide bilayers kunnen worden gevormd met behulp van eenvoudige methoden3,4. Verschillende soorten membraaneiwitten, zoals ionenkanalen, membraanreceptoren en enzymen, zijn opgenomen in de kunstmatige lipidebilayer om de functies van celmembranen na te bootsen en te bestuderen5,6. Meer recent zijn lipidebilayers gedrogeerd met nanomaterialen (bijvoorbeeld metalen nanodeeltjes, grafeen en koolstofnanobuisjes) om functionele hybride membranen te vormen7,8,9,10,11,12,13. Een veelgebruikte methode voor de vorming van dergelijke hybride membranen omvat de vorming van gedopede lipide vluimen, die hydrofobe materialen zoals gemodificeerde Au-nanodeeltjes7 of koolstof nanobuisjes11bevatten, en de resulterende vesikels worden vervolgens samengevoegd tot vlakke ondersteunde lipide bilayers. Deze aanpak is echter complex en tijdrovend, wat het potentiële gebruik van dergelijke hybride membranen beperkt.
In dit werk werden lipidemembranen gedrogeerd met organische moleculen om hybride lipidemembranen te produceren die zich op de water/luchtinterface vormden door zelfassemblage. Dit protocol omvat drie stappen: voorbereiding van de gemengde oplossing, vorming van een hybride membraan op de water/luchtinterface en de overdracht van het membraan op een Si-substraat. In vergelijking met andere eerder gerapporteerde methoden is de hier beschreven methode eenvoudiger en vereist deze geen geavanceerde instrumentatie. Met behulp van deze methode kunnen luchtstalre hybride lipidenmembranen met een groter gebied in een kortere tijd worden gevormd. Het nanomateriaal dat in deze studie wordt gebruikt is een semigeleidend organisch molecuul, koper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-fthalocyanine (CuPc), dat veel wordt gebruikt in een aantal toepassingen, waaronder zonnecellen, fotodetectoren, gassensoren en katalyse14,15. CuPc, een klein organisch molecuul met een vlakke structuur, heeft een hoge affiniteit voor de "staarten" van fosfolipiden duo aan zijn hydrofobe kenmerken. Andere groepen hebben gemeld dat CuPc moleculen zelf kunnen assembleren op single-crystal oppervlakken met de vorming van hoog geordende structuren16,17. Daarom is het zeer mogelijk dat de CuPc moleculen kunnen worden opgenomen in de lipide bilayers door middel van zelfassemblage.
We geven een gedetailleerde beschrijving van de procedures die worden gebruikt om membranen te vormen en geven enkele suggesties voor een soepele uitvoering van deze procedure. Daarnaast presenteren we enkele presentatieve resultaten van de hybride lipidemembranen en bespreken we mogelijke toepassingen van deze methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van een hybride oplossing
- Was vier 4 mL wegwerpglas flacons en schroefdoppen (met PTFE gecoate afdichtingen) in een ultrasoon bad gedurende 10 minuten in gedestilleerd water (gezuiverd met een filtratiesysteem), gevolgd door respectievelijk ethanol en chloroform. Droog de glazen flacons en doppen in een stroom stikstofgas.
- Bereid in een anaerobe handschoenenkastje een CuPc-voorraadoplossing (10 mg/mL) in een gewassen glazen flacon door cupc in poedervorm op te lossen.
- Filtreer de CuPc-oplossing door een mem (PTFE) mem (0,2 μm polytetrafluorethyleen).
- Bewaar de gefilterde oplossing in een gewassen glazen flacon gevuld met stikstof en sluit de flacon af met parafilm.
- Neem de gekochte 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPhPC) chloroform oplossing (25 mg/mL) uit de -80 °C koelkast en laat het opwarmen tot kamertemperatuur.
- Roer de DPhPC-oplossing met behulp van een vortexmixer bij 2300 rpm voor 10 s.
- Spoel een glazen microspuit 5 keer af met chloroform.
- Breng 200 μL van de DPhPC chloroform oplossing over in een voorgewassen glazen flacon met behulp van de gewassen spuit. Verdamp het oplosmiddel in de flacon met een zachte stroom stikstof.
- Spoel een glazen microspuit 5 keer af met chloroform.
- Voeg 202,6 μL chloroform toe aan de glazen flacon met DPhPC met behulp van de gereinigde spuit.
- Voeg 47,4 μL gefilterde 10 mg/mL CuPc-oplossing toe aan de DPhPC-oplossing. De kiesverhouding van DPhPC naar CuPc moet 10:1 zijn.
- Spoel de glazen microspuit 5 keer af met chloroform.
- Voeg met de spuit 250 μL hexaan aan de oplossing toe. De uiteindelijke concentratie van de oplossing moet 10 mg/mL zijn.
- Meng de bereide oplossing met behulp van een vortexmixer bij 2300 rpm voor 10 s.
- Filtreer de CuPc-oplossing door een mem (PTFE) mem (0,2 μm polytetrafluorethyleen).
- Sluit de glazen flacon af met parafilm. Doe het in een afgesloten zak gevuld met stikstof en plaats de grip verzegelde zak in een vriezer op -20 °C.
OPMERKING: Na stap 1.13 werden de DPhPC en CuPc opgelost in een gemengd oplosmiddel, dat bestond uit chloroform en hexaan (volumeverhouding van 1:1). Bovendien is de kiesverhouding van DPhPC naar CuPc niet beperkt tot 10:1. Met een constante concentratie lipiden (10 mg/mL) kunnen verschillende kiesverhoudingen worden gebruikt. Volgens eerdere experimentele resultaten heeft een bereik van 10:1 tot 3:1 de voorkeur voor het vormen van een hybride lipidenmembraan van hoge kwaliteit.
2. Vorming van een hybride membraan op de water/luchtinterface
- Snijd Si substraten (3 cm x 3 cm) uit een Si wafer.
- Reinig de 3 cm x 3 cm Si substraten in een ultrasoon bad gedurende 10 minuten in gezuiverd water, gevolgd door ethanol en vervolgens chloroform. Behandel het Si-substraat met een O2-plasma gedurende 5 minuten om geadsorbeerde organische materialen van het oppervlak te verwijderen en hydrofielheid te verbeteren.
- Was een Teflon beker met een binnendiameter van 7,5 cm met stromend gezuiverd water gedurende 3 minuten.
- Doe het gereinigde Si-substraat in het gewassen PTFE bekerglas. Het substraat wordt gekanteld onder een hoek van 30° naar het horizontale vlak.
- Giet een voldoende hoeveelheid gezuiverd water in de Teflon beker tot het gehele Si substraat is ondergedompeld.
- Haal de bereide hybride oplossing uit de vriezer en laat deze opwarmen tot kamertemperatuur.
- Roer de hybride oplossing met behulp van een vortex mixer bij 2300 rpm voor 15 s.
- Spoel een glazen microspuit (50 μL) 5 keer af met chloroform.
- Laat 3-5 μL van de hybride oplossing op het wateroppervlak vallen met behulp van de spuit om een drijvend hybride lipidemembraan te vormen.
LET OP: Wanneer de oplossing wordt gedropt, is het belangrijk om de druppel dicht bij (minder dan 1 cm) het wateroppervlak te houden. Opgemerkt moet ook worden dat een enkellaags hybride membraan niet zichtbaar is met het blote oog, maar het meerlaagse hybride membraan verschijnt als dunne, blauwgekleurde film. Om het meerlaagse hybride membraan over te brengen naar het Si substraat, is het belangrijk om de gemengde oplossing zo dicht mogelijk bij het Si-substraat te laten vallen.
3. Het membraan overbrengen op een Si-substraat
- Na de verdamping van organisch oplosmiddel (het duurt minder dan 2 seconden), verlaag het waterniveau met een snelheid van 3 mm/min door het water door een rubberen buis te pompen die wordt aangedreven door een peristaltische pomp, om het drijvende hybride membraan op het Si-substraat over te brengen.
- Nadat het overdrachtsproces is voltooid (ongeveer 5 min), plaats het Si substraat op een cleanroomwisser en laat al het resterende water verdampen.
OPMERKING: Het verlagen van het waterpeil bij zo'n laag tarief dient om de turbulentie van water te minimaliseren en het membraan te beschermen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het as-gevormde membraan heeft een uniforme lichtblauwe kleur als gevolg van de aanwezigheid van CuPc moleculen. Het gebied van het gekleurde membraan is normaal meerdere vierkante centimeters. In figuur 1A en figuur 1Btonen we een microscopisch beeld en een atomair krachtmicroscoop (AFM) beeld (inclusief een hoogteprofiel) van het hybride lipidemembraan op een Si-substraat. In het AFM-beeld is het membraan linksboven dik, met een dikte van 79,4 nm en rechtsonder dun, met een dikte van 4,9 nm. Het dunne membraan toont een oppervlakteruwheid van Ra = 0,4 nm, die dicht bij dat van het gereinigde Si substraat ligt. Bovendien, op basis van meerdere metingen, tonen membraandiktes een discrete verdeling met stappen van 5 nm18. Aangezien de gerapporteerde dikte van een DPhPC lipide bilayer membraan is ongeveer 4 nm19, kan worden geconcludeerd dat de 5 nm dunne membraan is een CuPc gedoptlipide bilayer membraan en dat de dikke membranen zijn samengesteld uit stapels gedopte lipide bilayers.
Energiedispersieve röntgenanalyse (EDX) werd gebruikt om de samenstelling van het hybride membraan op het Si-substraat verder te onderzoeken. Zoals berekend op basis van de gegevens in figuur 2, de atomaire ratio's van representatieve elementen zoals Cu, P, N en C, zijn 0,33%, 0,97%, 4,06% en 68,56%. Gezien het feit dat een molaire verhouding van 3 tot 1 (DPhPC naar CuPc) werd gebruikt bij de voorbereiding van het hybride membraan, moet de theoretische kiesverhouding van Cu:P:N:C 1:3:11:192 zijn, wat dicht bij de gemeten elementverhouding in het hybride membraan ligt, wat aangeeft dat de verhouding tussen de lipiden en de CuPc-moleculen wordt gehandhaafd na de filmvorming en overdrachtsprocessen.
Figuur 1: As-formed hybride membraan gedrogeerd met CuPc. (A) Een confocale microscopie van het hybride membraan. (B) AFM-beeld van het hybride membraan. Het membraan in (B) bevat een hybride meerlaags membraan met een dikte van 79,4 nm en een aaneengesloten monolaag hybride membraan met een dikte van 4,9 nm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: EDX patroon van het hybride membraan op een Si substraat. De bijbehorende elementen aan de eigenschappen worden getoond in de figuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de voorloperoplossing van het hybride membraan wordt een gemengd organisch oplosmiddel (chloroform en hexaan) in plaats van zuiverchloroform gebruikt om lipiden en CuPc op te lossen. Als zuivere chloroform wordt gebruikt, zou de dichtheid van de precursoroplossing hoger zijn dan water. Daarom is het zeer waarschijnlijk dat de oplossing zou zinken naar de bodem van het water in plaats van verspreid over het wateroppervlak. Het toevoegen van hexaan, een oplosmiddel met een lage dichtheid, aan de precursoroplossing, zorgt ervoor dat de oplossing op het wateroppervlak zweeft en een uniform hybride membraan vormt na de verdamping van het oplosmiddel. Er moet ook worden opgemerkt dat onmiddellijk nadat de oplossing in contact kwam met het wateroppervlak, altijd een lichte oppervlaktegolf werd waargenomen, mogelijk als gevolg van de verspreiding van het membraan en het organische oplosmiddel, wat de oppervlaktespanning van water zou veranderen. Aangezien het hybride membraan ultradun en fragiel is, zou een kleine verstoring de intactheid van membraan beschadigen met zichtbare scheuren die worden gevormd. Daarom is het, om verdere schade te voorkomen, erg belangrijk om de luchtstroom rond het membraan te minimaliseren en eventuele trillingen van water na de vorming van hybride membranen te voorkomen. Indien mogelijk moet het Teflon-bekerglas op een trillingsisolatietafel worden geplaatst.
De gevestigde Langmuir−Blodgett (LB) methode wordt veel gebruikt om lipide monolayers te vormen op het water / lucht interface waar hydrofiele hoofden van de lipiden zijn gericht op het water, terwijl de hydrofobe staarten zijn gericht op de lucht. Anders dan de LB-methode, door doping met CuPc moleculen, onze methode toegestaan hybride membranen met een bilayer structuur worden gevormd op het water / lucht interface in een stap. In het hybride membraan wordt aangenomen dat de hydrofobe CuPc-moleculen zich bevinden tussen de hydrofobe "staarten" van lipidemoleculen, die een intrigerende lipide/CuPc/lipide sandwichstructuur vormen. We bevestigden deze veronderstelling door het uitvoeren van fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET) metingen18.
Daarnaast herhaalden we het filmvormingsproces met behulp van verschillende molaire verhoudingen van DPhPC naar CuPc volgens hetzelfde protocol dat hierboven is beschreven. Over het algemeen resulteerde een lage CuPc-verhouding (bijvoorbeeld een molaire verhouding van 20:1) in een hybride membraan met een lichtere kleur en een kleiner gebied dan een gebied dat is bereid met een hoge CuPc-verhouding (bijvoorbeeld 3:1 en 10:1). Het lijkt erop dat de CuPc moleculen helpen bij de bilayer vorming en ook fungeren als een lijm, wat resulteert in de vorming van membranen met grote gebieden. Bovendien hebben CuPc-moleculen bij afwezigheid van lipidemoleculen de neiging om zowel op het wateroppervlak20als op het vaste substraat na de oplosmiddelverdamping21te aggregaat . In het geval van een hybride membraan gaven xrd-resultaten echter aan dat de CuPc-moleculen niet samenvloeiden om kleine kristallen in het hybride membraan18te vormen . Dit suggereert dat de aggregatie van CuPc moleculen werd voorkomen door de interactie van hydrofobe "staarten" van lipiden met CuPc. Echter, wanneer meer CuPc moleculen werden gebruikt om een lipide oplossing voor te bereiden (zoals een kiesverhouding van 1:1), de hybride membranen tonen niet alleen een donkerder blauwe kleur, maar CuPc moleculen zijn ook zichtbaar geaggregeerd in de membranen. Gezien het feit dat de grootte van het CuPc-molecuul (1,7 nm) iets groter is dan de diameter van de hoofdgroep van het lipidemolecuul (ongeveer 1 nm), heeft een molaire verhouding hoger dan 3:1 de neiging om te resulteren in films die geaggregeerde CuPc-moleculen bevatten. De kiesverhouding van 10:1 die werd gebruikt in de representatieve experimenten is een afweging tussen het membraangebied en ongewenste aggregatie.
Volgens het beschreven protocol werden hybride lipidenmembranen met een sandwichstructuur gevormd op de water/luchtinterface. Door doping met CuPc-moleculen zou het hybride lipidemembraan een aantal functionaliteiten van semigeleidende moleculen bezitten, waaronder opto-elektronische en fotokatalytische eigenschappen, die de toepassingen van lipide bilayerstructuren aanzienlijk zouden uitbreiden. Er moet ook worden opgemerkt dat het dopingmateriaal niet beperkt is tot CUPc-moleculen. We hebben ook soortgelijke hybride membranen gevormd met lipide/Pc/lipide sandwichstructuren met behulp van 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-fthalocyanine (H2PC) en zink 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-fthalocyanine (ZnPC) als dopingmateriaal. Andere groepen hebben aangetoond dat de oppervlakte-gemodificeerde Au-nanodeeltjes, grafeen nanosheets, en fullerenen kunnen stabiliseren in de lipide bilayer7,9,12. Daarom is het mogelijk om een lipide bilayer te dopeen met andere hydrofobe moleculen en nanomaterialen, wat het scala aan toepassingen van hybride lipidemembranen verder zou uitbreiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het CREST-programma van het Japan Science and Technology Agency (JPMJCR14F3) en Grant in-Aids van de Japan Society for the Promotion of Science (19H00846 en 18K14120). Dit werk werd deels uitgevoerd in het Laboratorium voor Nano-elektronica en Spintronica, Research Institute of Electrical Communication, Tohoku University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Wako Chemicals | 033-08631 | |
| CuPc | Sigma-Aldrich | 423165 | |
| DPhPc | Avanti Polar Lipids | 850356C | |
| Glass vials with screw cap | Nichiden-Rike Glass Co., Ltd | 6-29801 | |
| Hexane | Wako Chemicals | 084-03421 | |
| Membrane filters | Merck Millipore Ltd. | R8CA42836 | |
| Micro-syringe | Hamilton | 80530 | |
| Peristaltic pump | Tokyo Rikakikai Co., Ltd. | 11914199 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries, Inc. | SI-0286 |
References
- Israelachvili, J. N., Mitchell, D. J., Ninham, B. W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 470 (2), 185-201 (1977).
- Venable, R. M., Zhang, Y., Hardy, B. J., Pastor, R. W. Molecular dynamics simulations of a lipid bilayer and of hexadecane: an investigation of membrane fluidity. Science. 262 (5131), 223-226 (1993).
- Ide, T., Ichikawa, T. A novel method for artificial lipid-bilayer formation. Biosensors and Bioelectronics. 21 (4), 672-677 (2005).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
- Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
- Demarche, S., Sugihara, K., Zambelli, T., Tiefenauer, L., Voros, J. Techniques for recording reconstituted ion channels. Analyst. 136 (6), 1077-1089 (2011).
- Sakaguchi, N., Kimura, Y., Hirano-Iwata, A., Ogino, T. Fabrication of Au-nanoparticle-embedded lipid bilayer membranes supported on solid substrates. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (17), 4474-4481 (2017).
- Schulz, M., Olubummo, A., Binder, W. H. Beyond the lipid bilayer: interaction of polymers and nanoparticles with membranes. Soft Matter. 8 (18), 4849-4864 (2012).
- Wang, J., Wei, Y., Shi, X., Gao, H. Cellular entry of graphene nanosheets: the role of thickness, oxidation and surface adsorption. RSC Advances. 3 (36), 15776-15782 (2013).
- Vögele, M., Köfinger, J., Hummer, G. Molecular dynamics simulations of carbon nanotube porins in lipid bilayers. Faraday Discussions. 209, 341-358 (2018).
- Kanomata, K., Deguchi, T., Ma, T., Haseyama, T., Miura, M., Yamaura, D., Tadaki, D., Niwano, M., Hirano-Iwata, A., Hirose, F. Photomodulation of electrical conductivity of a PCBM-doped free-standing lipid bilayer in buffer solution. Journal of Electroanalytical Chemistry. 832, 55-58 (2019).
- Barnoud, J., Rossi, G., Monticelli, L. Lipid Membranes as Solvents for Carbon Nanoparticles. Physical Review Letters. 112, 068102 (2014).
- Dichello, G. A., et al. Preparation of liposomes containing small gold nanoparticles using electrostatic interactions. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 105, 55-63 (2017).
- Sullivan, P., Heutz, S., Schultes, S. M., Jones, T. S. Influence of codeposition on the performance of CuPc−C60 heterojunction photovoltaic devices. Applied Physics Letters. 84 (7), 1210-1212 (2004).
- Miyata, T., Kawaguchi, S., Ishii, M., Minami, T. High sensitivity chlorine gas sensors using Cu−phthalocyanine thin films. Thin Solid Films. 425 (1-2), 255-259 (2003).
- Barrena, E., de Oteyza, D. G., Dosch, H., Wakayama, Y. 2D supramolecular self-assembly of binary organic monolayers. ChemPhysChem. 8 (13), 1915-1918 (2007).
- Xiao, K., et al. Surface-induced orientation control of CuPc molecules for the epitaxial growth of highly ordered organic crystals on graphene. Journal of the American Chemical Society. 135 (9), 3680-3687 (2013).
- Feng, X., Ma, T., Yamaura, D., Tadaki, D., Hirano-Iwata, A. Formation and characterization of air-stable lipid bilayer membranes incorporated with phthalocyanine molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6515-6520 (2019).
- Wu, Y., He, K., Ludtke, S. J., Huang, H. W. X-ray diffraction study of lipid bilayer membranes interacting with amphiphilic helical peptides: diphytanoyl phosphatidylcholine with alamethicin at low concentrations. Biophysical Journal. 68 (6), 2361-2369 (1995).
- Zaitseva, S. V., Bettini, S., Valli, L., Kolker, A. M., Borovkov, N. Y. Atypical film-forming behavior of soluble tetra-3-nitro-substituted copper phthalocyanine. ChemPhysChem. 20 (3), 422-428 (2019).
- Ghani, F., Gojzewski, H., Riegler, H. Nucleation and growth of copper phthalocyanine aggregates deposited from solution on planar surfaces. Applied Surface Science. 351, 969-976 (2015).
