Summary
Nous rapportons un protocole pour produire une membrane hybride de lipide à l’interface eau/air en dopant la bicouche lipidique avec des molécules de cuivre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc). La membrane lipidique hybride résultante a une structure lipidique/CuPc/lipide de sandwich. Ce protocole peut également être appliqué à la formation d’autres nanomatériaux fonctionnels.
Abstract
En raison de leurs propriétés uniques, y compris une épaisseur d’ultrathine (3-4 nm), la résistivité ultrahigh, la fluidité et la capacité d’auto-assemblage, les bicouches lipidiques peuvent être facilement fonctionnalisées et ont été utilisées dans diverses applications telles que les bio-capteurs et les bio-dispositifs. Dans cette étude, nous avons introduit une molécule organique planaire : cuivre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) pour doper les membranes lipidiques. La membrane hybride CuPc/lipide se forme à l’interface eau/air par auto-assemblage. Dans cette membrane, les molécules hydrophobes de CuPc sont situées entre les queues hydrophobes des molécules lipidiques, formant une structure de sandwich lipidique/CuPc/lipide. Fait intéressant, une bicouche lipidique hybride étanche à l’air peut être facilement formée en transférant la membrane hybride sur un substrat Si. Nous rapportons une méthode simple pour incorporer des nanomatériaux dans un système de bicouche lipidique, qui représente une nouvelle méthodologie pour la fabrication des biocapteurs et des biodevices.
Introduction
En tant que cadres essentiels des membranes cellulaires, l’intérieur des cellules est séparé de l’extérieur par un système de cale lipidique. Ce système se compose de phospholipides amphiphiliques, qui sont composés de phosphore hydrophile ester « têtes » et les acides gras hydrophobes « queues ». En raison de la fluidité remarquable et la capacité d’auto-assemblage des bicouches lipidiques dans l’environnement aqueux1,2, bicouches lipidiques artificielles peuvent être formés en utilisant des méthodessimples 3,4. Divers types de protéines membranaires, telles que les canaux imitants, les récepteurs membranaires et les enzymes, ont été incorporés dans la bicouche lipidique artificielle pour imiter et étudier les fonctions des membranescellulaires 5,6. Plus récemment, les bicouches lipidiques ont été dopées de nanomatériaux (p. ex., nanoparticules métalliques, graphène et nanotubes de carbone) pour former des membranes hybridesfonctionnelles 7,8,9,10,11,12,13. Une méthode largement utilisée pour former de telles membranes hybrides implique la formation de vésicules lipidiques dopées, qui contiennent des matériaux hydrophobes tels que les nanoparticules au-nanoparticulesmodifiées 7 ou les nanotubes decarbone 11, et les vésicules qui en résultent sont ensuite fusionnées en bicouches lipidiques planaires soutenues. Toutefois, cette approche est complexe et prend beaucoup de temps, ce qui limite les utilisations potentielles de ces membranes hybrides.
Dans ce travail, les membranes lipidiques ont été dopées avec des molécules organiques pour produire des membranes lipidiques hybrides qui se sont formées à l’interface eau/air par auto-assemblage. Ce protocole comporte trois étapes : la préparation de la solution mixte, la formation d’une membrane hybride à l’interface eau/air, et le transfert de la membrane sur un substrat Si. Comparée à d’autres méthodes précédemment rapportées, la méthode décrite ici est plus simple et ne nécessite pas d’instrumentation sophistiquée. En utilisant cette méthode, des membranes lipidiques hybrides étanches à l’air avec une plus grande surface peuvent être formées en un temps plus court. Le nanomatériau utilisé dans cette étude est une molécule organique semi-supraductrice, le cuivre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc), qui est largement utilisé dans un certain nombre d’applications, y compris les cellules solaires, les photodétecteurs, les capteurs de gaz et la catalyse14,15. CuPc, une petite molécule organique à structure planaire, a une forte affinité pour le duo « queues » de phospholipides à ses caractéristiques hydrophobes. D’autres groupes ont signalé que les molécules CuPc peuvent s’auto-assembler sur des surfaces à cristaux simples avec la formation de structurestrès ordonnées 16,17. Par conséquent, il est très possible que les molécules CuPc pourraient être incorporées dans les bicouches lipidiques par auto-assemblage.
Nous fournissons une description détaillée des procédures utilisées pour former des membranes et fournissons quelques suggestions pour la mise en œuvre en douceur de cette procédure. En outre, nous présentons quelques résultats presentatifs des membranes hybrides de lipide, et discutons des applications potentielles de cette méthode.
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Protocol
1. Préparation d’une solution hybride
- Laver quatre flacons de verre jetables de 4 mL et des bouchons à vis (avec des joints enduits PTFE) dans un bain à ultrasons pendant 10 minutes dans de l’eau distillée (purifiée avec un système de filtration), suivies respectivement d’éthanol et de chloroforme. Sécher les flacons de verre et les bouchons dans un jet de gaz azoté.
- Dans une boîte à gants anaérobie, préparer une solution de bouillon CuPc (10 mg/mL) dans un flacon de verre lavé en dissolvant le CuPc en poudre au chloroforme.
- Filtrer la solution CuPc à travers une membrane de polytétrafluoroéthylène (PTFE) de 0,2 μm.
- Conservez la solution filtrée dans un flacon de verre lavé rempli d’azote et scellez le flacon avec du parafilm.
- Sortez la solution chloroforme 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) achetée (25 mg/mL) du réfrigérateur -80 °C et laissez-la chauffer à température ambiante.
- Remuer la solution DPhPC à l’aide d’un mélangeur vortex à 2300 rpm pendant 10 s.
- Rincer une micro-seringue en verre avec du chloroforme pendant 5 fois.
- Transférer 200 μL de la solution chloroforme DPhPC dans un flacon de verre prélavé à l’aide de la seringue lavée. Évaporer le solvant dans le flacon avec un doux jet d’azote.
- Rincer une micro-seringue en verre 5 fois avec du chloroforme.
- Ajouter 202,6 μL de chloroforme au flacon de verre avec le DPhPC à l’aide de la seringue nettoyée.
- Ajouter 47,4 μL de solution CuPc filtrée de 10 mg/mL dans la solution DPhPC. Le rapport molaire de DPhPC à CuPc devrait être de 10:1.
- Rincer la micro-seringue en verre 5 fois avec du chloroforme.
- Ajouter 250 μL d’hexane à la solution à l’aide de la seringue. La concentration finale de la solution doit être de 10 mg/mL.
- Mélanger la solution préparée à l’aide d’un mélangeur vortex à 2300 rpm pendant 10 s.
- Filtrer la solution CuPc à travers une membrane de polytétrafluoroéthylène (PTFE) de 0,2 μm.
- Sceller le flacon de verre avec du parafilm. Mettez-le dans un sac scellé poignée remplie d’azote et placez le sac scellé poignée dans un congélateur à -20 °C.
REMARQUE : Après l’étape 1.13, le DPhPC et le CuPc ont été dissous dans un solvant mélangé, qui était composé de chloroforme et d’hexane (rapport de volume de 1:1). En outre, le rapport molaire de DPhPC à CuPc n’est pas limité à 10:1. Avec une concentration constante de lipides (10 mg/mL), différents rapports molaire peuvent être utilisés. Selon les résultats expérimentaux précédents, une gamme de 10:1 à 3:1 est préférée pour former une membrane lipidique hybride de haute qualité.
2. Formation d’une membrane hybride à l’interface eau/air
- Couper les substrats Si (3 cm x 3 cm) d’une gaufrette Si.
- Nettoyez les substrats Si de 3 cm x 3 cm dans un bain ultrasonique pendant 10 min dans de l’eau purifiée, suivis de l’éthanol, puis du chloroforme. Traiter le substrat Si avec un plasma O2 pendant 5 min pour enlever les matières organiques adsorbées de la surface et améliorer l’hydrophilie.
- Laver un bécher en téflon d’un diamètre intérieur de 7,5 cm avec de l’eau purifiée qui coule pendant 3 min.
- Mettez le substrat Si nettoyé dans le bécher PTFE lavé. Le substrat est incliné à un angle de 30° à l’horizontale.
- Verser une quantité suffisante d’eau purifiée dans le bécher en téflon jusqu’à ce que tout le substrat Si soit submergé.
- Sortez la solution hybride préparée du congélateur et laissez-la chauffer à température ambiante.
- Remuer la solution hybride à l’aide d’un mélangeur vortex à 2300 rpm pendant 15 s.
- Rincer une micro-seringue en verre (50 μL) 5 fois avec du chloroforme.
- Déposez 3 à 5 μL de la solution hybride à la surface de l’eau à l’aide de la seringue pour former une membrane lipidique hybride flottante.
REMARQUE : Lorsque la solution est abandonnée, il est important de maintenir la gouttelette près (moins de 1 cm) de la surface de l’eau. Il convient également de noter qu’une membrane hybride à couche unique n’est pas visible à l’œil nu, mais la membrane hybride multicposition apparaît comme mince film de couleur bleue. Afin de transférer la membrane hybride multicque vers le substrat Si, il est important de laisser tomber la solution mixte le plus près possible du substrat Si.
3. Transférer la membrane sur un substrat Si
- Après l’évaporation du solvant organique (cela prendra moins de 2 secondes), abaissez le niveau d’eau à une vitesse de 3 mm/min en pompant l’eau à travers un tube en caoutchouc qui est entraîné par une pompe périssaliste, pour transférer la membrane hybride flottante sur le substrat Si.
- Une fois le processus de transfert terminé (environ 5 min), placez le substrat Si sur un essuie-glace cleanroom et laissez toute l’eau résiduelle s’évaporer.
REMARQUE : L’abaissement du niveau d’eau à un taux aussi bas sert à minimiser la turbulence de l’eau et à protéger la membrane.
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Representative Results
La membrane telle qu’elle est formée a une couleur bleu clair uniforme en raison de la présence de molécules CuPc. La zone de la membrane colorée est normalement de plusieurs centimètres carrés. Dans la figure 1A et la figure 1B,nous montrons une image microscopique et une image au microscope à force atomique (AFM) (y compris un profil de hauteur) de la membrane lipidique hybride sur un substrat Si. Dans l’image AFM, la membrane en haut à gauche est épaisse, avec une épaisseur de 79,4 nm et celle en bas à droite est mince, avec une épaisseur de 4,9 nm. La fine membrane montre une rugosité de surface de Ra = 0,4 nm, ce qui est proche de celui du substrat Si nettoyé. En outre, sur la base de plusieurs mesures, les épaisseurs de la membrane montrent une distribution discrète avec des incréments de 5 nm18. Puisque l’épaisseur rapportée d’une membrane de bicouche lipidique de DPhPC est environ 4 nm19,on peut conclure que la membrane mince de 5 nm est une membrane dopée de bicouche de lipide de CuPc et que les membranes épaisses sont composées des piles des bicouches dopées de lipide.
L’analyse dispersive d’énergie de rayon X (EDX) a été employée pour étudier plus loin la composition de la membrane hybride sur le substrat de Si. Selon les données présentées à la figure 2,les ratios atomiques d’éléments représentatifs tels que Cu, P, N et C sont de 0,33 %, 0,97 %, 4,06 % et 68,56 %. Considérant qu’un rapport molaire de 3 pour 1 (DPhPC à CuPc) a été utilisé dans la préparation de la membrane hybride, le rapport théorique molaire de Cu:P:N:C devrait être de 1:3:11:192, ce qui est proche du rapport d’élément mesuré dans la membrane hybride, ce qui indique que le rapport entre les lipides et les molécules CuPc est maintenu après la formation du film et les processus de transfert.
Figure 1 : Membrane hybride as-formed dopée avec CuPc. (A) Une microscopie confocale de la membrane hybride. (B) Image AFM de la membrane hybride. La membrane indiquée dans (B) comprend une membrane hybride multicouche avec une épaisseur de 79,4 nm et une membrane hybride monocouche contiguë avec une épaisseur de 4,9 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Motif EDX de la membrane hybride sur un substrat Si. Les éléments correspondants aux entités sont affichés dans la figure. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Dans la solution précurseur de la membrane hybride, un solvant organique mixte (chloroforme et hexane) plutôt que du chloroforme pur est utilisé pour dissoudre les lipides et cupc. Si du chloroforme pur est utilisé, la densité de la solution précurseur serait plus élevée que l’eau. Par conséquent, il est fort probable que la solution coulerait au fond de l’eau plutôt que de se propager à la surface de l’eau. L’ajout d’hexane, un solvant de faible densité, à la solution précurseur, garantit que la solution flottera à la surface de l’eau et formera une membrane hybride uniforme après l’évaporation du solvant. Il convient également de noter que immédiatement après l’entrée en contact de la solution avec la surface de l’eau, une légère onde de surface a toujours été observée, peut-être en raison de la propagation de la membrane et du solvant organique, ce qui modifierait la tension de surface de l’eau. Comme la membrane hybride est ultrathine et fragile, une petite perturbation endommagerait l’intactité de la membrane avec la formation de fissures visibles. Par conséquent, afin d’éviter d’autres dommages, il est très important de minimiser le flux d’air autour de la membrane et d’éviter toute vibration de l’eau après la formation de membranes hybrides. Si possible, le bécher en téflon doit être placé sur une table d’isolation vibratoire.
La méthode bien établie Langmuir−Blodgett (LB) est largement utilisée pour former des monouches lipidiques à l’interface eau/air où les têtes hydrophiles des lipides sont orientées vers l’eau tandis que les queues hydrophobes sont orientées vers l’air. Différente de la méthode LB, par dopage avec les molécules CuPc, notre méthode permettait de former en une seule étape des membranes hybrides avec une structure de caleuse à l’interface eau/air. Dans la membrane hybride, on suppose que les molécules hydrophobes de CuPc sont situées entre les « queues » hydrophobes des molécules lipidiques, formant une structure intrigante de sandwich de lipide/CuPc/lipide. Nous avons confirmé cette hypothèse en effectuant des mesures de transfert d’énergie par résonance fluorescence (FRET)18.
En outre, nous avons répété le processus de formation du film en utilisant plusieurs rapports molaire différents de DPhPC à CuPc suivant le même protocole décrit ci-dessus. En général, un faible rapport CuPc (p. ex., un rapport molaire de 20:1) a donné lieu à une membrane hybride avec une couleur plus claire et une zone plus petite qu’une membrane préparée à l’aide d’un rapport CuPc élevé (p. ex. 3:1 et 10:1). Il semble que les molécules de CuPc aident à la formation de caleuse et agissent également comme adhésif, ayant pour résultat la formation des membranes avec de grandes zones. En outre, en l’absence de molécules lipidiques, les molécules de CuPc ont tendance à s’agréger à la fois à la surfacede l’eau 20, et sur le substrat solide après l’évaporation dusolvant 21. Cependant, dans le cas d’une membrane hybride, les résultats de XRD ont indiqué que les molécules de CuPc ne se sont pas agrégées pour former de petits cristaux dans la membranehybride 18. Ceci suggère que l’agrégation des molécules de CuPc ait été empêchée par l’interaction des « queues » hydrophobes des lipides avec CuPc. Cependant, lorsque plus de molécules CuPc ont été utilisées pour préparer une solution lipidique (comme un rapport molaire de 1:1), les membranes hybrides montrent non seulement une couleur bleue plus foncée, mais les molécules CuPc sont également visiblement agrégées dans les membranes. Considérant que la taille de la molécule CuPc (1,7 nm) est légèrement supérieure au diamètre du groupe de tête de la molécule lipidique (environ 1 nm), un rapport molaire supérieur à 3:1 tend à aboutir à des films contenant des molécules de CuPc agrégées. Le rapport molaire de 10:1 qui a été utilisé dans les expériences représentatives est un compromis entre la zone membranaire et l’agrégation indésirable.
Suivant le protocole décrit, des membranes lipidiques hybrides avec une structure de sandwich ont été formées à l’interface eau/air. En se dopant avec les molécules CuPc, la membrane lipidique hybride posséderait certaines des fonctionnalités des molécules semi-supraductrices, y compris les propriétés optoélectroniques et photocatalytiques, ce qui élargirait considérablement les applications des structures de bicouche lipidique. Il convient également de noter que le matériel dopant ne se limite pas aux molécules CuPc. Nous avons également formé des membranes hybrides similaires avec des structures de sandwich lipidique/Pc/lipide en utilisant 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (H2PC) et zinc 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (ZnPC) comme matériel dopant. D’autres groupes ont démontré que les nanoparticules d’Au modifiées en surface, les nanocliques de graphène et les fullerènes pouvaient se stabiliser à l’intérieur de labicouchelipidique 7,9,12. Par conséquent, il est possible de doper une bicouche lipidique avec d’autres molécules hydrophobes et nanomatériaux, ce qui élargirait encore la gamme des applications des membranes lipidiques hybrides.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par le programme CREST de l’Agence japonaise des sciences et de la technologie (JPMJCR14F3) et grant in-aids de la Japan Society for the Promotion of Science (19H00846 et 18K14120). Ces travaux ont été réalisés en partie au Laboratoire de nanoélectronique et de spintronique, Institut de recherche en communication électrique de l’Université de Tohoku.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Wako Chemicals | 033-08631 | |
| CuPc | Sigma-Aldrich | 423165 | |
| DPhPc | Avanti Polar Lipids | 850356C | |
| Glass vials with screw cap | Nichiden-Rike Glass Co., Ltd | 6-29801 | |
| Hexane | Wako Chemicals | 084-03421 | |
| Membrane filters | Merck Millipore Ltd. | R8CA42836 | |
| Micro-syringe | Hamilton | 80530 | |
| Peristaltic pump | Tokyo Rikakikai Co., Ltd. | 11914199 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries, Inc. | SI-0286 |
References
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