Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Självmontering av Hybrid Lipidmembran dopade med hydrofoba organiska molekyler vid Water/Air Interface

Published: May 1, 2020 doi: 10.3791/60957
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2
1Research Institute of Electrical Communication, Tohoku University, 2Advanced Institute for Materials Research, Tohoku University

Summary

Vi rapporterar ett protokoll för att producera en hybrid lipidmembran vid vatten/luft gränssnittet genom dopning lipid bilayer med koppar (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-ftalaocyanin (CuPc) molekyler. Den resulterande hybrid lipidmembran har en lipid / CuPc / lipid sandwich struktur. Detta protokoll kan också tillämpas på bildandet av andra funktionella nanomaterial.

Abstract

På grund av deras unika egenskaper, inklusive en ultratunn tjocklek (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluiditet och självmontering förmåga, lipid bilayers kan vara lätt funktionaliserade och har använts i olika tillämpningar såsom bio-sensorer och bio-enheter. I denna studie introducerade vi en planarisk organisk molekyl: koppar (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) till dope lipidmembran. CuPc/lipidhybridmembranet bildar vid vatten/luft-gränssnittet genom självmontering. I detta membran, de hydrofoba CuPc molekylerna är belägna mellan hydrofoba svansar av lipidmolekyler, bildar en lipid / CuPc / lipid sandwich struktur. Intressant, en luft-stabil hybrid lipid bilayer kan lätt bildas genom att överföra hybridmembranet på en Si substrat. Vi rapporterar en okomplicerad metod för att införliva nanomaterial i ett lipid bilayer system, som representerar en ny metod för tillverkning av biosensorer och bioenheter.

Introduction

Som väsentliga ramar av cellmembran, är det inre av celler separeras från det yttre av en lipid bilayer system. Detta system består av amfifila fosfolipider, som är sammansatt av hydrofila fosforester "huvuden" och hydrofoba fettsyror "svansar". På grund av anmärkningsvärda fluiditet och självmontering förmåga lipid bilayers i vattenhaltig miljö1,2, konstgjorda lipid bilayers kan bildas med hjälp av enkla metoder3,4. Olika typer av membranproteiner, såsom jonkanaler, membranreceptorer och enzymer, har införlivats i den artificiella lipidbilayern för att efterlikna och studera funktionerna hos cellmembran5,6. På senare tid har lipidbilayers dopade med nanomaterial (t.ex. metall nanopartiklar, grafen, och kol nanorör) för att bilda funktionella hybridmembran7,8,9,10,11,12,13. En allmänt använd metod för att bilda sådana hybridmembran innebär bildandet av dopade lipidblåsor, som innehåller hydrofoba material som modifierade Au-nanopartiklar7 eller kolnanorör11, och de resulterande vesiklarna smälts sedan in i planarstödda lipidbilayers. Detta tillvägagångssätt är dock komplext och tidskrävande, vilket begränsar de potentiella användningsområdena för sådana hybridmembran.

I detta arbete var lipidmembran dopade med organiska molekyler för att producera hybridlipidmembran som bildades vid vatten / luft gränssnittet genom självmontering. Detta protokoll innebär tre steg: beredning av den blandade lösningen, bildandet av ett hybridmembran vid vatten/luft-gränssnittet, och överföring av membranet på ett Si-substrat. Jämfört med andra tidigare rapporterade metoder är den metod som beskrivs här enklare och kräver inte sofistikerad instrumentering. Med denna metod kan luftstabila hybridlipidmembran med större yta bildas på kortare tid. Det nanomaterial som används i denna studie är en halvledande organisk molekyl, koppar (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-ftalaocyanin (CuPc), som ofta används i ett antal tillämpningar, inklusive solceller, fotodetektorer, gassensorer och katalys14,15. CuPc, en liten organisk molekyl med en planar struktur, har en hög affinitet för "svansar" av fosfolipider duo till dess hydrofoba egenskaper. Andra grupper har rapporterat att CuPc molekyler kan själv montera på enkristallytor med bildandet av mycket beställt strukturer16,17. Därför är det mycket möjligt att CuPc molekylerna skulle kunna införlivas i lipid bilayers genom självmontering.

Vi ger en detaljerad beskrivning av de förfaranden som används för att bilda membran och ge några förslag på smidigt genomföra denna procedur. Dessutom presenterar vi några presentativa resultat av hybrid lipidmembranen, och diskutera potentiella tillämpningar av denna metod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av en hybridlösning

  1. Tvätta fyra 4 mL engångsglasflaskor och skruvlock (med PTFE-belagda tätningar) i ett ultraljudsbad i 10 min i destillerat vatten (renat med ett filtreringssystem), följt av etanol respektive kloroform. Torka glasflaskorna och locken i en ström av kvävegas.
  2. I en anaerob handskbox, preparera en CuPc-stamlösning (10 mg/mL) i en tvättad glasflaska genom att lösa upp pulveriserad CuPc i kloroform.
  3. Filtrera CuPc-lösningen genom ett 0,2 μm polytetrafluoreten (PTFE) membran.
  4. Förvara den filtrerade lösningen i en tvättad glasflaska fylld med kväve, och försegla injektionsflaskan med parafilm.
  5. Ta den inköpta kloroformlösningen 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) (25 mg/mL) ur -80 °C-kylskåpet och låt den värmas till rumstemperatur.
  6. Rör om DPhPC-lösningen med hjälp av en vortexblandare vid 2300 rpm i 10 s.
  7. Skölj en mikrospruta av glas med kloroform i 5 gånger.
  8. Överför 200 μL av DPhPC kloroformlösningen till en förtvättad glasflaska med hjälp av den tvättade sprutan. Avdunsta lösningsmedlet i injektionsflaskan med en skonsam ström av kväve.
  9. Skölj en mikrospruta av glas 5 gånger med kloroform.
  10. Tillsätt 202,6 μL kloroform till glasflaskan med DPhPC med hjälp av den rengjorda sprutan.
  11. Tillsätt 47,4 μL filtrerad 10 mg/mL CuPc-lösning i DPhPC-lösningen. Molarförhållandet för DPhPC till CuPc ska vara 10:1.
  12. Skölj glaset mikro-spruta 5 gånger med kloroform.
  13. Tillsätt 250 μL hexan i lösningen med hjälp av sprutan. Lösningens slutliga koncentration bör vara 10 mg/mL.
  14. Blanda den beredda lösningen med hjälp av en vortexblandare vid 2300 varv/min i 10 s.
  15. Filtrera CuPc-lösningen genom ett 0,2 μm polytetrafluoreten (PTFE) membran.
  16. Täta glasflaskan med parafilm. Sätt den i ett grepp förseglade påse fylld med kväve och placera greppet förseglade påsen i en frys vid -20 °C.
    OBS: Efter steg 1.13 löstes DPhPC och CuPc i ett blandat lösningsmedel, som var sammansatt av kloroform och hexan (volymförhållandet 1:1). Dessutom är molarförhållandet för DPhPC till CuPc inte begränsat till 10:1. Med en konstant koncentration av lipider (10 mg/mL) kan olika molarförhållanden användas. Enligt tidigare experimentella resultat, ett intervall från 10:1 till 3:1 är att föredra för att bilda en högkvalitativ hybrid lipidmembran.

2. Bildande av ett hybridmembran vid vatten/luftgränssnittet

  1. Skär Si substrat (3 cm x 3 cm) från en Si wafer.
  2. Rengör 3 cm x 3 cm Si substrat i ett ultraljudsbad i 10 min i renat vatten, följt av etanol och sedan kloroform. Behandla Si-substratet med en O2-plasma i 5 min för att avlägsna adsorberade organiska material från ytan och för att förbättra hydrofiliciteten.
  3. Tvätta en Teflonbägare med en innerdiameter på 7,5 cm med strömmande renat vatten i 3 min.
  4. Sätt det rengjorda Si-substratet i den tvättade PTFE-bägaren. Underlaget lutas i en vinkel på 30° mot horisontalplanet.
  5. Häll en tillräcklig mängd renat vatten i Teflon-bägaren tills hela Si-substratet är nedsänkt.
  6. Ta beredd hybridlösning ur frysen och låt den värma till rumstemperatur.
  7. Rör om hybridlösningen med hjälp av en vortexblandare vid 2300 varv/min för 15 s.
  8. Skölj en mikrospruta i glas (50 μL) 5 gånger med kloroform.
  9. Droppa 3-5 μL av hybridlösningen på vattenytan med hjälp av sprutan för att bilda ett flytande hybridlipidmembran.
    OBS: När lösningen tappas är det viktigt att hålla droppen nära (mindre än 1 cm) vattenytan. Det bör också noteras att ett enskiktshybridmembran inte är synligt för blotta ögat, men hybridmembranet i flera lager framstår som tunn, blåfärgad film. För att överföra hybridmembranet med flera lager till Si-underlaget är det viktigt att tappa den blandade lösningen så nära Si-substratet som möjligt.

3. Att överföra membranet på ett Si-substrat

  1. Efter avdunstningen av organiskt lösningsmedel (det kommer att ta mindre än 2 sekunder), sänka vattennivån med en hastighet av 3 mm/min genom att pumpa ut vattnet genom ett gummirör som drivs av en peristaltisk pump, för att överföra det flytande hybridmembranet på Si-substratet.
  2. Efter överföringsprocessen är klar (ca 5 min), placera Si underlaget på ett renrum torkare, och låt alla kvarvarande vatten att avdunsta.
    OBS: Att sänka vattennivån vid en så låg hastighet tjänar till att minimera turbulensen i vatten och för att skydda membranet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det as-bildade membranet har en enhetlig ljusblå färg på grund av närvaron av CuPc molekyler. Området av det färgade membranet är normalt flera kvadratcentimeter. I figur 1A och figur 1B, visar vi en mikroskopisk bild och en atomic force mikroskop (AFM) bild (inklusive en höjdprofil) av hybrid lipidmembranet på en Si substrat. I AFM bilden är membranet i övre vänstra tjock, med en tjocklek på 79,4 nm och att längst ned till höger är tunn, med en tjocklek på 4,9 nm. Det tunna membranet visar en ytjämhet av Ra = 0,4 nm, som ligger nära det för det rengjorda Si-substratet. Baserat på flera mätningar visar dessutom membrantjocklekar en diskret fördelning med 5-nm steg18. Eftersom den rapporterade tjockleken på en DPhPC lipid bilayer membran är ca 4 nm19, kan man dra slutsatsen att 5 nm tunna membranet är en CuPc dopad lipid bilayer membran och att de tjocka hinnor är sammansatta av högar av dopade lipid bilayers.

Energi dispersiv röntgen (EDX) analys användes för att ytterligare undersöka sammansättningen av hybridmembranet på Si substrat. Som beräknats från de data som visas i figur 2, är de atomära nyckeltalen för representativa element som Cu, P, N och C, 0,33 %, 0,97 %, 4,06 % och 68,56 %. Med tanke på att ett molarförhållande på 3 to1 (DPhPC till CuPc) användes vid beredningen av hybridmembranet, bör det teoretiska molarförhållandet mellan Cu:P:N:C vara 1:3:11:192, vilket är nära det uppmätta elementförhållandet i hybridmembranet, vilket indikerar att förhållandet mellan lipiderna och CuPc-molekylerna bibehålls efter filmbildningen och överföringsprocesserna.

Figure 1
Figur 1: As-formed hybridmembran dopade med CuPc. (A) En konfokal mikroskopi bild av hybridmembranet. (B) AFM-bild av hybridmembranet. Membranet som visas i (B) innehåller ett hybrid flerskiktsmembran med en tjocklek på 79,4 nm och ett sammanhängande monolagerhybridmembran med en tjocklek på 4,9 nm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: EDX-mönstret av hybridmembranet på ett Si-substrat. Motsvarande element till funktionerna visas i figuren. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I hybridmembranens prekursorlösning används ett blandat organiskt lösningsmedel (kloroform och hexan) snarare än ren kloroform för att lösa upp lipider och CuPc. Om ren kloroform används skulle tätheten av prekursorlösningen vara högre än vatten. Därför är det mycket troligt att lösningen skulle sjunka till botten av vatten snarare än sprids på vattenytan. Lägga hexan, en låg densitet lösningsmedel, till föregångaren lösning, säkerställer att lösningen kommer att flyta på vattenytan och bilda en enhetlig hybridmembran efter avdunstning av lösningsmedlet. Det bör också noteras att omedelbart efter det att lösningen kommer i kontakt med vattenytan, observerades alltid en liten ytvåg, möjligen på grund av att membranet och det organiska lösningsmedlet sprids, vilket skulle förändra vattens ytspänning. Eftersom hybridmembranet är ultratunna och ömtåligt skulle en liten störning skada membrans intakthet med synliga sprickor som bildas. För att förhindra ytterligare skador är det därför mycket viktigt att minimera luftflödet runt membranet och för att undvika eventuella vibrationer av vatten efter bildandet av hybridmembran. Om möjligt ska Teflon-bägaren placeras på ett vibrationsisoleringsbord.

Den väletablerade Langmuir−Blodgett -metoden används i stor utsträckning för att bilda lipidmonolager vid vatten/luftgränssnittet där hydrofila huvuden av lipiderna är orienterade mot vattnet medan de hydrofoba svansarna är orienterade mot luften. Skiljer sig från LB-metoden, genom dopning med CuPc molekyler, vår metod tillåtna hybridmembran med en bilayer struktur som skall bildas vid vatten / luft gränssnittet i ett steg. I hybridmembranet antas att de hydrofoba CuPc-molekylerna är belägna mellan de hydrofoba "svansarna" av lipidmolekyler, som bildar en spännande lipid/CuPc/lipid sandwichstruktur. Vi bekräftade detta antagande genom att genomföra fluorescens resonans energiöverföring (FRET) mätningar18.

Dessutom upprepade vi filmbildningsprocessen med hjälp av flera olika molar nyckeltal av DPhPC till CuPc följer samma protokoll som beskrivs ovan. Generellt resulterade ett lågt CuPc-förhållande (t.ex. molarförhållandet 20:1) i ett hybridmembran med en ljusare färg och ett mindre område än ett som förberetts med hjälp av ett högt CuPc-förhållande (t.ex. 3:1 och 10:1). Det verkar som om CuPc molekylerna bistå i bilayerbildningen och även fungera som ett lim, vilket resulterar i bildandet av membran med stora områden. Dessutom, i avsaknad av lipidmolekyler, CuPc molekyler tenderar att aggregera på både vattenytan20, och på det fasta substratet efter lösningsmedlet avdunstning21. När det gäller ett hybridmembran indikerade dock XRD-resultaten att CuPc-molekylerna inte samlades ihop för att bilda små kristaller ihybridmembranet 18. Detta tyder på att aggregering av CuPc molekyler förhindrades av samspelet mellan hydrofoba "svansar" av lipider med CuPc. Men när fler CuPc molekyler användes för att förbereda en lipidlösning (såsom ett molarförhållande på 1:1), hybridmembranen inte bara visa en mörkare blå färg men CuPc molekyler är också synligt aggregeras i membranen. Med tanke på att storleken på CuPc-molekylen (1,7 nm) är något större än diametern på den head gruppen av lipidmolekylen (ca 1 nm), tenderar ett molarförhållande högre än 3:1 att resultera i filmer som innehåller aggregerade CuPc molekyler. Molarförhållandet 10:1 som användes i de representativa experimenten är en avvägning mellan membranområdet och oönskad aggregering.

Efter det beskrivna protokollet bildades hybrid lipidmembran med en sandwichstruktur vid vatten/luft-gränssnittet. Genom dopning med CuPc molekyler, hybrid lipidmembranet skulle ha några av funktionaliteter halvledande molekyler, inklusive optoelektroniska och fotokatalytiska egenskaper, vilket avsevärt skulle utöka tillämpningarna av lipid bilayer strukturer. Det bör också noteras att dopningsmaterialet inte är begränsat till CuPc-molekyler. Vi har också bildat liknande hybridmembran med lipid/Pc/lipidsmörgåsstrukturer genom att använda 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyan ine (H2PC) och zink 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (ZnPC) som de doping material. Andra grupper har visat att de ytmodifierade Au-nanopartiklarna, grafennanoarken och fullerenerna kunde stabiliseras inuti lipidbilayern7,9,12. Därför är det möjligt att dope en lipid bilayer med andra hydrofoba molekyler och nanomaterial, som skulle ytterligare utöka utbudet av tillämpningar av hybrid lipidmembran.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av CREST-programmet från Japan Science and Technology Agency (JPMJCR14F3) och Grant in-Aids från Japan Society for the Promotion of Science (19H00846 och 18K14120). Detta arbete utfördes delvis vid Laboratoriet för nanoelektronik och spintronik, Forskningsinstitutet för elektrisk kommunikation, Tohoku University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Wako Chemicals 033-08631
CuPc Sigma-Aldrich 423165
DPhPc Avanti Polar Lipids 850356C
Glass vials with screw cap Nichiden-Rike Glass Co., Ltd 6-29801
Hexane Wako Chemicals 084-03421
Membrane filters Merck Millipore Ltd. R8CA42836
Micro-syringe Hamilton 80530
Peristaltic pump Tokyo Rikakikai Co., Ltd. 11914199
Vortex mixer Scientific Industries, Inc. SI-0286

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Israelachvili, J. N., Mitchell, D. J., Ninham, B. W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 470 (2), 185-201 (1977).
  2. Venable, R. M., Zhang, Y., Hardy, B. J., Pastor, R. W. Molecular dynamics simulations of a lipid bilayer and of hexadecane: an investigation of membrane fluidity. Science. 262 (5131), 223-226 (1993).
  3. Ide, T., Ichikawa, T. A novel method for artificial lipid-bilayer formation. Biosensors and Bioelectronics. 21 (4), 672-677 (2005).
  4. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  5. Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
  6. Demarche, S., Sugihara, K., Zambelli, T., Tiefenauer, L., Voros, J. Techniques for recording reconstituted ion channels. Analyst. 136 (6), 1077-1089 (2011).
  7. Sakaguchi, N., Kimura, Y., Hirano-Iwata, A., Ogino, T. Fabrication of Au-nanoparticle-embedded lipid bilayer membranes supported on solid substrates. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (17), 4474-4481 (2017).
  8. Schulz, M., Olubummo, A., Binder, W. H. Beyond the lipid bilayer: interaction of polymers and nanoparticles with membranes. Soft Matter. 8 (18), 4849-4864 (2012).
  9. Wang, J., Wei, Y., Shi, X., Gao, H. Cellular entry of graphene nanosheets: the role of thickness, oxidation and surface adsorption. RSC Advances. 3 (36), 15776-15782 (2013).
  10. Vögele, M., Köfinger, J., Hummer, G. Molecular dynamics simulations of carbon nanotube porins in lipid bilayers. Faraday Discussions. 209, 341-358 (2018).
  11. Kanomata, K., Deguchi, T., Ma, T., Haseyama, T., Miura, M., Yamaura, D., Tadaki, D., Niwano, M., Hirano-Iwata, A., Hirose, F. Photomodulation of electrical conductivity of a PCBM-doped free-standing lipid bilayer in buffer solution. Journal of Electroanalytical Chemistry. 832, 55-58 (2019).
  12. Barnoud, J., Rossi, G., Monticelli, L. Lipid Membranes as Solvents for Carbon Nanoparticles. Physical Review Letters. 112, 068102 (2014).
  13. Dichello, G. A., et al. Preparation of liposomes containing small gold nanoparticles using electrostatic interactions. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 105, 55-63 (2017).
  14. Sullivan, P., Heutz, S., Schultes, S. M., Jones, T. S. Influence of codeposition on the performance of CuPc−C60 heterojunction photovoltaic devices. Applied Physics Letters. 84 (7), 1210-1212 (2004).
  15. Miyata, T., Kawaguchi, S., Ishii, M., Minami, T. High sensitivity chlorine gas sensors using Cu−phthalocyanine thin films. Thin Solid Films. 425 (1-2), 255-259 (2003).
  16. Barrena, E., de Oteyza, D. G., Dosch, H., Wakayama, Y. 2D supramolecular self-assembly of binary organic monolayers. ChemPhysChem. 8 (13), 1915-1918 (2007).
  17. Xiao, K., et al. Surface-induced orientation control of CuPc molecules for the epitaxial growth of highly ordered organic crystals on graphene. Journal of the American Chemical Society. 135 (9), 3680-3687 (2013).
  18. Feng, X., Ma, T., Yamaura, D., Tadaki, D., Hirano-Iwata, A. Formation and characterization of air-stable lipid bilayer membranes incorporated with phthalocyanine molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6515-6520 (2019).
  19. Wu, Y., He, K., Ludtke, S. J., Huang, H. W. X-ray diffraction study of lipid bilayer membranes interacting with amphiphilic helical peptides: diphytanoyl phosphatidylcholine with alamethicin at low concentrations. Biophysical Journal. 68 (6), 2361-2369 (1995).
  20. Zaitseva, S. V., Bettini, S., Valli, L., Kolker, A. M., Borovkov, N. Y. Atypical film-forming behavior of soluble tetra-3-nitro-substituted copper phthalocyanine. ChemPhysChem. 20 (3), 422-428 (2019).
  21. Ghani, F., Gojzewski, H., Riegler, H. Nucleation and growth of copper phthalocyanine aggregates deposited from solution on planar surfaces. Applied Surface Science. 351, 969-976 (2015).

Tags

Kemi Lipid bilayers organisk molekyl tunn film vatten/luft gränssnitt självmontering hybrid lipidmembran
Självmontering av Hybrid Lipidmembran dopade med hydrofoba organiska molekyler vid Water/Air Interface
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, X., Ma, T., Tadaki, D.,… More

Feng, X., Ma, T., Tadaki, D., Hirano-Iwata, A. Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface. J. Vis. Exp. (159), e60957, doi:10.3791/60957 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter