Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Selvsamling af hybridlipidmembraner dopede med hydrofobe organiske molekyler på Vand / Air Interface

Published: May 1, 2020 doi: 10.3791/60957
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2
1Research Institute of Electrical Communication, Tohoku University, 2Advanced Institute for Materials Research, Tohoku University

Summary

Vi rapporterer en protokol for fremstilling af en hybrid lipid membran på vand / luft interface ved doping lipid tolags med kobber (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanin (CuPc) molekyler. Den resulterende hybrid lipid membran har en lipid / CuPc / lipid sandwich struktur. Denne protokol kan også anvendes på dannelsen af andre funktionelle nanomaterialer.

Abstract

På grund af deres unikke egenskaber, herunder en ultratynd tykkelse (3-4 nm), ultrahøj resistivitet, fluiditet og selv-samling evne, lipid tolags kan let funktionaliseres og har været brugt i forskellige applikationer såsom bio-sensorer og bio-enheder. I denne undersøgelse introducerede vi et planar organisk molekyle: kobber (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanin (CuPc) til dope lipidmembraner. CuPc/lipidhybridmembranen dannes ved vand-/luftgrænsefladen ved selvmontering. I denne membran er de hydrofobe CuPc molekyler placeret mellem de hydrofobe haler af lipidmolekyler, danner en lipid / CuPc / lipid sandwich struktur. Interessant, en luft-stabil hybrid lipid tolags let kan dannes ved at overføre hybridmembranen på en Si substrat. Vi rapporterer en enkel metode til at indarbejde nanomaterialer i et lipidtayer-system, som repræsenterer en ny metode til fremstilling af biosensorer og biodevicer.

Introduction

Som væsentlige rammer for cellemembraner, er det indre af celler adskilt fra ydersiden af en lipid tolagssystem. Dette system består af amfifile fosfolipider, som består af hydrofile fosforester "hoveder" og hydrofobe fedtsyrer "haler". På grund af bemærkelsesværdig fluiditet og selvsamling evne lipid tolags i vandigemiljø 1,2,kunstige lipid tolags kan dannes ved hjælp af enklemetoder 3,4. Forskellige typer af membran proteiner, såsom ion kanaler, membran receptorer og enzymer, er blevet indarbejdet i den kunstige lipid tolags at efterligne og studere funktionerne i cellemembraner5,6. På det seneste er lipid-tolags blevet dotet med nanomaterialer (f.eks. metalnanopartikler, grafen og kulstofnanorør) til at danne funktionelle hybridmembraner7,8,9,10,11,12,13. En udbredt metode til at danne sådanne hybride membraner indebærer dannelsen af dotet lipid vesikler, som indeholder hydrofobe materialer såsom modificerede Au-nanopartikler7 eller kulstof nanorør11, og de resulterende vesikler er derefter smeltet ind planar understøttede lipid billagere. Denne fremgangsmåde er imidlertid kompleks og tidskrævende, hvilket begrænser de potentielle anvendelser af sådanne hybride membraner.

I dette arbejde blev lipidmembraner doteret med organiske molekyler til at producere hybrid lipid membraner, der dannes ved vand / luft interface ved selv-samling. Denne protokol omfatter tre trin: forberedelse af den blandede opløsning, dannelse af en hybrid membran ved vand/luft-grænsefladen og overførsel af membranen til et Si-substrat. Sammenlignet med andre tidligere rapporterede metoder er den metode, der er beskrevet her, enklere og kræver ikke avanceret instrumentering. Ved hjælp af denne metode kan luftstænde hybridlipidmembraner med et større område dannes på kortere tid. Nanomaterialet, der anvendes i denne undersøgelse, er et halvledende organisk molekyle, kobber (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanin (CuPc), som er meget udbredt i en række anvendelser, herunder solceller, fotodetektorer, gassensorer og katalyse14,15. CuPc, et lille organisk molekyle med en planar struktur, har en høj affinitet for "haler" af fosfolipider duo til sine hydrofobe egenskaber. Andre grupper har rapporteret, at CuPc molekyler kan selv samle på enkelt-krystal overflader med dannelsen af højt bestiltestrukturer 16,17. Derfor er det meget muligt, at CuPc molekyler kunne indarbejdes i lipid tolags gennem selv-samling.

Vi giver en detaljeret beskrivelse af de procedurer, der anvendes til at danne membraner og give nogle forslag til en smidig gennemførelse af denne procedure. Derudover præsenterer vi nogle præsentative resultater af hybridlipidmembraner og diskuterer potentielle anvendelser af denne metode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udarbejdelse af en hybrid opløsning

  1. Fire 4 ml engangsglasglas og skruehætter (med PTFE-belagte tætninger) vaskes i et ultralydsbad i 10 minutter i destilleret vand (renset med et filtreringssystem), efterfulgt af henholdsvis ethanol og chloroform. Tør glashætteglas og hætter i en strøm af nitrogengas.
  2. I en anaerob handskeboks klargøres en CuPc-lageropløsning (10 mg/ml) i et vasket glashætteglas ved at opløse pulveriseret CuPc i chloroform.
  3. CuPc-opløsningen filtreres gennem en 0,2 μm polytetrafluorethylenmembran ( PTFE).
  4. Den filtrerede opløsning opbevares i et vasket glasglas fyldt med nitrogen, og hætteglasset forsegles med parafilm.
  5. Tag den købte chloroformopløsning (25 mg/ml) af -80 °C køleskabet og lad den varme til stuetemperatur.
  6. Rør DPhPC-opløsningen ved hjælp af en vortex mixer ved 2300 omdrejninger i minuttet i 10 s.
  7. Skyl en glasmikrosprøjte med kloroform i 5 gange.
  8. 200 μL af DPhPC-chlorformopløsningen overføres til et forvasket glashætteglas med den vaskede sprøjte. Opløsningsmiddelet fordampes i hætteglasset med en skånsom nitrogenstrøm.
  9. Skyl en glasmikrosprøjte 5 gange med kloroform.
  10. Der tilsættes 202,6 μL chloroform til glashætteglasset med DPhPC ved hjælp af den rensede sprøjte.
  11. Der tilsættes 47,4 μL filtreret 10 mg/ml CuPc-opløsning i DPhPC-opløsningen. Molarforholdet mellem DPhPC og CuPc skal være 10:1.
  12. Skyl glasmikrosprøjten 5 gange med kloroform.
  13. Der tilsættes 250 μL hexan til opløsningen ved hjælp af sprøjten. Opløsningens endelige koncentration skal være 10 mg/ml.
  14. Bland den forberedte opløsning ved hjælp af en vortex mixer ved 2300 rpm for 10 s.
  15. CuPc-opløsningen filtreres gennem en 0,2 μm polytetrafluorethylenmembran ( PTFE).
  16. Glashætteglasset forsegles med parafilm. Sæt den i en grebslukket pose fyldt med nitrogen og læg grebet forseglet pose i en fryser ved -20 °C.
    BEMÆRK: Efter trin 1.13 blev DPhPC og CuPc opløst i et blandet opløsningsmiddel, som bestod af chloroform og hexan (volumenforhold på 1:1). Desuden er kindtandforholdet mellem DPhPC og CuPc ikke begrænset til 10:1. Med en konstant koncentration af lipider (10 mg/ml), forskellige kindtand nøgletal kan anvendes. Ifølge tidligere eksperimentelle resultater, et interval fra 10:1 til 3:1 foretrækkes for at danne en høj kvalitet hybrid lipid membran.

2. Dannelse af en hybridmembran ved vand-/luftgrænsefladen

  1. Skær Si substrater (3 cm x 3 cm) fra en Si wafer.
  2. Rengør de 3 cm x 3 cm Si substrater i et ultralydsbad i 10 minutter i renset vand, efterfulgt af ethanol og derefter kloroform. Behandl Si-substratet med et O2 plasma i 5 minutter for at fjerne adsorberede organiske materialer fra overfladen og for at forbedre hydrofiliciteten.
  3. Vask et Teflon bægerglas med en indre diameter på 7,5 cm med strømmende renset vand i 3 min.
  4. Sæt det rensede Si-underlag i det vaskede PTFE-bægerglas. Underlaget vippes i en vinkel på 30° til vandret.
  5. Hæld en tilstrækkelig mængde renset vand i Teflon bægerglas, indtil hele Si substrat er nedsænket.
  6. Tag forberedt hybrid opløsning ud af fryseren og lad den varme til stuetemperatur.
  7. Rør hybrid opløsning ved hjælp af en vortex mixer på 2300 rpm for 15 s.
  8. Skyl en glasmikrosprøjte (50 μL) 5 gange med kloroform.
  9. Drop 3-5 μL af hybridopløsningen på vandoverfladen ved hjælp af sprøjten til at danne en flydende hybrid lipidmembran.
    BEMÆRK: Når opløsningen tabes, er det vigtigt at holde dråben tæt på (mindre end 1 cm) vandoverfladen. Det skal også bemærkes, at en enkelt-lags hybrid membran ikke er synlig for det blotte øje, men multi-lag hybrid membran vises som tynd, blå-farvet film. For at overføre multilagshybridmembranen til Si-substratet er det vigtigt at slippe den blandede opløsning så tæt som muligt på Si-substratet.

3. Overførsel af membranen på et Si-substrat

  1. Efter fordampning af organisk opløsningsmiddel (det vil tage mindre end 2 sekunder), sænke vandstanden med en hastighed på 3 mm / min ved at pumpe ud af vandet gennem et gummirør, som er drevet af en peristaltisk pumpe, at overføre den flydende hybrid membran på Si substrat.
  2. Når overførslen er afsluttet (ca. 5 min), skal Si-underlaget sættes på en renrumsvisker, og alt resterende vand fordampes.
    BEMÆRK: At sænke vandstanden ved en så lav hastighed tjener til at minimere turbulensen af vand og for at beskytte membranen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den somformede membran har en ensartet lyseblå farve på grund af tilstedeværelsen af CuPc molekyler. Arealet af den farvede membran er normalt flere kvadratcentimeter. I figur 1A og figur 1Bviser vi et mikroskopisk billede og et atomkraftmikroskop (AFM) billede (herunder en højdeprofil) af hybridlipidmembranen på et Si-substrat. I AFM billedet, membranen i øverste venstre er tyk, med en tykkelse på 79,4 nm, og at der i nederste højre er tynd, med en tykkelse på 4,9 nm. Den tynde membran viser en overflade ruhed af Ra = 0,4 nm, som er tæt på den rensede Si substrat. Desuden viser membrantykkelser baseret på flere målinger en diskret fordeling med intervaller på 5 nm18. Da den rapporterede tykkelse af en DPhPC lipid tolagsmembran er omkring 4 nm19, kan det konkluderes, at den 5 nm tynde membran er en CuPc doteret lipid billags membran, og at de tykke membraner er sammensat af stakke af dopede lipid tolags.

Energisprednings-X-ray (EDX) analyse blev brugt til yderligere at undersøge sammensætningen af hybridmembranen på Si substratet. Som beregnet ud fra de data, der er vist i figur 2, er de atomare nøgletal for repræsentative elementer som Cu, P, N og C 0,33 %, 0,97 %, 4,06 % og 68,56 %. I betragtning af, at der blev anvendt et kindtandforhold på 3 til1 (DPhPC til CuPc) ved klargøring af hybridmembranen, bør det teoretiske kindtandforhold for Cu:P:N:C være 1:3:11:192, hvilket er tæt på det målte elementforhold i hybridmembranen, hvilket indikerer, at forholdet mellem lipiderne og CuPc-molekylerne opretholdes efter filmdannelses- og overførselsprocesserne.

Figure 1
Figur 1: Som dannet hybrid membran dotet med CuPc. (A) Et konfokal mikroskopibillede af hybridmembranen. (B) AFM-billede af hybridmembranen. Membranen i (B) omfatter en hybrid flerlagsmembran med en tykkelse på 79,4 nm og en sammenhængende monolayer hybrid membran med en tykkelse på 4,9 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: EDX-mønsteret af hybridmembranen på et Si-substrat. Tilsvarende elementer til funktionerne vises i figuren. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I den prækursoropløsning af hybridmembranen anvendes et blandet organisk opløsningsmiddel (chloroform og hexan) i stedet for ren kloroform til at opløse lipider og CuPc. Hvis der anvendes ren chloroform, vil tætheden af prækursoropløsningen være højere end vand. Derfor er det meget sandsynligt, at opløsningen ville synke til bunden af vandet i stedet spredes på vandoverfladen. Tilsætning hexan, en lav densitet opløsningsmiddel, til forløberen løsning, sikrer, at opløsningen vil flyde på vandoverfladen og danner en ensartet hybrid membran efter fordampning af opløsningsmidlet. Det skal også bemærkes, at umiddelbart efter opløsningen kommer i kontakt med vandoverfladen, en svag overfladebølge blev altid observeret, muligvis på grund af spredningen af membranen og det organiske opløsningsmiddel, hvilket ville ændre overfladespændingen af vand. Da hybridmembranen er ultratynde og skrøbelig, ville en lille forstyrrelse skade membranens intakthed med synlige revner, der dannes. For at undgå yderligere skader er det derfor meget vigtigt at minimere luftstrømmen omkring membranen og undgå vandvibrationer efter dannelsen af hybridmembraner. Hvis det er muligt, skal Teflon bægeret placeres på et vibrationsisolationsbord.

Den veletablerede Langmuir−Blodgett (LB) metode er almindeligt anvendt til at danne lipid monolag på vand / luft interface, hvor hydrofile hoveder af lipider er orienteret mod vandet, mens de hydrofobe haler er orienteret mod luften. Forskellig fra LB metode, ved doping med CuPc molekyler, vores metode tilladt hybridmembraner med en tolags struktur, der skal dannes på vand / luft interface i ét trin. I hybridmembranen antages det, at de hydrofobe CuPc molekyler er placeret mellem de hydrofobe "haler" af lipid molekyler, danner en spændende lipid / CuPc / lipid sandwich struktur. Vi bekræftede denne antagelse ved at gennemføre fluorescens resonans energioverførsel (FRET) målinger18.

Derudover gentog vi filmdannelsesprocessen ved hjælp af flere forskellige molarforhold mellem DPhPC og CuPc efter den samme protokol, der er beskrevet ovenfor. Generelt resulterede et lavt CuPc-forhold (f.eks. molære forhold på 20:1) i en hybridmembran med en lysere farve og et mindre areal end et, der blev fremstillet ved hjælp af et højt CuPc-forhold (f.eks. 3:1 og 10:1). Det fremgår, at CuPc molekyler hjælpe i tolagsdannelse og fungerer også som et klæbemiddel, hvilket resulterer i dannelsen af membraner med store områder. Desuden, i mangel af lipid molekyler, CuPc molekyler tendens til at samle på bådevandoverfladen 20, og på det faste substrat efter opløsningsmidlet fordampning21. I tilfælde af en hybrid membran viste XRD-resultaterne imidlertid, at CuPc-molekylerne ikke samlede sig for små krystaller ihybridmembranen 18. Dette tyder på, at sammenlægningen af CuPc molekyler blev forhindret ved samspillet mellem hydrofobe "haler" af lipider med CuPc. Men når flere CuPc molekyler blev brugt til at forberede en lipid løsning (såsom en kindtand forhold på 1:1), hybrid membraner ikke kun vise en mørkere blå farve, men CuPc molekyler er også synligt aggregeret i membraner. I betragtning af at størrelsen af CuPc molekyle (1,7 nm) er lidt større end diameteren af hovedgruppen af lipidmolekylet (ca. 1 nm), har et kindtandforhold højere end 3:1 tendens til at resultere i film, der indeholder aggregerede CuPc-molekyler. Molarforholdet på 10:1, der blev anvendt i de repræsentative forsøg, er en afvejning mellem membranområdet og uønsket sammenlægning.

Efter den beskrevne protokol blev hybridlipidmembraner med en sandwichstruktur dannet ved vand-/luftgrænsefladen. Ved doping med CuPc molekyler, hybrid lipid membran ville have nogle af funktionaliteter af halvledende molekyler, herunder optoelektroniske og fotokatalytiske egenskaber, som ville udvide anvendelser af lipid tolags strukturer. Det skal også bemærkes, at dopingmaterialet ikke er begrænset til CuPc molekyler. Vi har også dannet lignende hybridmembraner med lipid / Pc / lipid sandwich strukturer ved hjælp af 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (H2PC) og zink 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanin (ZnPC) som dopingmateriale. Andre grupper har vist, at de overflade-modificerede Au-nanopartikler, grafen nanoark, og fullerenes kunne stabilisere inde i lipid tolags7,9,12. Derfor er det muligt at dope en lipid tolags med andre hydrofobe molekyler og nanomaterialer, hvilket yderligere vil udvide rækken af anvendelser af hybrid lipid membraner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af CREST-programmet fra Japan Science and Technology Agency (JPMJCR14F3) og Grant in-Aids fra Japan Society for the Promotion of Science (19H00846 og 18K14120). Dette arbejde blev delvist udført på Laboratoriet for Nanoelektronik og Spintronics, Forskningsinstitut for Elektrisk Kommunikation, Tohoku University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Wako Chemicals 033-08631
CuPc Sigma-Aldrich 423165
DPhPc Avanti Polar Lipids 850356C
Glass vials with screw cap Nichiden-Rike Glass Co., Ltd 6-29801
Hexane Wako Chemicals 084-03421
Membrane filters Merck Millipore Ltd. R8CA42836
Micro-syringe Hamilton 80530
Peristaltic pump Tokyo Rikakikai Co., Ltd. 11914199
Vortex mixer Scientific Industries, Inc. SI-0286

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Israelachvili, J. N., Mitchell, D. J., Ninham, B. W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 470 (2), 185-201 (1977).
  2. Venable, R. M., Zhang, Y., Hardy, B. J., Pastor, R. W. Molecular dynamics simulations of a lipid bilayer and of hexadecane: an investigation of membrane fluidity. Science. 262 (5131), 223-226 (1993).
  3. Ide, T., Ichikawa, T. A novel method for artificial lipid-bilayer formation. Biosensors and Bioelectronics. 21 (4), 672-677 (2005).
  4. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  5. Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
  6. Demarche, S., Sugihara, K., Zambelli, T., Tiefenauer, L., Voros, J. Techniques for recording reconstituted ion channels. Analyst. 136 (6), 1077-1089 (2011).
  7. Sakaguchi, N., Kimura, Y., Hirano-Iwata, A., Ogino, T. Fabrication of Au-nanoparticle-embedded lipid bilayer membranes supported on solid substrates. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (17), 4474-4481 (2017).
  8. Schulz, M., Olubummo, A., Binder, W. H. Beyond the lipid bilayer: interaction of polymers and nanoparticles with membranes. Soft Matter. 8 (18), 4849-4864 (2012).
  9. Wang, J., Wei, Y., Shi, X., Gao, H. Cellular entry of graphene nanosheets: the role of thickness, oxidation and surface adsorption. RSC Advances. 3 (36), 15776-15782 (2013).
  10. Vögele, M., Köfinger, J., Hummer, G. Molecular dynamics simulations of carbon nanotube porins in lipid bilayers. Faraday Discussions. 209, 341-358 (2018).
  11. Kanomata, K., Deguchi, T., Ma, T., Haseyama, T., Miura, M., Yamaura, D., Tadaki, D., Niwano, M., Hirano-Iwata, A., Hirose, F. Photomodulation of electrical conductivity of a PCBM-doped free-standing lipid bilayer in buffer solution. Journal of Electroanalytical Chemistry. 832, 55-58 (2019).
  12. Barnoud, J., Rossi, G., Monticelli, L. Lipid Membranes as Solvents for Carbon Nanoparticles. Physical Review Letters. 112, 068102 (2014).
  13. Dichello, G. A., et al. Preparation of liposomes containing small gold nanoparticles using electrostatic interactions. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 105, 55-63 (2017).
  14. Sullivan, P., Heutz, S., Schultes, S. M., Jones, T. S. Influence of codeposition on the performance of CuPc−C60 heterojunction photovoltaic devices. Applied Physics Letters. 84 (7), 1210-1212 (2004).
  15. Miyata, T., Kawaguchi, S., Ishii, M., Minami, T. High sensitivity chlorine gas sensors using Cu−phthalocyanine thin films. Thin Solid Films. 425 (1-2), 255-259 (2003).
  16. Barrena, E., de Oteyza, D. G., Dosch, H., Wakayama, Y. 2D supramolecular self-assembly of binary organic monolayers. ChemPhysChem. 8 (13), 1915-1918 (2007).
  17. Xiao, K., et al. Surface-induced orientation control of CuPc molecules for the epitaxial growth of highly ordered organic crystals on graphene. Journal of the American Chemical Society. 135 (9), 3680-3687 (2013).
  18. Feng, X., Ma, T., Yamaura, D., Tadaki, D., Hirano-Iwata, A. Formation and characterization of air-stable lipid bilayer membranes incorporated with phthalocyanine molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6515-6520 (2019).
  19. Wu, Y., He, K., Ludtke, S. J., Huang, H. W. X-ray diffraction study of lipid bilayer membranes interacting with amphiphilic helical peptides: diphytanoyl phosphatidylcholine with alamethicin at low concentrations. Biophysical Journal. 68 (6), 2361-2369 (1995).
  20. Zaitseva, S. V., Bettini, S., Valli, L., Kolker, A. M., Borovkov, N. Y. Atypical film-forming behavior of soluble tetra-3-nitro-substituted copper phthalocyanine. ChemPhysChem. 20 (3), 422-428 (2019).
  21. Ghani, F., Gojzewski, H., Riegler, H. Nucleation and growth of copper phthalocyanine aggregates deposited from solution on planar surfaces. Applied Surface Science. 351, 969-976 (2015).

Tags

Kemi Lipid tolags organisk molekyle tynd film vand / luft interface selv-forsamling hybrid lipid membran
Selvsamling af hybridlipidmembraner dopede med hydrofobe organiske molekyler på Vand / Air Interface
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, X., Ma, T., Tadaki, D.,… More

Feng, X., Ma, T., Tadaki, D., Hirano-Iwata, A. Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface. J. Vis. Exp. (159), e60957, doi:10.3791/60957 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter