Summary
البروتوكول الحالي يضع طريقة صارمة وقابلة للاستنساخ للقياس الكمي للتغيرات المفصلية المورفولوجية التي تصاحب هشاشة العظام. تطبيق هذا البروتوكول يمكن أن تكون ذات قيمة في رصد تطور المرض وتقييم التدخلات العلاجية في هشاشة العظام.
Abstract
واحدة من اضطرابات المفاصل الأكثر انتشارا في الولايات المتحدة, هشاشة العظام (OA) يتميز انحطاط التدريجي من الغضروف المفصلي, في المقام الأول في مفاصل الورك والركبة, مما يؤدي إلى آثار كبيرة على تنقل المريض ونوعية الحياة. حتى الآن، لا توجد علاجات علاجية موجودة لOA قادرة على إبطاء أو منع انحطاط الغضاريف. في الوقت الحاضر ، هناك مجموعة واسعة من الأبحاث الجارية لفهم علم الأمراض OA واكتشاف النهج العلاجية الجديدة أو العوامل التي يمكن أن تبطئ بكفاءة ، ووقف ، أو حتى عكس OA. وبالتالي ، من الأهمية بمكان أن يكون هناك نهج كمي وقابل للتكرار لتقييم التغيرات المرضية المرتبطة بـ OA بدقة في غضروف المفاصل ، وعظم السينونوف ، والعظم تحت الشبون. حاليا، يتم تقييم شدة OA والتقدم في المقام الأول باستخدام جمعية أبحاث هشاشة العظام الدولية (OARSI) أو أنظمة التهديف مانكين. على الرغم من أهمية أنظمة التسجيل هذه ، فهي شبه كمية ويمكن أن تتأثر بذاتية المستخدم. والأهم من ذلك، أنها تفشل في تقييم دقيق، ولكن المهم، التغيرات في الغضاريف خلال حالات المرض في وقت مبكر أو مراحل العلاج المبكر. يستخدم البروتوكول الذي نصفه هنا نظام برمجيات النسيجية المحوسبة وشبه الآلية لإنشاء منهجية كمية موحدة وصارمة وقابلة للاستنساخ لتقييم التغييرات المشتركة في OA. يقدم هذا البروتوكول إضافة قوية إلى الأنظمة الحالية ويسمح بالكشف بشكل أكثر كفاءة عن التغيرات المرضية في المفصل.
Introduction
واحدة من اضطرابات المفاصل الأكثر انتشارا في الولايات المتحدة, يتميز OA من الانحطاط التدريجي للغضروف المفصلي, في المقام الأول في مفاصل الورك والركبة, مما يؤدي إلى آثار كبيرة على تنقل المريض ونوعية الحياة1,2,3. الغضروف المفصلي هو النسيج الضام المتخصص للمفاصل اليوميات مصممة لتقليل الاحتكاك، وتسهيل الحركة، وتحمل ضغط مشترك4. يتكون الغضروف المفصلي من مكونين أساسيين: chondrocytes ومصفوفة خارج الخلية. Chondrocytes هي المتخصصة، والخلايا النشطة استقلابيا التي تلعب دورا أساسيا في تطوير وصيانة وإصلاح المصفوفة خارج الخلية4. تضخم Chondrocyte (CH) هي واحدة من العلامات المرضية الرئيسية لتطوير OA. ويتميز بزيادة حجم الخلوية، وانخفاض إنتاج بروتيجليكان، وزيادة إنتاج الغضروف مصفوفة الانزيمات المهينة التي تؤدي في نهاية المطاف إلى انحطاط الغضاريف5،6،7. وعلاوة على ذلك، التغيرات المرضية في العظام تحت الشوندري وsynovium من المفصل تلعب دورا هاما في التنمية OA والتقدم8،9،10،11،12. حتى الآن، لا توجد علاجات علاجية موجودة تمنع انحطاط الغضاريف1،,2،,3،,13،,14. وبالتالي ، هناك أبحاث مستمرة واسعة النطاق تهدف إلى فهم علم الأمراض OA واكتشاف النهج العلاجية الجديدة التي هي قادرة على إبطاء أو حتى وقف OA. وبناءعلى ذلك ، هناك حاجة متزايدة إلى نهج كمي واستنساخي يتيح التقييم الدقيق للتغيرات المرضية المرتبطة بـ OA في الغضروف والسينوفيوم والعظام تحت الشبكفية.
حاليا، يتم تقييم شدة OA والتقدم في المقام الأول باستخدام OARSI أو مانكين سجل النظم15. ومع ذلك ، فإن أنظمة التسجيل هذه هي شبه كمية فقط ويمكن أن تتأثر بذاتية المستخدم. والأهم من ذلك، أنها تفشل في تقييم دقيق التغيرات الطفيفة التي تحدث في المفصل أثناء المرض أو استجابة للتلاعب الجيني أو التدخل العلاجي. هناك تقارير متفرقة في الأدب تصف التحليلات الهستومومترية للغضروف، السينوفيديوم، أو العظام تحت التشبوندرية16،17، 18،,1919،20،21. ومع ذلك، لا يزال هناك نقص في بروتوكول مفصل لإجراء تحليل دقيق واستنساخ يُستنسخ من كل هذه المكونات المشتركة، مما يخلق حاجة غير ملباة في الميدان.
لدراسة التغيرات المرضية في OA باستخدام التحليل الهسي، استخدمنا نموذج الماوس OA الجراحية للحث OA عن طريق زعزعة استقرار الغضروف المفصلي (DMM). من بين النماذج الراسخة من المورين OA ، تم اختيار DMM لدراستنا لأنه ينطوي على آلية أقل صدمة للإصابة22،23،24،25،26. بالمقارنة مع إصابة الأربطة الغضدية (MLI) أو إصابة الرباط الصليبي الأمامي (ACLI) العمليات الجراحية ، تشجع DMM على تقدم أكثر تدريجيًا لـ OA ، على غرار تطور OA في البشر22،24،25،26. تم قتل الفئران بعد اثني عشر أسبوعا من جراحة DMM لتقييم التغيرات في الغضروف المفصلي، والعظام تحت الجلد، والسروفيوم.
والهدف من هذا البروتوكول هو وضع نهج موحد وصارم وكمية لتقييم التغييرات المشتركة المصاحبة لتقييم التقييمات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم شراء الفئران C57BL/6 الذكور البالغ من العمر اثني عشر أسبوعًا من مختبرات جاكس. تم إيواء جميع الفئران في مجموعات من 3-5 فئران لكل قفص معزول صغير في غرفة مع جدول زمني 12 ساعة ضوء / الظلام. تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقًا لدليل المعهد الوطني للصحة (NIH) لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة ولاية بنسلفانيا.
1. ما بعد الصدمة هشاشة العظام (PTOA) نموذج الجراحية
- تُسَخُّر الفئران باستخدام الكيتامين (100 ملغم/كغ)/xylazine (10 ملغم/كغ) عبر الحقن داخل البيرينيتونية، وإدارة البوبرينورفين (1 ملغم/كغ) عن طريق الحقن داخل البيريمنية لتخفيف الألم، وحلاقة الشعر فوق الركبة. تحقق من عدم وجود منعكس دواسة قبل بدء الجراحة.
- إجراء زعزعة الاستقرار في جراحة الغضروف المفصلي (DMM) كما وصفت سابقا22,23.
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى جلاسون وآخرون وسينغ وآخرون للحصول على معلومات بروتوكول جراحي أكثر تفصيلاً22،,23.- قم بإجراء شق طولي بطول 3 مم من الرضفة القاصية إلى هضبة الساق القريبة من مفصل الركبة اليمنى. استخدام خياطة لإزاحة وتر الرضفة.
- فتح الكبسولة المشتركة الوسطي إلى وتر وتحريك وسادة الدهون infrapatellar لتصور منطقة intercondylar، الغضروف المفصلي الوسطي، والرباط الغضروفي23.
- Transect الرباط الوسطي ليكمل DMM وزعزعة الاستقرار المشتركة22,23. أغلق موقع الشق بالدبابيس أو الغرز.
- إجراء عمليات جراحية صورية بعد إجراء مماثل، ولكن دون استئصال الرباط المنسي الوسطي.
ملاحظة: تم عشوائية الفئران لتلقي إما DMM أو جراحة صورية. وفقا للأدب نشرت سابقا, الفئران تطوير PTOA كبيرة 12 أسابيع بعد جراحة DMM22,23,24.
2. القتل الرحيم الماوس وجمع العينة
- القتل الرحيم للفأرة
- بعد اثني عشر أسبوعا من DMM، وحقن الفئران باستخدام الكيتامين (100 ملغ / كغ) / xylazine (10 ملغ / كغ) مزيج عن طريق الحقن داخل perperitoneal.
- إجراء شق خط الوسط من خلال الجلد على طول الصدر وتراجع القفص الصدري لفضح القلب لالتثبيت التهوى27.
ملاحظة: راجع مرجع غيج وآخرون للحصول على معلومات إضافية حول بروتوكول تثبيت القوارض المناسبة وكذلك تصوير الفيديو لتجميع المعدات المناسبة والإجراءات27. - إعداد جهاز التروية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- القتل الرحيم للفأرة عن طريق تبرّر الهيبارين المالحة عبر البطين الأيسر حتى يتم مسح الدم ويصبح الكبد شاحباً. Perfuse الماوس مع 10٪ محايدة مؤقتا formalin حتى يتم تحقيق تثبيت الماوس كاملة.
ملاحظة: الماوس perالتير بنجاح سوف تصبح قاسية. متوسط وقت التروية باستخدام نظام المضخة الآلي هو 5-7 دقيقة.
- جمع العينات وإعدادها
- عزل الركبتين عن طريق قطع العظام في منتصف عظم الفخذ ومنتصف الساق وتشريح الأنسجة العضلية المحيطة بها.
- مواصلة التثبيت عن طريق تخزين مفاصل الركبة في 10٪ محايدة مؤقتا formalin في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة، ثم في 4 درجة مئوية لمدة 6 أيام.
- Decalcify العظام عن طريق تخزين العينة في EDTA العازلة إزالة الكسالة لمدة 1 أسبوع في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز خفيف28. تغيير حل المخزن المؤقت التنكس كل 3 أيام.
ملاحظة: تم إعداد عازل إزالة الكسالات عن طريق إذابة 140 غرام من رباعي الصوديوم EDTA فائق النقاء في محلول 850 مل من الماء المقطر بالإضافة إلى 15 مل من حمض الخليك الجليدي. وكان الحاجز درجة الحموضة المعادلة إلى 7.6 عن طريق إضافة dropwise من حمض الخليك الجليدي إلى الحل. عند الوصول إلى درجة الحموضة = 7.6 ، تم إحضار المخزن المؤقت إلى 1 لتر من الحجم الإجمالي مع الماء المقطر. تم إعداد عازل إزالة الكسبالة الطازج ة واستخدامها في غضون أسبوع واحد من التحضير. - غسل الركبتين مع الإيثانول 50٪، ثم 70٪ الإيثانول لمدة 15 دقيقة لكل منهما، ثم عملية لتضمين.
ملاحظة: تم تنفيذ معالجة نقل السوائل من قبل النواة الجزيئية وعلم الأمراض الهيستوم في مركز ميلتون S. Hershey الطبي في ولاية بنسلفانيا. استشر نواة علم الأنسجة في المؤسسة للحصول على توصيات حول معالجة العينات المثلى. - تضمين الركبتين الماوس في البارافين مع الجانب الأوساط ية من المفصل التي تواجه السطح السفلي للكتلة البارافين. تطبيق ضغط طفيف على الجانب الساقي من المفصل أثناء التضمين لضمان الأسطح الظنجية والفخذ هي أقرب إلى نفس الطائرة ممكن.
3. Microtome أقسام واختيار الشرائح
- المقاطع الميكروتومية
- استخدام مقابض ضبط الطائرة على حامل كتلة microtome لضمان مواجهة السليم للكتلة عينة.
- مواجهة كتلة البارافين بحيث يظهر الجانب القاصي من عظم الفخذ ، والمنطقة القريبة من الساق ، والقرون الأمامية والخلفية للغضروف المفصلي الوسطي في نفس المستوى لجمع القسم(الشكل التكميلي 1A). ابدأ في جمع المقاطع على الشرائح عندما تبدأ القرون الأمامية والخلفية للغضروف المفصلي الوسطي في الانفصال عن بعضها البعض.
- تأكد من ظهور الساق وعظم الفخذ والمنيسي في نفس المستوى من خلال مقارنة أحجام البنية. يجب أن يكون عظم الساق وعظم الفخذ من حجم مماثل ، مع كل من القرون المنسية مماثلة في الحجم والشكل(الشكل التكميلي 1A). إذا كان الهيكل يبدو كبيرًا جدًا بالمقارنة مع نظيره، فهذا يشير إلى الحاجة إلى مواجهة إضافية. الأهم من ذلك، تأكد من أن الفضاء المشترك لا يزال سليما.
- خذ أقسام الغَبَاق من الرّجَة المُضمّنة من الراكِضات البارافين من خلال حجرة المفصل الوسطي في أقسام 5 ميكرومتر، واجمع الأقسام على الشرائح. جمع ما يقرب من 30 أقسام لكل كتلة البارافين.
- تحديد الشريحة
- حدد ثلاثة أقسام تمثيلية بفارق 50 ميكرومتر لكل عينة بدءًا من القسم الخامس (أي الشرائح 5 و15 و25). سيتم استخدام الشرائح المختارة للتلطيخ اللاحق ، وتسجيل OARSI ، وتحليل الهستومورفومتر.
ملاحظة: من كتلة مع 30 مقطعًا إجماليًا، حدد الشرائح من البداية (الشرائح 5-10)، والوسطى (الشرائح 15-20)، ونهاية (الشرائح 25-30) من المجموعة من أجل تمثيل العينة بأكملها بوضوح. حدد الشرائح من مستويات مماثلة من العمق بين العينات.
- حدد ثلاثة أقسام تمثيلية بفارق 50 ميكرومتر لكل عينة بدءًا من القسم الخامس (أي الشرائح 5 و15 و25). سيتم استخدام الشرائح المختارة للتلطيخ اللاحق ، وتسجيل OARSI ، وتحليل الهستومورفومتر.
4. الهيماتوكسيلين، سافرانين أورانج، وتلطيخ الأخضر السريع
- Deparaffinize الشرائح المحددة مع ثلاثة تغييرات من الزيلين. هيدرات الشرائح مع تغييرين من الإيثانول 100٪، تغييرين من الإيثانول 95٪، وتغيير واحد من الإيثانول 70٪.
- وصمال الشرائح بالهيماتوسكلين لمدة 7 دقيقة ثم اغسل بالماء الجاري لمدة 10 دقيقة. وصمة عار مع الأخضر السريع لمدة 3 دقيقة وشطفها في 1.0% حمض الخليك الجليدي لمدة 10 s. Stain مع سافرانين-O لمدة 5 دقيقة وشطفها بسرعة عن طريق غمس حمض الخليك الجليدي بنسبة 0.5%.
- شطف الشرائح في تغييرين من الماء المقطر والسماح للهواء الجاف.
- مسح الشرائح في ثلاثة تغييرات من الزيلين لمدة 5 دقيقة كل ثم جبل مع وسائل الإعلام تصاعد القائم على xylene وcoverslip.
ملاحظة: الهيماتوكسيلين بمثابة وصمة عار نووية لتحديد مناطق نخاع العظام. يستخدم سافرانين-O لتلطيخ الغضروف، البروتوغليكان، الموسين، وحبيبات الخلايا الصاري. يستخدم سريع الأخضر كمضاد للعظام.
5. تصوير الشرائح
- صور الشرائح الملطخة Safranin-O وFast Green باستخدام كاميرا متوفرة متصلة بالمجهر وبرامج التصوير المستندة إلى الكمبيوتر.
- فتح برنامج التصوير (انظر جدول المواد)وترتيب منطقة مفصل الركبة ذات الاهتمام (ROI) في وسط نافذة التصوير. إذا كنت تستخدم مرحلة شريحة المجهر الدوراني، فقم بمحاذاة الشريحة بحيث يمتد سطح الساق على عرض المحور الأفقي لمنطقة التصوير.
- تعيين توازن اللون الأبيض للكاميرا قبل البدء في تصوير مجموعة من العينات(الشكل التكميلي 2). صورة المقصورة المشتركة في كل من التكبير 4x و 10x، وضمان أن يتم تضمين كل من سطح عظم الساق والفخذ المفصلي وعظم تحت الظني داخل كل من صور ROIs(الشكل التكميلي 1A، B). حفظ الصور لكل من المستويات الثلاثة المحددة لاستخدامها في تسجيل OARSI.
ملاحظة: سيعتمد تعيين توازن اللون الأبيض للكاميرا على أنظمة البرامج والكاميرا المستخدمة. بشكل عام، انتقل إلى علامة التبويب الكاميرا أو قائمة التصوير الرئيسية ومرر لأسفل لتعيين توازن اللون الأبيض. حدد تعيين توازن اللون الأبيض وينبغي أن يظهر مؤشر صغير أو رمز(الشكل التكميلي 2A). باستخدام المؤشر، حدد منطقة داخل الصورة/العينة خالية من البقع، مثل مساحة المفصل، لتعيين توازن اللون الأبيض.
6. هشاشة العظام جمعية البحوث الدولية (OARSI) سجل15
- عشوائية الشرائح الثلاثة المختارة سافرانين-O والأخضر السريع الملون من جميع العينات.
- أداء OARSI سجل بطريقة عمياء مع ثلاثة مراقبين. لفترة وجيزة، عرض صورة واحدة في وقت واحد في ترتيب عشوائي والسماح لثلاثة مراقبين لتسجيل كل صورة، وربط إلى واحد من المستويات الثلاثة المحددة لكل عينة.
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى جدول تسجيل OARSI للحصول على أوصاف تفصيلية لجدول التقدير15. - حساب متوسط النقاط لكل قسم باستخدام درجات فردية من كل مراقب. تحديد متوسط درجة لكل عينة عن طريق أخذ متوسط درجة الأقسام التمثيلية الثلاثة.
7- التحليل الهيسمورفومتري
ملاحظة: يتم عرض صور حية لمفصل الركبة على شاشة تعمل باللمس باستخدام كاميرا المجهر، ويتم استخدام قلم لتتبع ROIs يدويًا. تقوم الخوارزميات المدمجة لبرنامج قياس الهيستومومتر بتحديد المعلمات المحددة (انظر البروتوكول أدناه) في ROIs المحددة. الأهم من ذلك، يتم استخدام نفس Safranin-O وأقسام ملونة سريعة الخضراء المستخدمة في تسجيل OARSI لتحليل الهستورفومتر.
- إعداد البرامج وإعداد القياس
- قم بتشغيل المجهر والكاميرا والكمبيوتر وشاشة اللمس. انقر على أيقونة البرنامج لإطلاق البرنامج. ضع الشريحة على مرحلة المجهر للعرض.
- مركز العينة داخل إطار القياس. تأكد من تعيين شبكة القياس إلى التكبير المناسب لمطابقة الهدف المستخدم على المجهر(الشكل التكميلي 3).
- انتقل إلى علامة التبويب "الملف" في أعلى الشاشة ومرر لأسفل إلى قراءة الإعدادات. افتح إطار الإعدادات وحدد ملف الإعدادات المناسبة للمعلمات المراد قياسها.
- حدد المعلمة التي سيتم قياسها من القائمة على الجانب الأيمن من الشاشة(الشكل التكميلي 3). استخدم المؤشر القلمي أو الماوس لتتبع الصور وفقًا للخطوات الموضحة أدناه من أجل قياس ROIs نسيجي محدد. عند الانتهاء من كل قياس، انقر على اليمين لإنهاء القياس والاستمرار في المعلمة التالية.
ملاحظة: يتم إنشاء قائمة المعلمات التي سيتم قياسها من خلال ملف تفضيل متميز يتم إعداده بالتشاور مع شركة البرامج بغرض قياس ROIs الموصوفة. يرجى الاطلاع على المناقشة لمزيد من التفاصيل حول الإعداد الكامل. - أكمل جميع القياسات ثم انتقل إلى علامة التبويب بيانات الملخص في الجزء السفلي من شاشة البرنامج(الشكل التكميلي 3). انقر على نافذة الشاشة، اضغط على مفتاح إدراج على لوحة المفاتيح أو نسخ البيانات ولصقها في جدول بيانات منفصل.
ملاحظة: إجراء تحليل الهستومومتر بطريقة عشوائية وعمياء. بعد الانتهاء من جميع قياسات المعلمة لجميع العينات، قم بتنظيم البيانات ومتوسط القياسات من الشرائح الثلاث من كل عينة.
- قياسات مناطق الغضاريف الكلية والكلسية وغير المعكلة
ملاحظة: استخدم برنامج متوفر تجاريًا (راجع جدول المواد)لتنفيذ هذه الخطوات. يرجى الاطلاع على الشكل التكميلي 1B،C للتوضيح حول مناطق الغضاريف ، والتقاطعات ، ومناطق العظام تحت الشوندرام التي تمت مناقشتها في جميع أنحاء هذا القسم.- رسم خط عبر الحافة المتفوقة من سطح غضروف الساق حيث يلتقي الغضروف الفضاء المشترك. رسم خط ثان عند تقاطع شوندرو سوسيوس حيث يلتقي الغضروف المتكلس بالعظم تحت التشوندرية(الشكل 1B). استخدام وظيفة منطقة البرنامج للحصول تلقائيا على قياس منطقة الغضاريف الإجمالية.
- رسم خط على طول علامة المد والجزر، وهو خط يحدث بشكل طبيعي يفصل بين المناطق المتكلسة وغير calcified من الغضاريف. رسم خط ثان عند تقاطع شوندرو سوسيوس حيث يلتقي الغضروف المتكلس بالعظم تحت التشوندرية(الشكل 1B). استخدام وظيفة منطقة البرنامج للحصول تلقائيا على قياس منطقة الغضاريف متكلس.
- حساب منطقة الغضاريف غير calcified عن طريق طرح منطقة الغضاريف المتكلسة من منطقة الغضاريف الإجمالية(الشكل 1B).
- تحديد عدد chondrocyte والنمط الظاهري
- إنشاء وظائف عد منفصلة داخل الإعدادات في برنامج قياس الأنسجة للتمييز بين إنتاج المصفوفة والمصفوفة غير المنتجة chondrocytes(الشكل 1B).
- تحديد عدد المصفوفات المنتجة أو التي لا تنتج chondrocytes باستخدام القلم لجعل نقطة صغيرة على كل chondrocyte التعبير عن النمط الظاهري المحدد(الشكل 1B).
ملاحظة: عد الخلايا وفقا لنوع الظاهري ة إما مصفوفة المنتجة (أي Safranin-O تلطيخ قوية) أو مصفوفة غير المنتجة (أي خافت جدا أو لا Safranin-O تلطيخ).
- قياس محيط سطح المفصلي الظنبي
- قياس محيط سطح المفصلي الظني المطلق عن طريق تتبع خط عبر سطح غضروف الظني ، وتحديد الرجفان الفردية بعناية(الشكل 1C).
- رسم خط ثان على طول علامة المد لتكون بمثابة رقابة داخلية للطائرة من كل قسم(الشكل 1C).
- احسب مؤشر الرجفان السطحي المفصلي للزعب عن طريق تقسيم محيط سطح المفصلي الظنبي على محيط علامة المد.
ملاحظة: محيط Tidemark عموما متساوية عبر العينات، وبالتالي فإن الفرق في محيط السطح المفصلي بين صور وDMM كان عموما صغيرة سواء تم استخدام محيط مطلق أو مؤشر الرجفان.
- قياس مناطق فضاء العظام والنخاع تحت الشبك
- قياس مساحة النخاع تحت النخاع باستخدام وظيفة المنطقة من خلال تحديد المناطق في المنطقة تحت الشمشية الملطخة بالهيماتوكسيلين فقط (أي سلبية للأخضر السريع) لتحديد إجمالي مساحة النخاع داخل العظام تحت الشمش. رسم خطوط حول محيط هذه المناطق لتحديد المساحة الإجمالية لجميع مساحة النخاع داخل عظم القبة(الشكل 2B).
- قياس إجمالي المنطقة تحت الشوندرية باستخدام وظيفة المنطقة عن طريق تحديد المنطقة بين تقاطع شوندرو osseous والحدود العليا للوحة النمو ، وتمتد بشكل لاحق إلى مناطق العظم والعظام الخلفية الأمامية(الشكل 2B).
- حساب منطقة العظام تحت الchondral عن طريق طرح مساحة نخاع العظم تحت الشوندري من المنطقة الكلية تحت الchondral(الشكل 2B,C).
- قياس المناطق الأمامية والخلفية للعظام
- لقياس منطقة العظام ، تتبع العظام الأمامية والخلفية للعظم القريب باستخدام وظيفة المنطقة (الشكل 2B،E،F).
ملاحظة: Osteophytes هي إسقاطات عظمية تتشكل بين الغضروف المفصلي ولوحة النمو أو الأمامي أو الخلفي إلى المنطقة تحت الشبورة. يتم تحديد مناطق العظام على الجانبين الأمامي والخلفي من الساق عن طريق تتبع المنطقة الأمامية أو الخلفية إلى العظام تحت الجمجمة. يتم تحديد التقاطع بين العظم والعظم تحت التشبوندري بوضوح من خلال خط من الخلايا تمتد من الغضروف المفصلي إلى لوحة النمو. يتم تعريف التقاطع بين العظم والجيوب الأنفية عن طريق الانتقال بين الأنسجة العظمية والليفية.
- لقياس منطقة العظام ، تتبع العظام الأمامية والخلفية للعظم القريب باستخدام وظيفة المنطقة (الشكل 2B،E،F).
- قياس سمك الزليلي
- قياس سمك الفخذ الزليلي في الربور باستخدام وظيفة المنطقة عن طريق رسم خط من نقطة الإدراج الداخلية للسينوفييوم الرعنة على عظم الفخذ نحو نقطة تعلقه على الغضروف المفصلي(الشكل 3B).
- رسم خط ثان من الإدراج الخارجي للسمنيوم على عظم الفخذ نحو تعلقه بالغضروف المفصلي(الشكل 3B).
- حساب سمك الزليلي عن طريق تقسيم المنطقة الزليلية الإجمالية على المحيط الزليلي.
8 - التحليل الإحصائي
- جمع المعلمات المقاسة ومتوسط النتائج من الأقسام التمثيلية الثلاثة لكل عينة. قم بتحليل البيانات باستخدام اختبار t للطالب غير المقترن لمقارنة مجموعتين أو ANOVA في اتجاه واحد لمقارنة ثلاث مجموعات أو أكثر.
- عرض البيانات كما يعني ± الخطأ القياسي للمتوسط.
ملاحظة: تحققت الأهمية الإحصائية في p ≤ 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ينتج عن OA الناجم عن DMM انحطاط الغضروف المفصلي وفقدان chondrocyte
أدى OA الناجم عن DMM إلى زيادة درجة OARSI مقارنة بالفئران الصورية ، التي تتميز بوضوح بتآكل السطح وفقدان الغضاريف(الشكل 1A،D). اكتشف بروتوكول قياس الهيستومورفوتومي المفصل هنا العديد من التغييرات المرتبطة بـ OA ، بما في ذلك انخفاض في منطقة الغضاريف الإجمالية وفي منطقة الغضاريف غير المعكلة(الشكل 1A،B،E،G). انخفاض في العدد الإجمالي chondrocyte؛ والأهم من ذلك، فقدان مصفوفة إنتاج chondrocytes(الشكل 1H،أنا). تم تقييم التغيرات في السطح المفصلي ، مما يدل على شدة التآكل ، باستخدام مؤشر الرجفان الغضروفي. عموما، ارتفع مؤشر الرجفان في الفئران DMM(الشكل 1C،K،L). ومع ذلك، من المهم أيضاً ملاحظة أن مؤشر الرجفان قد ينخفض في مرحلة النهاية بسبب التآكل الكامل لسطح الغضاريف، كما نوقش في البروتوكول. زيادة في مؤشر الرجفان يدل على انحطاط سطح الغضروف المفصلي أثناء تطور OA والتقدم. تسلط هذه النتائج الضوء على قدرة برنامج التحليل الهسي على اكتشاف وقياس التغيرات الغضاريف المرضية التي تميز تطور الزراعة اللابية.
تقييم التغيرات المشتركة الأخرى في OA الناجمة عن DMM
يؤثر OA على الأنسجة المشتركة بخلاف الغضاريف ، وتلعب التغيرات المرضية في هذه الأنسجة دورًا حاسمًا في تطور المرض. هنا، كشفت طريقة التحليل الهستي الموصوفة عن زيادة في منطقة العظام تحت الشبكودرية وانخفاض في مساحة مساحة نخاع العظم في فئران DMM(الشكل 2A-D)،مما يشير إلى تصلب العظام تحت الشبكى29،30. كما زادت كل من مناطق العظام الأمامية والخلفية في الفئران DMM(الشكل 2E,F),مما يشير إلى إعادة عرض العظام تحت التشبورية الجارية التي تعمل كآلية تعويضية للتعامل مع التغيرات في تحميل المفاصل في موقع الإصابة29,30.
أظهر التحليل الهسيمورفومتر يُظهر زيادة السماكة الزليلية في فئران DMM(الشكل 3A-C)، وهو نتيجة نموذجية للالتهاب الزليلي المرتبط بـ OA ونشر السيتوكينات الالتهابية في الفضاء المشترك11،12،31،32،33،34.34
تحليل التباين بين المستخدمين بين تسجيل OARSI مقابل قياس الهستري
لا يظهر الشكل 4A أي تباين كبير بين المستخدمين لكل من التحليل الهستومورمتري لمنطقة الغضاريف غير المعكلة(الشكل 4A)ودرجة OARSI(الشكل 4B). ومع ذلك، أظهر التحليل الهستمورومتري فرقاً متوسطاً منخفضاً للغاية بين المراقبين يتراوح بين -0.0001179-0.00120، مما أدى إلى تداخل شبه كامل للنتائج التي حصل عليها المراقبون الثلاثة، في حين كان الفرق المتوسط بين المراقبين أعلى في درجة OARSI تتراوح بين -0.3-0.3 مع انحراف واضح لقيم O1 من قيم O2 و O3.
الشكل 1: قياس الهيستومورفوتومي من الغضروف المفصلي الساقي والأنماط الظاهرية المفصلية chondrocyte من الجراحة الصورية والفئران DMM. (أ)سطح المفصلي الطيبي ملطخة سافرانين-O/الأخضر السريع. (ب)تم استخدام التحليل الهيستومورفومتر لتتبع إجمالي مساحة الغضاريف ومنطقة الغضاريف المتكلسة (البرتقالي). تم حساب الغضروف المتفوق على منطقة علامة المد على أنه الغضروف غير المعلّم (أخضر). تم احتساب المصفوفة المنتجة للتشوندروكيتس (أبيض) والمصفوفة التي لا تنتج chondrocytes (أرجواني) داخل منطقة الغضاريف غير المعكلة. (ج)تم قياس محيط سطح المفصلي الساقي عن طريق تتبع السطح المفصلي (الخط الأزرق) تليها علامة المد والجزر (الخط الأرجواني) لتحديد مؤشر الرجفان. (D)زادت درجة OARSI في الفئران DMM. (E-L) التمثيل الرسومي لمناطق الغضاريف الكمية وchondrocyte التهم من الفئران صورية وDMM. بالمقارنة مع الفئران الشامة ، كانت فئران DMM قد انخفضت إجمالي مساحة الغضروف الظنبي(E)، منطقة الغضب ة الكالسيين(F)، غضروف الظني غير المعكل(G)، عدد chondrocyte الكلي للقبية(H)، مصفوفة الساقية المنتجة للتشوندروكيتس ،(I)ومصفوفة الساقية غير المنتجة chondrocytes(J). بالمقارنة مع الفئران الشام، كانت الفئران DMM قد زادت محيط سطح المفصلي الساقي(K)وزيادة مؤشر الرجفان السطحي المفصلي الساقي(L). تم التقاط الصور باستخدام التكبير 10x. *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001، و ****P < 0.0001 باستخدام اختبار t غير مقترن مع تصحيح ويلش، يتم التعبير عن القيم كمتوسط ± SEM؛ ن = 5/المجموعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قياس الهيستيومورفومتر لمنطقة نخاع العظم تحت الشبكودري ومنطقة العظام تحت الشبكمنمنية من الجراحة الصورية وفئران DMM. (أ)غضروف المفصلي الظنبي والعظام تحت الكثافة ملطخة بسافران-O/Fast Green. (ب)تم تتبع مناطق نخاع العظم تحت الجلد (الخضراء) ومنطقة العظام تحت الجلد (أرجواني) ومنطقة العظام الأمامية (الصفراء) ومنطقة العظام الخلفية (الرمادي) باستخدام برامج قياس الهسفور الحسبة المحسوبة. (ج–واو) المناطق البيانية الهستومومترية بين الفئران الشام وDMM. بالمقارنة مع الفئران الشامة ، كان لدى فئران DMM منطقة عظم باطني مُزيدة(C)ومنطقة عظم العظم الرُقبية والخلفية(E-F)، بالإضافة إلى انخفاض منطقة نخاع العظم تحت الزعُب الزبوية مقارنة ً بالفئران الصورية(D). تم التقاط الصور باستخدام التكبير 4x. *P < 0.05, **P < 0.01 باستخدام اختبار t غير مقترن مع تصحيح ويلش. يتم التعبير عن القيم كمتوسط ± SEM; ن = 5/المجموعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: قياس الهيستوموتوميمن السينوفيد من الجراحة الصورية وفئران DMM. (أ)سينوفيم ملطخة سافرانين-O/سريع الأخضر. (ب)تم قياس سمك الزليلي عن طريق تتبع الغشاء الزليلي المني الرطوري عبر الجانب الرطوري للمفصل الرجيدي (الأخضر). (C)التمثيل الرسومي لقياسات سمك الزليلي باستخدام برامج قياس الهستوم والمتوسطة المحسوبة. وكان الفئران DMM زيادة سمك الزليلي مقارنة مع الفئران الشام. تم التقاط الصور في التكبير 20x. P < 0.001 باستخدام اختبار t غير مقترن مع تصحيح ويلش ، يتم التعبير عن القيم كمتوسط ± SEM ؛ n = 5/المجموعة؛ S = السينوفيم؛ F = عظم الفخذ؛ وM = الغضروف المفصلي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تباين المستخدمين في تسجيل OARSI مقابل تحليل الهتومومتر. (أ)قياسات منطقة الغضاريف غير الكسالة التي تم الحصول عليها باستخدام قياس الهستوم والمتوسطة من قبل ثلاثة مراقبين أعمى (O1، O2، O3). (ب)درجات OARSI للفئران الصورية وDMM التي تم الحصول عليها من المراقبين الثلاثة المعفىين. تشير الخطوط المنقطة إلى القيمة الوسطى لكل مجموعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: التحليل النسيجي لسافران-O والأخضر السريع الملون بالمقاطع المشتركة الماوس الملون. (أ)صورة التكبير 4x من المفصل عظم الساقية. يتم تسمية مجالات التركيز. (ب)صورة تكبير 10x من عائد الاستثمار المشترك tibiofemoral. يتم تصور الأسطح الساقية والفخذية وكذلك القرون المنزهلية الأمامية والخلفية. المينيسي تقريبا نفس الحجم ويتركز عائد الاستثمار التصوير على مقصورة مشتركة. (C)صورة التكبير 40x لسطح الزبية القريب. يوصف خط علامة المد على أنه الخط بين مناطق الغضاريف غير المعكلة والكلسية. يتم تسمية تقاطع العظام بين نهاية الغضروف المتكلس وبداية العظام تحت الششون. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: إعداد نظام قياس الهيسيتومورفوتومي ومعايرة توازن اللون الأبيض للكاميرا. (أ)الماوس tibiofemoral المشتركة تصور في التكبير 4x في نافذة البرنامج مع توازن اللون الأبيض لم يتم تعيين. لاحظ علامة التبويب إعدادات الكاميرا في أعلى الشاشة والتحديد في القائمة المنسدلة لتعيين توازن اللون الأبيض. (ب)الماوس tibiofemoral مشتركة في التكبير 4x مع مجموعة توازن اللون الأبيض. لاحظ التغيير في تلوين وتلطيخ العينة ، مما يزيد من قدرة المستخدم على التمييز بين مناطق معينة من المفصل الظنبي عند إجراء القياسات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل التكميلي 3: إعداد البرامج الهسيتومورفومترية قبل قياسات التحليل الهسمورف. لقطة شاشة تمثيلية لنافذة البرامج الهسمورفومترية. لاحظ أن قسم ركبة الماوس الملون يتركز في منطقة القياس (الشبكة الصفراء) ويتم تحديد مقياس التكبير الصحيح للمنطقة لمطابقة الهدف المستخدم على المجهر (دائرة باللون الأحمر في الزاوية اليمنى العليا من الشاشة). يتم عرض قائمة المعلمات في العمود إلى يمين منطقة التصوير والقياس. اختيار معلمة سوف تسليط الضوء على المعلمة، وبالتالي يتم حاليا اختيار الرجفان الطيبي ليتم قياسها. علامة التبويب بيانات الملخص في الجزء السفلي من النافذة هي المكان الذي سيتم فيه تنظيم قياسات لكل معلمة لكل عينة وحفظها ليتم تصديرها بعد الانتهاء من كل قياس معلمة لكل قسم. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد عززت البحوث الأخيرة هشاشة العظام فهمنا للكلام المتبادل بين الأنسجة المختلفة داخل المفصل والدور الذي يلعبه كل نسيج في بدء المرض أو التقدم8,9,10,35,36. وبناء على ذلك، أصبح من الواضح أن تقييم زراعة الأوا لا ينبغي أن يقتصر على تحليل الغضاريف ولكن ينبغي أن يشمل أيضا تحليل العظام تحت الشوندري والسينوفيديوم. على الرغم من ذلك ، كان الغضروف المفصلي هو التركيز الأساسي للتسجيل شبه الكمي لـ OA15،37،38. على الرغم من أن حساب قياس الأنسجة قد تم تطبيقه بالفعل على مناطق مختلفة من البحوث العضلية الهيكلية39،40،41،42،43،44، هناك فجوة غير ملباة في وصف بروتوكول لتحليل دقيق ومستنسخ التغييرات المنفصلة على العديد من الأنسجة داخل مقصورة مفصل الركبة خلال OA. تطبيق قياسات التحليل الهسمورمتر لتحديد التغيرات في الغضروف والعظام تحت التشوندريوم وsynovium يوفر تقييما أكثر شمولية للتغيرات الأولية والثانوية في مفاصل OA.
هنا ، نصف لأول مرة بروتوكول مفصل يستخدم برنامج تحليل تحليل مفصل محوسب وشبه آلي لقياس التغيرات المرضية في مقصورات مشتركة مختلفة وتقييم تطور OA أو التقدم أو الانحدار. وينبغي توخي الحذر أثناء إعداد العينة، كما واضحة ومتسقة Safranin-O والبقع الخضراء السريعة ضرورية للحد من الغموض عند تتبع وأخذ القياسات مع البرمجيات histomorphometric. من المستحسن استخدام حلول تلطيخ جديدة لكل دفعة من الشرائح. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يحدث تحديد الشريحة للتلطيخ عند مستويات متسقة بين الكتل. يجب أن تؤخذ الشريحة الأولى على مستوى مماثل بين العينات ، من الناحية المثالية بمجرد بدء انفصال قرون المنيكال الأمامية والخلفية.
خلال OA، ينخفض الغضاريف الكلية ومناطق الغضاريف غير المعلّمة بسبب رجفان الغضاريف والانحطاط. في OA شديدة، قد يحدث أيضا انحطاط كامل من الغضروف المتكلس. البروتوكول يسلط الضوء على أهمية تحديد النمط الظاهري chondrocyte كتقييم للتقدم OA لتقييم الابتنائية مقابل إشارات تقويضية في الغضاريف. العدد الإجمالي للchondrocytes وعدد المصفوفة المنتجة chondrocytes (الابتنائية) مرتفعة في الغضاريف العادية ومنخفضة في غضروف OA، حيث غالبية chondrocytes الموجودة في OA هي مصفوفة nonproducing (تقويضي). الأهم من ذلك، لا يتم تقييم هذه المعلمة الأساسية في مجال الاكتشاف العلاجي OA من قبل OARSI أو أنظمة التهديف مانكين. بعض التدخلات التي لا تحافظ فقط على منطقة الغضاريف وعدد من chondrocytes ولكن أيضا تعزيز chondrocyte النمط الظاهري الابتنائية قد تكون أكثر فعالية النهج العلاجية.
البروتوكول مفصلة هنا كما يوفر طريقة لقياس كمي التغيرات الدقيقة في الرجفان سطح الغضروف الموجودة في OA خفيفة إلى معتدلة. ويعني وجود عدد أكبر من الرجفان زيادة قياس المحيط بسبب وجود مسافات بادئة في السطح المفصلي. وهكذا، محيط سطح المفصلي الساقية ومؤشر الرجفان منخفضة في الغضاريف العادية، وسيطة في OA خفيفة بسبب بعض الرجفان، وارتفاع في OA معتدلة بسبب المزيد من الرجفان، ولكن مرة أخرى منخفضة في OA شديدة بسبب انحطاط الغضاريف كاملة والخسارة.
إعادة عرض العظام تحت الاختزالوتصلب هي علامات مرضية مميزة لـ OA ، مما يؤدي إلى تقليل مساحة النخاع تحت الشبكودري وزيادة منطقة العظام تحت التشوندرية8،9،10،29،30. يوضح التحديد الكمي للتغيرات في منطقة العظام تحت الششوندرية ومنطقة فضاء النخاع تحت النقيوندري الموصوفة في البروتوكول أهمية فهم التغيرات المتعددة الأنسجة كعنصر دافع للطبيعة المعقدة لتطور وتطور مرض OA. قياس المناطق الأمامية والخلفية العظام يوفر نظرة ثاقبة مهمة في حجم إعادة عرض العظام التي تحدث داخل المفصل. منطقة العظام صغيرة للغاية في الركبتين التي تعمل بشام ويتم زيادة بسبب تشكيل العظام في OA. يختلف قياس منطقة العظام الأمامية اختلافًا طفيفًا عن قياس منطقة العظام الخلفية بسبب الطبيعة الشديدة لإعادة عرض العظام التي تحدث في المنطقة التي تعاني منها الركبة، بالقرب من موقع إصابة DMM.
وأخيراً، يحدد هذا البروتوكول تقييماً قابلاً للقياس الكمي للتغيرات في الغشاء الزليلي. سمك الزليلي منخفض في المفاصل وهمية زيادات في OA. التهاب في OA يؤدي إلى سماكة الغشاء الزليلي لزيادة تسليم السيتوكينات الالتهابية وغيرها من العوامل إلى الفضاء المشترك10،11،1231،32. وبالتالي ، من الضروري تقييم التهاب المفاصل كعامل تعديل لتطور مرض OA.
استخدام برنامج قياس الهستوم وومتر محدود من خلال توافر الأجهزة: شاشات تعمل باللمس أو أقراص مع قلم ضرورية للغاية نظرا لكمية التتبع اليدوي المطلوبة لاتخاذ قياسات دقيقة. محاولة لقياس المناطق الصغيرة مع برنامج قياس الهسف يمكن أيضا أن يكون الحد، كما يقتصر حجم القلم إلى قطر واحد. وفي حين أن هذا العجز عن قياس المناطق الصغيرة قد يكون غير مريح، فإن المناطق المشتركة التي تقاس يسهل تعريفها باستخدام أداة المنطقة، كما أن التمييز المنخفض في البرمجيات يحدث فرقا ً ضئيلاً في القياس النهائي.
وتجدر الإشارة أيضا إلى أن التباين بين المستعملين هو دائما مجال للقلق فيما يتعلق بتنفيذ بروتوكول كمي موثوق به وقابل للاستنساخ. يتطلب إنشاء بروتوكول فعال وقابل للاستنساخ وصارم قياس الحيثيات الحد من المتغيرات المركبة المحتملة ضمن التحليل التجريبي، بما في ذلك الحد من التباين بين المستخدمين. ومع ذلك، وبعد دورة تدريبية قصيرة (حوالي 30 دقيقة) مع البرنامج، تمكن أعضاء المختبر من توليد قياسات متسقة للغاية وقابلة للاستنساخ، حيث يعكس توزيع القياسات بين المستخدمين المزيد من التراكب المباشر الذي لا يمثل أي تباين بين المستخدمين تقريبًا. والأهم من ذلك أن بروتوكول قياس الهسَرَف هذا يُظهر طريقة فعالة لتحديد الاختلافات المنفصلة بين العينات الزائفة بطريقة قابلة للاستنساخ بدرجة عالية.
نظام تسجيل OARSI هو مقياس شائع الاستخدام لتقييم تلف الغضاريف في مرضى OA ونماذج المورينالتجريبية 15. ويستند نظام التسجيل على مقياس العدد الكامل الذي يركز في المقام الأول على مدى شقوق/تآكل أو سطح المفصل. على الرغم من أننا لم نجد أي تباين كبير بين المستخدمين مع درجات OARSI في تجربتنا ، لا يزال هناك فرق متوسط أعلى في بين المراقبين ، مقابل لا شيء تقريبًا في بروتوكول قياس الهستوم الموصوف. وهكذا، فإن وضع هذا البروتوكول القابل للاستنساخ للتحليل الهسي للبارامترات المحددة يسمح بإجراء قياسات متسقة للغاية لكل عينة، حتى بين مستخدمين متعددين، مما يزيل بعض الطبيعة الذاتية لتحليل العينة.
نظام تسجيل النقاط الموحد OARSI هو معيار لأبحاث OA. غير أن الطبيعة المحدودة القائمة على النقاط للنظام لا تسمح بالقياس الكمي للتغيرات الطفيفة التي تحدث داخل المفصل. يوفر التقييم المشترك الموسع الموصوف في هذه المخطوطة باستخدام برنامج قياس الحيثزة توصيفًا معززًا وأقل ذاتية لشدة OA. تم تحسين هذا البروتوكول للفئران التي خضعت لتحريض جراحي لـ OA. غير أنه يمكن تطبيق الإجراءات والتقنيات لتقييم عملية الإعادة إلى المنوة ضمن نماذج وفرضيات أخرى.
باختصار، يوفر البروتوكول المفصل هنا دليلاً واضحاً لنهج كمي شبه آلي دقيق وقابل للاستنساخ للتحقيق في أمراض الأواأوتقييم أو تقييم التدخلات العلاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي
Acknowledgments
نود أن ننوه بمساعدة موظفي قسم الطب المقارن ونواة الجزيئات وعلم الأمراض الهيستوباثفية في مركز ميلتون S. Hershey الطبي في ولاية بنسلفانيا. مصادر التمويل: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF منحة أبحاث التهاب المفاصل (F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
References
- Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
- Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
- Lorenz, J., Grässel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S., Coppola, V. 1194, Humana Press. New York, NY. 401-419 (2004).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
- Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
- Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654 (2011).
- Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
- Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632 (2016).
- Martel-Pelletier, J., et al.
- Goldring, M. B., Otero, M.
- Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625 (2010).
- Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
- Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
- Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
- O'Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
- Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
- Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
- Pastoureau, P., Chomel, A. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. 101, Humana Press. New York, NY. 79-91 (2004).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Singh, S. R., Coppola, V. Mouse Genetics: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2004).
- Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413 (2014).
- Culley, K. L., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. Westendorf, J., van Wijnen, A. 1226, Humana Press. New York, NY. 143-173 (2015).
- Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
- Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33 (2011).
- Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
- Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
- De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
- Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028 (2016).
- Lories, R. J., Luyten, F. P.
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
- Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
- Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175 (2018).
- Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
- Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037 (2016).
- Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
- Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).
