تقييم قياسي للفزة الهيستومترية لهشاشة العظام في نموذج الماوس الجراحي
Summary
البروتوكول الحالي يضع طريقة صارمة وقابلة للاستنساخ للقياس الكمي للتغيرات المفصلية المورفولوجية التي تصاحب هشاشة العظام. تطبيق هذا البروتوكول يمكن أن تكون ذات قيمة في رصد تطور المرض وتقييم التدخلات العلاجية في هشاشة العظام.
Abstract
واحدة من اضطرابات المفاصل الأكثر انتشارا في الولايات المتحدة, هشاشة العظام (OA) يتميز انحطاط التدريجي من الغضروف المفصلي, في المقام الأول في مفاصل الورك والركبة, مما يؤدي إلى آثار كبيرة على تنقل المريض ونوعية الحياة. حتى الآن، لا توجد علاجات علاجية موجودة لOA قادرة على إبطاء أو منع انحطاط الغضاريف. في الوقت الحاضر ، هناك مجموعة واسعة من الأبحاث الجارية لفهم علم الأمراض OA واكتشاف النهج العلاجية الجديدة أو العوامل التي يمكن أن تبطئ بكفاءة ، ووقف ، أو حتى عكس OA. وبالتالي ، من الأهمية بمكان أن يكون هناك نهج كمي وقابل للتكرار لتقييم التغيرات المرضية المرتبطة بـ OA بدقة في غضروف المفاصل ، وعظم السينونوف ، والعظم تحت الشبون. حاليا، يتم تقييم شدة OA والتقدم في المقام الأول باستخدام جمعية أبحاث هشاشة العظام الدولية (OARSI) أو أنظمة التهديف مانكين. على الرغم من أهمية أنظمة التسجيل هذه ، فهي شبه كمية ويمكن أن تتأثر بذاتية المستخدم. والأهم من ذلك، أنها تفشل في تقييم دقيق، ولكن المهم، التغيرات في الغضاريف خلال حالات المرض في وقت مبكر أو مراحل العلاج المبكر. يستخدم البروتوكول الذي نصفه هنا نظام برمجيات النسيجية المحوسبة وشبه الآلية لإنشاء منهجية كمية موحدة وصارمة وقابلة للاستنساخ لتقييم التغييرات المشتركة في OA. يقدم هذا البروتوكول إضافة قوية إلى الأنظمة الحالية ويسمح بالكشف بشكل أكثر كفاءة عن التغيرات المرضية في المفصل.
Introduction
واحدة من اضطرابات المفاصل الأكثر انتشارا في الولايات المتحدة, يتميز OA من الانحطاط التدريجي للغضروف المفصلي, في المقام الأول في مفاصل الورك والركبة, مما يؤدي إلى آثار كبيرة على تنقل المريض ونوعية الحياة1,2,3. الغضروف المفصلي هو النسيج الضام المتخصص للمفاصل اليوميات مصممة لتقليل الاحتكاك، وتسهيل الحركة، وتحمل ضغط مشترك4. يتكون الغضروف المفصلي من مكونين أساسيين: chondrocytes ومصفوفة خارج الخلية. Chondrocytes هي المتخصصة، والخلايا النشطة استقلابيا التي تلعب دورا أساسيا في تطوير وصيانة وإصلاح المصفوفة خارج الخلية4. تضخم Chondrocyte (CH) هي واحدة من العلامات المرضية الرئيسية لتطوير OA. ويتميز بزيادة حجم الخلوية، وانخفاض إنتاج بروتيجليكان، وزيادة إنتاج الغضروف مصفوفة الانزيمات المهينة التي تؤدي في نهاية المطاف إلى انحطاط الغضاريف5،6،7. وعلاوة على ذلك، التغيرات المرضية في العظام تحت الشوندري وsynovium من المفصل تلعب دورا هاما في التنمية OA والتقدم8،9،10،11،12. حتى الآن، لا توجد علاجات علاجية موجودة تمنع انحطاط الغضاريف1،,2،,3،,13،,14. وبالتالي ، هناك أبحاث مستمرة واسعة النطاق تهدف إلى فهم علم الأمراض OA واكتشاف النهج العلاجية الجديدة التي هي قادرة على إبطاء أو حتى وقف OA. وبناءعلى ذلك ، هناك حاجة متزايدة إلى نهج كمي واستنساخي يتيح التقييم الدقيق للتغيرات المرضية المرتبطة بـ OA في الغضروف والسينوفيوم والعظام تحت الشبكفية.
حاليا، يتم تقييم شدة OA والتقدم في المقام الأول باستخدام OARSI أو مانكين سجل النظم15. ومع ذلك ، فإن أنظمة التسجيل هذه هي شبه كمية فقط ويمكن أن تتأثر بذاتية المستخدم. والأهم من ذلك، أنها تفشل في تقييم دقيق التغيرات الطفيفة التي تحدث في المفصل أثناء المرض أو استجابة للتلاعب الجيني أو التدخل العلاجي. هناك تقارير متفرقة في الأدب تصف التحليلات الهستومومترية للغضروف، السينوفيديوم، أو العظام تحت التشبوندرية16،17، 18،,1919،20،21. ومع ذلك، لا يزال هناك نقص في بروتوكول مفصل لإجراء تحليل دقيق واستنساخ يُستنسخ من كل هذه المكونات المشتركة، مما يخلق حاجة غير ملباة في الميدان.
لدراسة التغيرات المرضية في OA باستخدام التحليل الهسي، استخدمنا نموذج الماوس OA الجراحية للحث OA عن طريق زعزعة استقرار الغضروف المفصلي (DMM). من بين النماذج الراسخة من المورين OA ، تم اختيار DMM لدراستنا لأنه ينطوي على آلية أقل صدمة للإصابة22،23،24،25،26. بالمقارنة مع إصابة الأربطة الغضدية (MLI) أو إصابة الرباط الصليبي الأمامي (ACLI) العمليات الجراحية ، تشجع DMM على تقدم أكثر تدريجيًا لـ OA ، على غرار تطور OA في البشر22،24،25،26. تم قتل الفئران بعد اثني عشر أسبوعا من جراحة DMM لتقييم التغيرات في الغضروف المفصلي، والعظام تحت الجلد، والسروفيوم.
والهدف من هذا البروتوكول هو وضع نهج موحد وصارم وكمية لتقييم التغييرات المشتركة المصاحبة لتقييم التقييمات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد عززت البحوث الأخيرة هشاشة العظام فهمنا للكلام المتبادل بين الأنسجة المختلفة داخل المفصل والدور الذي يلعبه كل نسيج في بدء المرض أو التقدم8,9,10,35,36. وبناء على ذلك، أصبح من الواضح أن تقييم زراعة الأوا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن ننوه بمساعدة موظفي قسم الطب المقارن ونواة الجزيئات وعلم الأمراض الهيستوباثفية في مركز ميلتون S. Hershey الطبي في ولاية بنسلفانيا. مصادر التمويل: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF منحة أبحاث التهاب المفاصل (F.K.).
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes – Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage – Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. – OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
References
- Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
- Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
- Lorenz, J., Grässel, S., Singh, S., Coppola, V. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2004).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
- Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
- Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654 (2011).
- Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
- Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632 (2016).
- Martel-Pelletier, J., et al. Osteoarthritis. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16072 (2016).
- Goldring, M. B., Otero, M. Inflammation in osteoarthritis. Current Opinion in Rheumatology. 23 (5), 471 (2011).
- Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625 (2010).
- Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
- Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
- Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
- O’Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
- Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
- Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
- Pastoureau, P., Chomel, A., DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. 101, 79-91 (2004).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Singh, S. R., Coppola, V. . Mouse Genetics: Methods and Protocols. , (2004).
- Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413 (2014).
- Culley, K. L., Westendorf, J., van Wijnen, A., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. 1226, 143-173 (2015).
- Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
- Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33 (2011).
- Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
- Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
- De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
- Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028 (2016).
- Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43 (2011).
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
- Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
- Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175 (2018).
- Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
- Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037 (2016).
- Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
- Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).
