Summary
O protocolo atual estabelece um método rigoroso e reprodutível para quantificação de alterações articulares morfológicas que acompanham a osteoartrite. A aplicação deste protocolo pode ser valiosa no monitoramento da progressão da doença e na avaliação de intervenções terapêuticas na osteoartrite.
Abstract
Uma das doenças articulares mais prevalentes nos Estados Unidos, a osteoartrite (OA) é caracterizada pela degeneração progressiva da cartilagem articular, principalmente nas articulações do quadril e do joelho, o que resulta em impactos significativos na mobilidade e qualidade de vida do paciente. Até o momento, não existem terapias curativas existentes para OA capazes de retardar ou inibir a degeneração da cartilagem. Atualmente, há um extenso corpo de pesquisas em andamento para entender a patologia da OA e descobrir novas abordagens terapêuticas ou agentes que podem reduzir eficientemente, parar ou até mesmo reverter o OA. Assim, é fundamental ter uma abordagem quantitativa e reprodutível para avaliar com precisão as alterações patológicas associadas à OA na cartilagem articular, no sinóvio e no osso subcondral. Atualmente, a gravidade e a progressão da OA são avaliadas principalmente usando os sistemas de pontuação Da Osteoarthritis Research Society International (OARSI) ou Mankin. Apesar da importância desses sistemas de pontuação, eles são semiquantitativos e podem ser influenciados pela subjetividade do usuário. Mais importante, não conseguem avaliar com precisão mudanças sutis, mas importantes, na cartilagem durante os estados precoces da doença ou fases de tratamento precoce. O protocolo que descrevemos aqui usa um sistema de software histomorfométrico computadorizado e semi-automatizado para estabelecer uma metodologia quantitativa padronizada, rigorosa e reprodutível para a avaliação de mudanças conjuntas na OA. Este protocolo apresenta uma poderosa adição aos sistemas existentes e permite uma detecção mais eficiente de alterações patológicas na articulação.
Introduction
Uma das doenças articulares mais prevalentes nos Estados Unidos, a OA é caracterizada pela degeneração progressiva da cartilagem articular, principalmente nas articulações do quadril e do joelho, o que resulta em impactos significativos na mobilidade do paciente e na qualidade de vida1,2,3. Cartilagem articular é o tecido conjuntivo especializado das articulações diartrodiais projetadas para minimizar o atrito, facilitar o movimento e suportar a compressão articular4. A cartilagem articular é composta por dois componentes primários: condrócitos e matriz extracelular. Os condrócitos são células especializadas e metabolicamente ativas que desempenham um papel primordial no desenvolvimento, manutenção e reparo da matriz extracelular4. A hipertrofia condrócito (CH) é um dos principais sinais patológicos do desenvolvimento da OA. Caracteriza-se pelo aumento do tamanho celular, diminuição da produção de proteoglicano e aumento da produção de enzimas degradantes da matriz de cartilagem que eventualmente levam à degeneração da cartilagem5,6,7. Além disso, alterações patológicas no osso subcondral e no sinóvio da articulação desempenham um papel importante no desenvolvimento e progressão da OA8,,9,10,11,12. Até o momento, não existem terapias curativas existentes que inibam a degeneração da cartilagem1,2,3,13,14. Assim, há extensas pesquisas em andamento que visam compreender a patologia da OA e descobrir novas abordagens terapêuticas que são capazes de retardar ou até mesmo parar o OA. Assim, há uma necessidade crescente de uma abordagem quantitativa e reprodutível que permita uma avaliação precisa das alterações patológicas associadas à OA na cartilagem, sinóvio e osso subcondral da articulação.
Atualmente, a gravidade e a progressão do OA são avaliadas principalmente usando os sistemas de pontuação OARSI ou Mankin15. No entanto, esses sistemas de pontuação são apenas semiquantitativos e podem ser influenciados pela subjetividade do usuário. Mais importante, eles não conseguem avaliar com precisão mudanças sutis que ocorrem na articulação durante a doença ou em resposta à manipulação genética ou a uma intervenção terapêutica. Há relatos esporádicos na literatura descrevendo análises histomorfométricas da cartilagem, sinóvio ou osso subcondral16,,17,,18,,19,,20,21. No entanto, ainda falta um protocolo detalhado para análise histomorfométrica rigorosa e reprodutível de todos esses componentes articulares, criando uma necessidade não atendida no campo.
Para estudar alterações patológicas na OA usando análise histomorfométrica, utilizou-se um modelo cirúrgico de rato oa para induzir OA através da desestabilização do menisco medial (DMM). Entre os modelos estabelecidos de Murine OA, a DMM foi selecionada para o nosso estudo por envolver um mecanismo menos traumático de lesão22,,23,24,25,26. Em comparação com as cirurgias de lesão meniscal-ligamento (MLI) ou lesão do ligamento cruzado anterior (ACLI), a DMM promove uma progressão mais gradual da OA, semelhante ao desenvolvimento de OA em humanos22,24,25,26. Os camundongos foram eutanizados doze semanas após a cirurgia de DMM para avaliar alterações na cartilagem articular, osso subcondral e sinóvio.
O objetivo deste protocolo é estabelecer uma abordagem padronizada, rigorosa e quantitativa para avaliar as mudanças conjuntas que acompanham a OA.
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Protocol
Os ratos C57BL/6 de 12 semanas foram comprados da Jax Labs. Todos os ratos foram alojados em grupos de 3-5 ratos por gaiola micro-isolador em uma sala com um cronograma de luz/escuro de 12 horas. Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com o Guia do Instituto Nacional de Saúde (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso animal da Universidade Estadual da Pensilvânia.
1. Modelo cirúrgico de osteoartrite pós-traumática (PTOA)
- Anestesia camundongos usando uma combinação de cetamina (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg) através de injeção intraperitoneal, administram buprenorfina (1 mg/kg) através de injeção intraperitoneal para alívio da dor e raspam o cabelo sobre o joelho. Verifique a falta de um reflexo do pedal antes de iniciar a cirurgia.
- Realizar a desestabilização da cirurgia do menisco medial (DMM) como descrito anteriormente22,23.
NOTA: Consulte as referências de Glasson et al. e Singh et al. para obter informações mais detalhadas sobre o protocolo cirúrgico22,23.- Faça uma incisão longitudinal de 3 mm da patela distal ao platô tibial proximal da articulação do joelho direito. Use uma sutura para deslocar o tendão patelar.
- Abra a cápsula articular medial para o tendão e mova a almofada de gordura infrapatelar para visualizar a região intercondylar, o menisco medial e o ligamento meniscotibial23.
- Transcção do ligamento meniscotibial medial para completar o DMM e desestabilizar a articulação22,23. Feche o local da incisão com grampos ou suturas.
- Realizar cirurgias falsas após um procedimento semelhante, mas sem transsecção do ligamento meniscotibial medial.
NOTA: Os camundongos foram randomizados para receber uma cirurgia de DMM ou falsa. De acordo com a literatura publicada anteriormente, os camundongos desenvolvem Um PTOA significativo 12 semanas após a cirurgia DMM22,23,24.
2. Eutanásia do rato e coleta de amostras
- Eutanásia do rato
- Doze semanas após o DMM, anestesiar camundongos usando uma combinação de cetamina (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg) através de injeção intraperitoneal.
- Faça uma incisão midline através da pele ao longo do tórax e retraia a caixa torácica para expor o coração para fixação por perfusão27.
NOTA: Consulte a referência gage et al. para obter informações adicionais sobre o protocolo para fixação adequada de roedores, bem como a representação em vídeo da montagem e procedimentos adequados do equipamento27. - Configure o aparelho de perfusão de acordo com o protocolo do fabricante.
- Eutanie o rato por perfucidade de soro fisiológico heparinizado através do ventrículo esquerdo até que o sangue seja limpo e o fígado fique pálido. Perfuja o mouse com formalina tamponada neutra de 10% até que a fixação completa do mouse seja alcançada.
NOTA: Um mouse perfundido com sucesso ficará rígido. O tempo médio de perfusão usando o sistema de bomba automatizado é de 5 a 7 min.
- Coleta e preparação de amostras
- Isole os joelhos cortando o osso no meio do fêmur e na tíbia média e disseque o tecido muscular circundante.
- Continue a fixação armazenando as articulações do joelho em formalina tampão 10% neutra à temperatura ambiente por 24 h, depois a 4 °C por 6 dias.
- Descalcifique o osso armazenando a amostra no tampão de decalcificação EDTA por 1 semana a temperatura ambiente com leve agitação28. Altere a solução de buffer de decalcificação a cada 3 dias.
NOTA: O tampão de descalcificação foi preparado dissolvendo 140 g de tetrasódio edta ultrapuro em uma solução de 850 mL de água destilada mais 15 mL de ácido acético glacial. O tampão foi equilibrado para 7,6 por adição de ácido acético glacial à solução. Ao atingir o pH = 7,6, o tampão foi trazido para 1 L de volume total com água destilada. O tampão de descalcificação foi preparado fresco e usado dentro de uma semana de preparação. - Lave os joelhos com 50% de etanol, depois 70% de etanol por 15 min cada, depois processe para incorporação.
NOTA: O processamento da transferência de fluidos foi realizado pelo Núcleo molecular e histopatológico do Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Consulte o núcleo de histologia da instituição para obter recomendações sobre o processamento ideal da amostra. - Incorporar os joelhos do rato na parafina com o aspecto medial da articulação voltado para a superfície inferior do bloco de parafina. Aplique uma leve pressão no lado tibial da articulação durante a incorporação para garantir que as superfícies tibiais e femorais estejam o mais próximo possível do mesmo plano.
3. Secção de microtome e seleção de slides
- Secção de microtomes
- Use os botões de ajuste do plano no suporte do bloco do microtome para garantir a adequada face do bloco de amostra.
- Enfrente o bloco de parafina para que o aspecto distal do fêmur, região proximal da tíbia, e chifres anteriores e posteriores do menisco medial apareçam no mesmo plano para coleta de seção(Figura Suplementar 1A). Comece a coletar seções em slides quando os chifres anteriores e posteriores do menisco medial começam a se separar um do outro.
- Certifique-se de que a tíbia, fêmur e menisci apareçam no mesmo plano comparando tamanhos de estrutura. A tíbia e o fêmur devem ser de tamanho comparável, com ambos os chifres meniscos semelhantes em tamanho e forma(Figura Suplementar 1A). Se uma estrutura parece muito grande em comparação com sua contraparte, isso indica que são necessários enfrentamentos adicionais. Importante, confirme que o espaço articular permanece intacto.
- Pegue as seções sagitais dos joelhos do mouse embutidos para fina através do compartimento articular medial em seções de 5 μm e colete as seções em slides. Coletar aproximadamente 30 seções por bloco de parafina.
- Seleção de slides
- Selecione três seções representativas com 50 μm de distância para cada amostra a partir da quinta seção (ou seja, slides 5, 15 e 25). Slides selecionados serão usados para coloração subseqüente, pontuação OARSI e análise histomorfométrica.
NOTA: A partir de um bloco com 30 seções totais, selecione slides desde o início (slides 5-10), médio (slides 15-20) e final (slides 25-30) do conjunto para representar claramente toda a amostra. Selecione slides de níveis semelhantes de profundidade entre as amostras.
- Selecione três seções representativas com 50 μm de distância para cada amostra a partir da quinta seção (ou seja, slides 5, 15 e 25). Slides selecionados serão usados para coloração subseqüente, pontuação OARSI e análise histomorfométrica.
4. Hematoxilina, Laranja Safranin e Coloração verde rápida
- Deparafinaos os slides selecionados com três alterações de xileno. Hidrate os slides com duas variações de 100% de etanol, duas variações de 95% de etanol e uma variação de 70% de etanol.
- Manche as lâminas com hematoxilina por 7 min e depois lave com água corrente por 10 min. Manche com verde rápido por 3 min e enxágue em ácido acético glacial de 1,0% para 10 s. Manche com Safranin-O por 5 min e enxágue rapidamente mergulhando em 0,5% de ácido acético glacial.
- Enxágüe slides em duas mudanças de água destilada e deixe o ar secar.
- Desça slides em três mudanças de xileno por 5 min cada, em seguida, monte com mídia de montagem baseada em xileno e um deslizamento de cobertura.
NOTA: A hematoxilina serve como mancha nuclear para identificar áreas de medula óssea. Safranin-O é usado para colorir cartilagem, proteoglicanos, mucina e grânulos de células de mastro. Fast Green é usado como contra-mancha para osso.
5. Slide imaging
- Imagem os slides manchados Safranin-O e Fast Green usando uma câmera disponível conectada a um microscópio e software de imagem baseado em computador.
- Abra o software de imagem (ver Tabela de Materiais) e organize a região de interesse da articulação do joelho (ROI) no centro da janela de imagem. Se utilizar um estágio de slide de microscópio rotacional, alinhe o slide de modo que a superfície da tíbia atravesse a largura do eixo horizontal da região de imagem.
- Defina o balanço de branco da câmera antes de começar a visualizar um conjunto de amostras(Figura Suplementar 2). Imagem do compartimento articular em ampliação de 4x e 10x, garantindo que tanto a superfície articular tibial quanto femoral e o osso subcondrato tibial estejam incluídos em cada um dos ROIs de imagem(Figura Suplementar 1A, B). Salvar imagens para cada um dos três níveis selecionados a serem usados para pontuação OARSI.
NOTA: A definição do balanço de branco da câmera dependerá do software e dos sistemas de câmera que estão sendo usados. Geralmente, navegue até a guia da câmera ou menu principal de imagem e role para baixo para definir balanço de branco. Selecione Definir balanço de branco e um pequeno cursor ou ícone deve aparecer(Figura Suplementar 2A). Usando o cursor, selecione uma área dentro da imagem/amostra livre de manchas, como o espaço articular, para definir o balanço de branco.
6. Sociedade Internacional de Pesquisa de Osteoartrite (OARSI) marcando15 pontos
- Alesuamente os três slides selecionados safranin-o e fast green manchados de todas as amostras.
- Executar pontuação OARSI de forma cegacom três observadores. Resumidamente, exiba uma imagem de cada vez em uma ordem aleatória e permita que três observadores marquem cada imagem, correlacionando-se com um dos três níveis selecionados para cada amostra.
NOTA: Consulte a tabela de pontuação OARSI para obter descrições detalhadas da escala de classificação15. - Calcule a pontuação média de cada seção usando pontuações individuais de cada observador. Determine a pontuação média por amostra, tomando a pontuação média das três seções representativas.
7. Análise histomorfométrica
NOTA: Imagens ao vivo da articulação do joelho são visualizadas em um monitor touchscreen usando uma câmera de microscópio, e uma caneta é usada para rastrear manualmente os ROIs. Algoritmos incorporados do software de histomormormetria quantificam os parâmetros especificados (ver Protocolo abaixo) nos ROIs definidos. É importante ressaltar que as mesmas seções manchadas safranin-O e fast green utilizadas na pontuação OARSI são usadas para análise histomorfométrica.
- Preparação e medição de software
- Ligue o microscópio, a câmera, o computador e o monitor touchscreen. Clique no Ícone do Software para iniciar o programa de software. Coloque o slide no estágio do microscópio para visualização.
- Centralizar a amostra dentro da janela de medição. Certifique-se de que a grade de medição está configurada para a ampliação adequada para corresponder ao objetivo utilizado no microscópio(Figura Suplementar 3).
- Vá para a guia Arquivo na parte superior da tela e role para baixo para As Configurações de Leitura. Abra a janela Configurações e selecione o arquivo de configurações apropriada para os parâmetros a serem medidos.
- Selecione o parâmetro a ser medido a partir da lista no lado direito da tela(Figura Suplementar 3). Use o cursor de estilete ou mouse para rastrear imagens de acordo com as etapas descritas abaixo, a fim de medir os ROIs específicos do tecido. Quando concluído com cada medição, clique com o botão direito do mouse para finalizar a medição e continuar até o próximo parâmetro.
NOTA: A lista de parâmetros a serem medidos é criada por meio de um arquivo de preferência distinto que é configurado em consulta com a empresa de software com o objetivo de medir os ROIs descritos. Consulte a discussão para obter mais detalhes sobre a configuração completa. - Complete todas as medições e navegue até a guia Dados resumidos na parte inferior da tela do software(Figura Suplementar 3). Clique na janela da tela, clique na tecla Inserir no teclado ou copiar e cole os dados em uma planilha separada.
NOTA: Realize a análise histomorfométrica de forma aleatória e cega. Após completar todas as medições de parâmetros para todas as amostras, organize os dados e média das medições das três lâminas de cada amostra.
- Medições das áreas de cartilagem total, calcificada e não calcificada
NOTA: Use um software comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais)para executar essas etapas. Consulte a Figura Suplementar 1B,C para esclarecimento sobre as regiões da cartilagem, junções e regiões ósseas subcondradas discutidas ao longo desta seção.- Desenhe uma linha através da borda superior da superfície da cartilagem tibial onde a cartilagem encontra o espaço articular. Desenhe uma segunda linha na junção condro-osséous onde a cartilagem calcificada encontra o osso subcondral (Figura 1B). Use a função Área do software para obter automaticamente a medição total da área da cartilagem.
- Desenhe uma linha ao longo da maré, uma linha de ocorrência natural que separa as regiões calcificadas e não calcificadas da cartilagem. Desenhe uma segunda linha na junção condro-osséous onde a cartilagem calcificada encontra o osso subcondral (Figura 1B). Use a função Área do software para obter automaticamente a medição da área de cartilagem calcificada.
- Calcular a área de cartilagem não calcificada subtraindo a área de cartilagem calcificada da área total da cartilagem (Figura 1B).
- Determinação do número de condrócito e fenótipo
- Crie funções de contagem separadas dentro das configurações do software de histomormormetria para distinguir a matriz produtora e a matriz de condrócitos não-produtores(Figura 1B).
- Determine o número de matrizes que produzem ou não produzem condrócitos usando o estilete para fazer um pequeno pontilhado sobre cada condrócito expressando o fenótipo especificado(Figura 1B).
NOTA: Conte células de acordo com seu fenótipo como produção de matriz (ou seja, forte coloração de Safranin-O) ou não-produção de matriz (ou seja, muito fraca ou sem coloração de Safranin-O).
- Medição do perímetro de superfície articular tibial
- Meça o perímetro absoluto da superfície articular tibial traçando uma linha através da superfície da cartilagem tibial, definindo cuidadosamente fibrilações individuais(Figura 1C).
- Desenhe uma segunda linha ao longo da marca de maré para servir como um controle interno para o plano de cada seção (Figura 1C).
- Calcule o índice de fibrilação da superfície articular tibial dividindo o perímetro da superfície articular tibial pelo perímetro da maré.
NOTA: Os perímetros de maré são geralmente iguais entre as amostras, de modo que a diferença nos perímetros articulares entre a farsa e o DMM foi geralmente pequena se o perímetro absoluto ou o índice de fibrilação foram usados.
- Medição das áreas de espaço subcondral de osso e medula
- Meça a área espacial da medula subcondral usando a função Área delineando regiões na região subcondral manchadas apenas com hematoxilina (ou seja, negativo para Verde Rápido) para determinar a área total da medula dentro do osso subcondrado. Desenhe linhas ao redor do perímetro dessas áreas para determinar a área total de todo o espaço da medula dentro do osso subcondrato tibial (Figura 2B).
- Meça a área subcondral total utilizando a função de área delineando a região entre a junção condro-osséous e a borda superior da placa de crescimento, estendendo-se lateralmente às regiões dos osteófitos anteriores e posteriores(Figura 2B).
- Calcular a área óssea subcondral subtraindo a área de espaço da medula óssea subcondral da área subcondral total (Figura 2B,C).
- Medição das áreas osteófitos anterior e posterior
- Para medir a área dos osteófitos, trace os osteófitos anteriores e posteriores da tíbia proximal utilizando a função Área (Figura 2B,E,F).
NOTA: Osteófitos são projeções ósseas que se formam entre a cartilagem articular e a placa de crescimento, anterior ou posterior à região subcondral. As áreas de osteófitos nos lados anterior e posterior da tíbia são determinadas traçando a área anterior ou posterior ao osso subcondral. A junção entre os osteófitos e osso subcondral é claramente delineada por uma linha de células que se estende da cartilagem articular até a placa de crescimento. A junção entre o osteófito e o sinóvio é definida por uma transição entre tecido ósseo e fibroso.
- Para medir a área dos osteófitos, trace os osteófitos anteriores e posteriores da tíbia proximal utilizando a função Área (Figura 2B,E,F).
- Medição da espessura sinovial
- Meça a espessura do femoral anterior usando a função Área desenhando uma linha do ponto de inserção interna do sinóvio anterior no fêmur em direção ao seu ponto de fixação no menisco(Figura 3B).
- Desenhe uma segunda linha da inserção externa do sinóvio no fêmur em direção ao seu apego ao menisco (Figura 3B).
- Calcule a espessura sinovial dividindo a área sinovial total pelo perímetro sinovial.
8. Análise estatística
- Coletar os parâmetros medidos e média dos resultados das três seções representativas para cada amostra. Analise os dados usando um teste t de student não emparelhado para comparar dois grupos ou ANOVA unidirecional para comparar três ou mais grupos.
- Exibir os dados como erro médio ± padrão de média.
NOTA: A significância estatística foi alcançada em p ≤ 0,05.
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Representative Results
OA induzido por DMM resulta em degeneração da cartilagem articular e perda de condrócito
A OA induzida pelo DMM resultou em um aumento da pontuação de OARSI em comparação com camundongos falsos, caracterizado distintamente pela erosão da superfície e perda de cartilagem(Figura 1A,D). O protocolo de histomormormetria detalhado aqui detectou várias alterações associadas à OA, incluindo uma diminuição na área total da cartilagem e na área de cartilagem não calcificada (Figura 1A,B,E,G); redução do número total de condrócitos; e, importante, perda de matriz produtora de condrócitos(Figura 1H,I). Alterações na superfície articular, indicativas da gravidade da erosão, foram avaliadas utilizando-se o índice de fibrilação da cartilagem. No geral, o índice de fibrilação aumentou em camundongos DMM(Figura 1C,K,L). No entanto, também é importante notar que o índice de fibrilação pode diminuir no estágio final da OA devido à erosão completa da superfície da cartilagem, conforme discutido no Protocolo. Um aumento no índice de fibrilação significa a degeneração da superfície da cartilagem articular durante o desenvolvimento e progressão da OA. Esses resultados destacam a capacidade do programa de análise histomorfométrica de detectar e quantificar alterações patológicas da cartilagem que caracterizam a progressão da OA.
Avaliação de outras alterações conjuntas na OA induzida pelo DMM
OA afeta tecidos articulares que não sejam a cartilagem, e as alterações patológicas nesses tecidos desempenham um papel crucial na progressão da doença. Aqui, o método de análise histomorfométrico descrito revelou um aumento na área óssea subcondral e uma redução na área do espaço da medula óssea em camundongos DMM (Figura 2A–D),indicando esclerose óssea subcondral29,30. Ambas as áreas de osteófito sumidouro também aumentaram em camundongos DMM(Figura 2E,F),sugerindo uma remodelagem óssea subcondral em curso que atua como um mecanismo compensatório para lidar com alterações na carga articular no local da lesão29,30.
A análise histomorfométrica do sinóvio mostrou aumento da espessura sinovial em camundongos DMM(Figura 3A–C),que é um desfecho típico da inflamação sinovial associada ao OA e da difusão de citocinas inflamatórias no espaço articular11,,12,31,32,33,34.
Análise da variabilidade entre o oARSI e a histomormormetria
A Figura 4A não apresenta variabilidade interusuário significativa tanto da análise histomorfométrica da área da cartilagem não calcificada(Figura 4A)quanto do escore OARSI(Figura 4B). No entanto, a análise histomorfométrica mostrou uma diferença média extremamente baixa entre observadores variando de -0,0001179-0,00120, levando a uma sobreposição quase completa dos resultados obtidos pelos três observadores, enquanto a diferença média entre os observadores foi maior na pontuação OARSI variando de -0,3-0,3 com um claro desvio dos valores de O1 dos valores de O2 e O3.
Figura 1: Histomormormetria da cartilagem articular tibial e fenótipos condrócitos articulares de cirurgia falsa e camundongos DMM. (A) Superfície articular tibial manchada com Safranin-O/Fast Green. (B) A análise histomorfométrica foi utilizada para traçar a área total da cartilagem e a área de cartilagem calcificada (laranja). A cartilagem superior à área de maré foi calculada como cartilagem não calcificada (verde). Os condrócitos de matriz (branco) e condrócitos não produtores matriciais (magenta) foram contados dentro da área de cartilagem não calcificada. (C) O perímetro de superfície articular tibial foi medido traçando a superfície articular (linha azul) seguida da maré (linha roxa) para determinar o índice de fibrilação. (D) A pontuação OARSI aumentou em camundongos DMM. (E–L) Representação gráfica das áreas de cartilagem quantificada e contagem de condrócitos de camundongos falsos e DMM. Em comparação com camundongos falsos, os camundongos DMM apresentaram diminuição da área total da cartilagem tibial(E),área de cartilagem calcificada tibial(F),cartilagem tibial não calcificada(G),número total de condrócitos tibial(H),matriz tibial que produz condrócitos, (I)e matriz tibial não-produtora de condrócitos(J). Em comparação com camundongos falsos, os camundongos DMM aumentaram o perímetro articular da superfície tibial(K)e aumentaram o índice de fibrilação articular da superfície tibial(L). As imagens foram tiradas usando ampliação de 10x. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, e ****P < 0.0001 utilizando t-test não pareado com a correção de Welch, os valores são expressos como média ± SEM; n = 5/grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Histomormormetria da área de medula óssea subcondrada e área óssea subcondral de cirurgia falsa e camundongos DMM. ( A) Cartilagem articular tibial e osso subcondral manchado com Safranin-O/Verde Rápido. (B) As áreas de medula óssea subcondral (verde), área óssea subcondral (magenta), área osteófito anterior (amarela) e área de osteófito posterior (cinza) foram traçadas com software de histomormetria computada. (C–F) Áreas histomorfométricas grafadas entre os camundongos Sham e DMM. Em comparação com os camundongos falsos, os camundongos DMM apresentaram uma área óssea subcondrada tibial aumentada(C)e áreas de osteófito sébial anterior e posterior(E–F),bem como diminuição da área de medula óssea subcondrada tibial em comparação com os camundongos-da-fita(D). As imagens foram tiradas usando ampliação 4x. *P < 0.05, **P < 0.01 utilizando t-test sem par com a correção de Welch. Os valores são expressos como média ± SEM; n = 5/grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Histomormormetria de sinóvio de cirurgia falsa e camundongos DMM. (A) Synovium manchado com Safranin-O/Fast Green. (B) A espessura sinovial foi medida traçando a membrana sinovial meniscofemoral anterior através do aspecto anterior da articulação tibiofemoral (verde). (C) Representação gráfica de medidas de espessura sinovial utilizando software de histomormetria computada. Os camundongos DMM tiveram uma espessura sinovial aumentada em comparação com ratos falsos. As imagens foram tiradas em ampliação de 20x. P < 0.001 utilizando t-test não pareado com a correção de Welch, os valores são expressos como média ± SEM; n = 5/grupo; S = sinóvio; F = fêmur; e M = menisco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Variabilidade interusuário na pontuação OARSI versus análise histomorfométrica. (A) Medidas de área de cartilagem não calcificada obtidas por meio de histomormormetria por três observadores cegos (O1, O2, O3). (B) Escores de OARSI para ratos sham e DMM obtidos dos três observadores cegos. As linhas pontilhadas denotam o valor médio para cada grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Análise histológica das seções articulares tibiofemorais de rato safranin-o e verde-rápido. (A) Uma imagem de ampliação de 4x da articulação tibiofemoral. Áreas de foco são rotuladas. (B) Uma imagem de ampliação de 10x do ROI da junta tibiofemoral. As superfícies tibiais e femorais, bem como os chifres meniscos anteriores e posteriores são visualizados. O menisci tem aproximadamente o mesmo tamanho e o ROI de imagem está centrado no compartimento articular. (C) Uma imagem de ampliação de 40x da superfície tibial proximal. A linha de marés é rotulada como a linha entre as zonas de cartilagem não calcificada e calcificada. A junção osteoconal é rotulada entre a extremidade da cartilagem calcificada e o início do osso subcondral. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 2: Configuração do sistema de histomormormetria e calibração do balanço de branco da câmera. (A) Articulação tibiofemoral do mouse visualizada em ampliação de 4x na janela do software com balanço de branco não definido. Observe a guia de configurações da câmera na parte superior da tela e a seleção no menu suspenso para definir o balanço de branco. (B) Articulação tibiofemoral do rato em ampliação de 4x com balanço de branco definido. Observe a mudança na coloração e coloração da amostra, aumentando a capacidade do usuário de distinguir certas áreas da articulação tibiofemoral ao realizar medições. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 3: Configuração do software histomorfométrico antes das medições de análise histomorfométrica. Captura de tela representativa da janela do software histomorfométrico. Note que a seção de joelho do rato manchado está centrada na região de medição (grade amarela) e a escala de ampliação correta para a região é selecionada para corresponder ao objetivo que está sendo usado no microscópio (circulado em vermelho no canto superior direito da tela). A lista de parâmetros é exibida na coluna à direita da área de imagem e medição. A seleção de um parâmetro destacará o parâmetro, portanto, a Fibrilação Tibial é atualmente selecionada para ser medida. A guia Dados resumidos na parte inferior da janela é onde as medições de cada parâmetro para cada amostra serão organizadas e salvas para serem exportadas após a conclusão de cada medição de parâmetros para cada seção. Clique aqui para baixar este número.
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Discussion
Pesquisas recentes de osteoartrite melhoraram nossa compreensão do crosstalk entre os diferentes tecidos dentro da articulação e o papel que cada tecido desempenha na iniciação ou progressão da doença8,9,10,35,36. Assim, tornou-se óbvio que a avaliação da OA não deve se limitar à análise da cartilagem, mas também deve incluir a análise do osso subcondral e do sinóvio. Apesar disso, a cartilagem articular tem sido o foco principal da pontuação semiquantitativa de OA15,37,38. Embora a histomorfometria computada já tenha sido aplicada em várias áreas da pesquisa musculoesquelética39,40,41,42,43,44, há uma lacuna não atendida na descrição de um protocolo para analisar com precisão e reprodutência alterações discretas na multiplicidade de tecidos dentro do compartimento articular do joelho durante a OA. A aplicação de medidas de análise histomorfométrica para quantificar alterações na cartilagem, osso subcondral e sinóvio fornece uma avaliação mais holística das alterações primárias e secundárias nas articulações de OA.
Aqui, descrevemos pela primeira vez um protocolo detalhado que utiliza um software de análise histomorfométrico computadorizado e semi-automatizado para quantificar alterações patológicas em diferentes compartimentos articulares e avaliar o desenvolvimento, progressão ou regressão da OA. Deve-se tomar cuidado durante a preparação da amostra, pois manchas claras e consistentes de Safranin-O e Verde Rápido são essenciais para limitar a ambiguidade ao rastrear e tomar medidas com software histomorfométrico. É aconselhável usar novas soluções de coloração para cada lote de slides. Além disso, a seleção de slides para coloração deve ocorrer em níveis consistentes entre os blocos. O primeiro slide deve ser tomado em um nível semelhante entre as amostras, idealmente assim que os chifres meniscos anteriores e posteriores começarem a se separar.
Durante a OA, as áreas totais de cartilagem e cartilagem não calcificada diminuem devido à fibrilação e degeneração da cartilagem. Em OA grave, a degeneração completa da cartilagem calcificada também pode ocorrer. O protocolo destaca a importância de determinar o fenótipo condrócito como uma avaliação da progressão da OA para a avaliação da sinalização anabólico versus catabólico na cartilagem. O número total de condrócitos e o número de condrócitos matriciais (anabolizantes) são elevados na cartilagem normal e baixos na cartilagem de OA, onde a maioria dos condrócitos existentes em OA são não-produzidos matrizes (cataboliz). É importante ressaltar que este parâmetro essencial no campo da descoberta terapêutica da OA não é avaliado pelos sistemas de pontuação oARSI ou mankin. Certas intervenções que não só preservam a área da cartilagem e o número de condrócitos, mas também promovem fenótipo anabólico condrócito podem ser abordagens terapêuticas mais eficazes.
O protocolo aqui detalhado também fornece um método para medir quantitativamente as mudanças sutis nas fibrilações superficiais da cartilagem presentes em OA leve a moderado. Um maior número de fibrilações significa uma maior medição do perímetro devido à presença de recuos na superfície articular. Assim, o perímetro de superfície articular tibial e o índice de fibrilação são baixos na cartilagem normal, intermediários em OA leve devido a algumas fibrilações, alto em OA moderado devido a mais fibrilações, mas novamente baixo em OA grave devido à completa degeneração e perda da cartilagem.
Remodelagem óssea subcondral e esclerose são sinais patológicos característicos de OA, resultando em redução da área de espaço da medula subcondral e aumento da área óssea subcondral8,9,10,29,30. A quantificação das alterações na área óssea subcondral e na área espacial da medula subcondral descrita no protocolo demonstram a importância da compreensão das alterações multitecidos como um componente condutor para a natureza complexa do desenvolvimento e progressão da doença de OA. A medição das áreas osteófitos anterior estofila fornece uma visão importante da escala de remodelação óssea que ocorre dentro da articulação. A área de osteófitos é extremamente pequena nos joelhos operados por fraude e é aumentada devido à formação de osteófitos em OA. A medição da área anterior dos osteófitos difere ligeiramente da medição da área dos osteófitos posteriores devido à natureza severa da remodelação óssea ocorrida na região medial do joelho, próximo ao local da lesão do DMM.
Finalmente, este protocolo descreve uma avaliação quantificável das alterações na membrana sinovial. A espessura sinovial é baixa em juntas falsas e aumenta em OA. A inflamação em OA leva ao espessamento da membrana sinovial para aumentar a entrega de citocinas inflamatórias e outros fatores para o espaço articular10,11,1231,32. Assim, é essencial avaliar a inflamação articular como fator modulador da progressão da doença de OA.
O uso do software de histomormormetria é limitado pela disponibilidade do hardware: monitores touchscreen ou tablets com uma caneta são absolutamente necessários dada a quantidade de rastreamento manual necessária para tomar medidas precisas. Tentar medir pequenas áreas com o software de histomormetria também pode ser limitador, já que o tamanho da caneta é restrito a um diâmetro. Embora essa incapacidade de medir pequenas áreas possa ser inconveniente, as áreas conjuntas medidas são facilmente definidas com a ferramenta de área, e a baixa discriminação do software faz uma diferença insignificante na medição final.
Deve-se notar também que a variabilidade entre usuários é sempre uma área de preocupação quanto à implementação de um protocolo quantitativo confiável e reprodutível. Estabelecer um protocolo de histomormetria eficaz, reprodutível e rigoroso requer limitar variáveis de composição potenciais dentro da análise experimental, incluindo a redução da variabilidade entre usuário. No entanto, após uma breve sessão de treinamento (cerca de 30 min) com o software, os membros do laboratório foram capazes de gerar medições altamente consistentes e reprodutíveis, onde a distribuição das medições entre os usuários reflete mais de uma sobreposição direta representando quase nenhuma variabilidade entre usuário. É importante ressaltar que este protocolo de histomormormetria demonstra um método eficiente para quantificar diferenças ainda discretas entre amostras falsas de forma altamente reprodutível.
O sistema de pontuação OARSI é uma medida comumente utilizada de avaliação para danos na cartilagem em pacientes com OA e modelos experimentais de murina15. O sistema de pontuação é baseado em uma escala de números inteiros focada principalmente na extensão das fissuras/erosão ou na superfície articular. Embora não tenhamos encontrado variabilidade interusuário significativa com os escores do OARSI em nosso experimento, ainda houve uma maior diferença média entre os observadores, versus quase nenhuma no protocolo de histomorfiza descrito. Assim, estabelecer este protocolo reprodutível para análise histomorfométrica de parâmetros definidos permite medições altamente consistentes de cada amostra, mesmo entre múltiplos usuários, removendo parte da natureza subjetiva da análise amostral.
O sistema de pontuação padronizado OARSI é um marco para a pesquisa da OA. No entanto, a natureza limitada baseada em pontuação do sistema não permite quantificação de mudanças sutis ocorridas dentro da articulação. A avaliação conjunta expandida descrita neste manuscrito usando software de histomormetria fornece uma caracterização aprimorada e menos subjetiva da gravidade da OA. Este protocolo é otimizado para camundongos que sofreram uma indução cirúrgica de OA. Os procedimentos e técnicas podem ser aplicados para avaliação de OA em outros modelos e hipóteses, no entanto.
Em resumo, o protocolo detalhado aqui fornece um guia claro para uma abordagem quantitativa semiautomatizada rigorosa e reprodutível para investigar a patologia da OA ou avaliar intervenções terapêuticas.
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Disclosures
Nenhum
Acknowledgments
Gostaríamos de reconhecer a assistência da equipe do Departamento de Medicina Comparada e do núcleo molecular e histopatológico do Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Fontes de financiamento: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
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