Her karakteriserer vi cellulære proteotoksiske stressresponser i nematoden C. elegans ved å måle aktiveringen av fluorescerende transkripsjonelle journalister og assaying følsomhet for fysiologisk stress.
Organismer blir ofte utsatt for varierende miljøer og endringer i intracellulær homeostase, som kan ha skadelige effekter på deres proteome og fysiologi. Dermed har organismer utviklet seg målrettet og spesifikke stressresponser dedikert til å reparere skade og opprettholde homeostase. Disse mekanismene inkluderer den utfoldede proteinresponsen til endoplasmatisk reticulum (UPRER),den utfoldede proteinresponsen til mitokondriene (UPRMT),varmesjokkresponsen (HSR) og oksidativ stressrespons (OxSR). Protokollene som presenteres her beskriver metoder for å oppdage og karakterisere aktiveringen av disse banene og deres fysiologiske konsekvenser i nematoden, C. elegans. For det første er bruk av veispesifikke fluorescerende transkripsjonelle reportere beskrevet for rask cellulær karakterisering, narkotikascreening eller storskala genetisk screening (f.eks. RNAi eller mutantbiblioteker). I tillegg beskrives komplementære, robuste fysiologiske analyser, som kan brukes til å direkte vurdere følsomhet en dyr til spesifikke stressfaktorer, og fungerer som funksjonell validering av transkripsjonsreporterne. Sammen tillater disse metodene rask karakterisering av cellulære og fysiologiske effekter av interne og eksterne proteotoksiske perturbasjoner.
Evnen til en organisme til å reagere på endringer i det intra- og ekstracellulære miljøet er avgjørende for sin overlevelse og tilpasning. Dette oppnås på cellenivå gjennom mange beskyttende veier som sikrer cellens integritet. Mens mange cellulære komponenter er utsatt for stress-assosiert skade, en stor involvering av cellulære stress responser er å reparere og beskytte homeostase av cellulær proteome. Men kompartaliseringen av proteiner i spesielle strukturer, kalt organeller, utgjør en utfordring for cellen, da den ikke kan stole på en sentralisert form for proteinkvalitetskontroll for å sikre at alle proteinene i cellen er riktig brettet og funksjonelle. Derfor, for å håndtere perturbasjoner til sine proteiner, har organeller utviklet dedikerte kvalitetskontrollmekanismer, noe som kan føle feilfoldede proteiner og aktivere en stressrespons i et forsøk på å lindre stresset i det rommet. For eksempel er cytosol avhengig av varmesjokkresponsen (HSR), mens endoplasmatisk reticulum (ER) og mitokondrier er avhengige av deres kupéspesifikke utfoldede proteinresponser (UPR). OxSR tjener til å lindre de toksiske effektene av reaktive oksygenarter (ROS). Hver stressrespons utløses i nærvær av cellulære utfordringer og miljøfornærmelser og induserer en skreddersydd transkripsjonsrespons. Kjennetegnene på disse svarene inkluderer syntetiserende molekyler som re-fold misfolded proteiner (som chaperones) rettet mot riktig organelle, eller alternativt fjerne skadede proteiner ved protein nedbrytning. Unnlatelse av å aktivere disse stressresponsene resulterer i akkumulering av skadede proteiner, cellulær dysfunksjon forplantet til systemisk svikt i vev, og til slutt død av organismen. Funksjonen og reguleringen av de ulike stresssvarene gjennomgås andre steder1.
Mange innsikter om regulering og aktivitet av cellulære stressresponser har blitt tilskrevet nematode, Caenorhabditis elegans, en flercellet modell organisme i genetisk forskning. Nematoder tillater ikke bare å studere aktivering av stressresponser på cellenivå, men også på organismenivå; nematoder har blitt brukt til å studere effekten av genetiske perturbasjoner eller eksponering for narkotika og forurensende stoffer på deres vekst og overlevelse. Deres raske generasjonstid, isogeni, åpenhet, genetisk tractability og brukervennlighet under eksperimentering gjør dem ideelle for slike studier. I tillegg gjør den relativt raske fysiologiske responsen på stress (mellom timer og noen dager) og evolusjonær bevaring av cellulære veier nematoder til et fremtredende verktøy for å studere stressresistens.
Det er to vanlige E. coli stammer som brukes som matkilde for å vokse C. elegans: standard OP50, en B-stamme der de fleste eksperimentering har blitt historisk utført2 og HT115, en K-12 stamme som brukes til nesten alle RNAi eksperimenter3,4. Det er viktig å merke seg at det er betydelige forskjeller mellom OP50 og HT115 bakterielle dietter. Vekst på disse forskjellige bakterielle kildene har vist seg å forårsake store forskjeller i metabolsk profil, mitokondrie DNA kopi nummer, og flere store fenotyper, inkludert levetid5. Noen av disse forskjellene tilskrives Vitamin B12 mangel forbundet med vekst på OP50 bakterier, noe som kan resultere i defekter i mitokondrie homeostase og økt følsomhet for patogener og påkjenninger. Alle disse fenotypene har vist seg å bli lindret av vekst på HT115 bakterier, som har høyere nivåer av vitamin B126. Derfor anbefales det at alle eksperimenter på fysiologiske stressresponser utføres på HT115-bakterier, uavhengig av nødvendigheten av RNAi-forhold. Men på grunn av den enkle å opprettholde dyr på OP50, kan all standard vekst (dvs. vedlikehold og forsterkning av dyr) utføres på OP50, da betydelige forskjeller i de eksperimentelle paradigmene som er beskrevet her ikke ble oppdaget i ormer opprettholdt på OP50 så lenge de ble flyttet til HT115 postsynkronisering (dvs. fra luke etter bleking med eller uten L1 arrestere) før eksperimentering.
Her er karakteriseringen av aktiviteten til cellulære stressresponser ved hjelp av to funksjonelle metoder beskrevet. Det bør bemerkes at protokollene som presenteres er primært fokusert på cellulære stressresponser og deres innvirkning på protein homeostase. For det første benyttes fluorescerende transkripsjonsreportere, som reguleres av endogene genarrangører som er spesielt aktivert som svar på ulike cellulære påkjenninger. Disse fluorescerende transkripsjonelle journalistene er basert på transkripsjonsinduksjon av spesifikke gener som er opprinnelig en del av stressresponsen. For eksempel aktiveres HSP-4, et varmesjokkprotein ortolog til den menneskelige chaperone HSPA5/BiP, på ER-stress og lokaliserer til ER for å lindre stresset. Under forhold med ER-stress (f.eks. eksponering for tunikamycin), et grønt fluorescerende protein (GFP), plassert under regulering av hsp-4-promotoren, syntetiseres i høye nivåer som kan vurderes ved fluorescerende mikroskopi eller kvantitativt målt ved hjelp av cytometri av nematoder7. På samme måte benyttes arrangøren av en mitokondriechaperone, hsp-6 (ortolog til pattedyr HSPA9), til å overvåke aktiveringen av UPRMT8, og arrangøren av den cytosolic chaperone hsp-16.2 (ortolog til de menneskelige krystallinske alfagenene) brukes til å vurdere aktiviteten til HSR9. Disse reporterne tillater en rask karakterisering av banene aktivert som svar på ulike perturbasjoner.
Ofte er journalistene som presenteres her avbildet ved hjelp av mikroskopi, noe som gir en kvalitativ effekt av aktiveringen av stressresponser. Men mens bildeteknikker gir både informasjon om intensitet og vevplassering av journalistene beskrevet ovenfor, er kvantifiseringen ikke alltid nøyaktig eller robust. Selv om det er mulig å kvantifisere fluorescerende aktivering ved hjelp av bildeanalyseverktøy, er disse metodene relativt lave gjennomstrømnings- og prøvestørrelsen liten, på grunn av det relativt lave antallet dyr avbildet. Den enkle og evne til å oppnå store mengder dyr raskt gjøre C. elegans et ideelt modellsystem for å si aktivering av fluorescerende stress reportere gjennom bruk av en stor partikkel flyt cytometer. En stor partikkelflyt cytometer er i stand til å registrere, analysere og sortere basert på størrelse og fluorescens fra mange levende dyr. Ved hjelp av denne metoden er det mulig å få fluorescerende intensitet, størrelse og også romlig (2D) informasjon for tusenvis av ormer. Systemet styres ved hjelp av FlowPilot, som gjør det mulig for sanntidsdatainnsamling og analyse av de målte parametrene. Her tilbys metoder for både mikroskopisk avbildning og kvantitativ analyse ved hjelp av et cytometer for storpartikkelflyt som metoder for å måle aktiveringen av stressresponser.
Utover reporteranalyse kan følsomheten eller motstanden til dyr mot stress måles ved hjelp av fysiologiske stressanalyser. Dette oppnås ved å utsette dyr for stressende miljøer som aktiverer spesifikke cellulære stressveier. Her er det gitt flere metoder for å måle følsomheten til hele dyr til bestemte typer stressfaktorer.
ER stress påføres C. elegans ved hjelp av kjemisk middel, tunikamycin, som blokkerer N-koblet glykosylering, forårsaker akkumulering av feilfoldede proteiner i ER10. I C. elegans,vekst ved eksponering for tunikamycin resulterer i store perturbasjoner i ER funksjon, og en betydelig redusert levetid11. Ved å måle overlevelsen av dyr på tunikamycinholdige plater, kan ER stressfølsomhet av dyr kvantifiseres. For eksempel har dyr med ektopisk UPRER induksjon og dermed økt motstand mot protein feilfolding stress i ER økt overlevelse ved tunicamycin eksponering sammenlignet med villtype dyr12.
Oksidativt og mitokondriestress påføres C. elegans ved å utsette dyr for det kjemiske middelet, paraquat. Paraquat er et vanlig ugressmiddel, noe som forårsaker superoksiddannelse spesielt i mitokondriene13. På grunn av den spesifikke lokaliseringen av mitokondrier-avledede reaktive oksygenarter (ROS), brukes paraquatanalyser ofte som en “mitokondrie” stressanalyse. Imidlertid blir superoksid raskt omdannet til hydrogenperoksid ved mitokondriesuperoksiddismutaser (SODs)14. Hydrogenperoksid kan deretter spre seg ut av mitokondriene og forårsake oksidativt stress i andre rom i cellen. Derfor beskriver vi paraquat overlevelseanalyser som målefølsomhet for både mitokondrie- og oksidativt stress (andre oksidative stressanalyser kan bli funnet15).
Termotoleranse analyser utføres i C. elegans ved å plassere dyr i forhøyede temperaturer. Omgivelsestemperaturer for nematoder er ~ 15-20 °C og termisk stress induseres ved temperaturer over 25 °C16,17. Termotoleranse analyser utføres vanligvis ved temperaturer fra 30-37 °C, da dyr viser store cellulære defekter ved denne temperaturen, og overlevelsesanalyser fullføres innen 24 timer16,18. Her er det gitt to alternative metoder for å utføre termotoleranseanalyser: vekst ved 34 °C og vekst ved 37 °C. Sammen kan protokollene som presenteres her brukes til å utføre store skjermer når de kombineres med standard genknock-down ved hjelp av RNA-interferens eller kjemiske legemiddelbiblioteker.
Protokollen kan deles inn i 4 brede prosedyrer- vekst av C. elegans og forberedelse til bildebehandling (avsnitt 1 og 2), avbildning av transkripsjonelle reportere ved hjelp av fluorescerende mikroskopi (avsnitt 3-5), kvantitative målinger av journalister ved hjelp av et cytometer for stor partikkelstrøm (avsnitt 6) og fysiologiske analyser for å måle stressfølsomhet i C. elegans (avsnitt 7).
Her beskrives metoder for å avhøre cellulære stressresponser i C. elegans, ved hjelp av fluorescerende transkripsjonsreportere og fysiologiske stressoverlevelsesanalyser. Journalistene bruker alle GFP-uttrykk drevet under arrangøren av et nedstrøms transkripsjonsmål for transkripsjonsfaktorene som er involvert i montering av cellulære stressresponser. Bruken av hsp-4p::GFP modulert av XBP-1s-mediert UPRER, hsp-6p::GFP kontrollert av ATFS-1-mediert UPRMT, gst-4p:…
The authors have nothing to disclose.
R.BZ. støttes av EMBO langsiktig fellesskap og Larry L. Hillblom Foundation. R.H.S støttes av stipend 5F32AG032023-02 gjennom National Institute of Aging (NIA) og Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A.F. støttes av gi F32AG051355 gjennom NIA. H.K.G. støttes av gi DGE1752814 gjennom National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. støttes av 1F31AG060660-01 til og med NIA. A.D. støttes av Thomas og Stacey Siebel Foundation, Howard Hughes Medical Institute, og 4R01AG042679-04 og 5R01AG055891-02 fra NIA, og 5R01ES021667-09 fra NIEHS. Vi takker Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet og Anel Esquivel for betydelig teknisk assistanse. Vi takker Morimoto-laboratoriet og CGC (finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) for stammer.
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | for mitochondrial stress |
Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118072 | for NGM plates |
BD Difco granulated agar | VWR | 90000-782 | for NGM plates |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 97061-904 | for NGM plates |
Carbenicillin | BioPioneer | C0051-25 | for RNAi |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | for NGM plates |
COPAS Biosorter | Union Biometrica | 350-5000-000 | equipped with a 488 nm light source. |
COPAS Cleaning Solution | Union Biometrica | 300-5072-000 | to use with COPAS |
COPAS Sheath Solution | Union Biometrica | 300-5070-100 | to use with COPAS |
DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | solvent for drugs |
IPTG dioxane free | Denville Scientific | CI8280-4 | for RNAi |
LB Broth Miller | Fisher Scientific | BP1426500 | for LB |
M205FA stereoscope | Leica | 10450040 | equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software |
Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-3 | for NGM plates, M9 |
Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | for oxidative/mitochondrial stress |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | for bleach soluton |
Potassium phosphate dibasic | VWR | EM-PX1570-2 | for NGM plates |
Potassium phosphate monobasic | VWR | EM-PX1565-5 | for M9 |
Revolve | ECHO | 75990-514 | equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 71289-50G | for imaging |
Sodium Chloride | EMD Millipore | SX0420-5 | for NGM plates, M9 |
Sodium phosphate dibasic | VWR | 71003-472 | for M9 |
Tert-butyl hydroperoxide | Sigma-Aldrich | 458139 | for oxidative stress |
Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | for RNAi |
Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | for ER stress |