Summary
Hier gepresenteerd is een protocol om de contractiele eigenschappen van gestreepte spier myofibrils met nano-Newton resolutie te beoordelen. Het protocol maakt gebruik van een setup met een interferometrie-gebaseerde, optische kracht sonde. Deze opstelling genereert gegevens met een hoge signaal-ruisverhouding en maakt de beoordeling van de contractiele kinetiek van myofibrils mogelijk.
Abstract
Gestreepte spiercellen zijn onmisbaar voor de activiteit van mens en dier. Enkele spiervezels bestaan uit myofibrils, die bestaan uit serieel verbonden sarcomeres, de kleinste contractiele eenheden in de spier. Sarcomerische disfunctie draagt bij aan spierzwakte bij patiënten met mutaties in genen die coderen voor sarcomerische eiwitten. De studie van myofibril mechanica maakt het mogelijk voor de beoordeling van actin-myosine interacties zonder mogelijke verstorende effecten van beschadigde, aangrenzende myofibrils bij het meten van de contractiliteit van enkele spiervezels. Ultrastructurele schade en verkeerde uitlijning van myofibrils kunnen bijdragen tot verminderde contractiliteit. Als er structurele schade aanwezig is in de myofibrils, breken ze waarschijnlijk tijdens de isolatieprocedure of tijdens het experiment. Bovendien geven studies in myofibrils de beoordeling van actin-myosine interacties in aanwezigheid van de geometrische beperkingen van de sarcomeres. Metingen in myofibrils kunnen bijvoorbeeld duidelijk maken of myofibrillar disfunctie het primaire effect is van een mutatie in een sarcomerisch eiwit. Bovendien is perfusie met calciumoplossingen of verbindingen bijna direct te wijten aan de kleine diameter van de myofibril. Dit maakt myofibrils bij uitstek geschikt om de snelheid van activering en ontspanning tijdens de krachtproductie te meten. Het protocol beschreven in dit document maakt gebruik van een optische kracht sonde gebaseerd op het principe van een Fabry-Pérot interferometer in staat om krachten te meten in de nano-Newton bereik, gekoppeld aan een piëzo lengte motor en een snelle perfusie systeem. Deze setup maakt het mogelijk om myofibril mechanica met hoge resolutie krachtmetingen te bestuderen.
Introduction
Gestreepte spiercellen zijn onmisbaar voor dagelijkse activiteiten. Limb beweging, ademhalingsfunctie, en de pompende beweging van het hart vertrouwen op de kracht gegenereerd door spiercellen. Skeletspier bestaat uit spiersfalo's met bundels van enkele spiervezels(figuur 1A). Deze spiervezels bestaan uit myofibrils, die worden gevormd door serieel verbonden sarcomeres (figuur 1B,D). De sarcomeres bevatten dunne en dikke filamenten. Deze bestaan voornamelijk uit ketens van actine- en myosinemoleculen (figuur 1B). Actin-myosine interacties zijn verantwoordelijk voor de kracht-genererende capaciteit van de spier. Patiënten met mutaties in genen die coderen voor sarcomerische eiwitten, zoals neveline, actine en troponine T, lijden aan spierzwakte als gevolg van contractieldisfunctie1.
De kwaliteit van spiercontractiliteit kan worden bestudeerd op verschillende niveaus van organisatie, variërend van in vivo hele spieren tot actin-myosine interacties in in vitro motility testen. In de afgelopen decennia hebben verschillende onderzoeksgroepen opstellingen ontwikkeld om de contractiliteit van individuele myofibrils2,3,4,5,6,7,,8,98,,10te bepalen ., Deze opstellingen zijn gebaseerd op de detectie van veranderingen in laserafbuiging van een cantilever (d.w.z. optische straalafbuiging) veroorzaakt door de samentrekking van de myofibril (zie Labuda et al.11). Hoewel het bepalen van de contractiele functie van myofibrils een aantal beperkingen heeft (bijvoorbeeld de dynamiek van de excitatie-contractiekoppelingsprocessen die stroomopwaarts van de myofibrils zijn, ontbreken er meerdere voordelen aan deze aanpak. Deze omvatten: 1) de mogelijkheid om actin-myosine interacties te beoordelen in aanwezigheid van de geometrische beperkingen van de sarcomeres; 2) de mogelijkheid om actin-myosine interacties te beoordelen zonder mogelijke verstorende effecten van beschadigde, aangrenzende myofibrils (bij het meten van de contractiliteit van enkele spiervezels ultrastructurale schade en verkeerde uitlijning van myofibrils zou kunnen bijdragen tot verminderde contractiliteit) (Figuur 1D); 3) de kleine diameter van myofibrils (~ 1 μm, figuur 2A) en het ontbreken van membranen zorgen voor bijna onmiddellijke calciumdiffusie in de sarcomeres. Bovendien, als structurele schade aanwezig is in de myofibrils, ze waarschijnlijk breken tijdens hun isolatie of tijdens het experiment. Vandaar dat het beoordelen van myofibril contractiliteit een elegante methode is om de basismechanismen van spiercontractie te bestuderen en te begrijpen of verstoorde actin-myosine-interacties de primaire oorzaak zijn van spierziekte veroorzaakt door mutaties in sarcomerische eiwitten.
Dit protocol presenteert een nieuw ontwikkelde setup om de contractiliteit van myofibrils met een cantilever kracht sonde met nano-Newton resolutie (dwz, Optiforce) te bepalen. Deze force probe is gebaseerd op het principe van interferometrie. Interferometrie maakt het gebruik van relatief stijve cantilevers mogelijk. Dit maakt het mogelijk om kracht te meten met weinig afbuiging van de cantilever, naderende isometrische samentrekkingen van de myofibril. De sonde maakt het mogelijk om lage passieve en actieve krachten te beoordelen die worden geproduceerd door een enkele myofibril geïsoleerd van verschillende spierbiopten, waaronder die van menselijke proefpersonen, met een hoge signaal-ruisverhouding. De optische cantilever force probe die in deze opstelling is opgenomen is gebaseerd op een Fabry-Pérot interferometer12. De interferometer detecteert kleine verplaatsingen tussen een optische vezel en een goudgecoate cantilever gemonteerd op een ferrule (figuur 3). De kloof tussen de optische vezel en de cantilever wordt de Fabry-Pérot holte genoemd. Myofibrils zijn gemonteerd tussen de sonde en piëzo motor met behulp van twee lijm-gecoate glas montage vezels. De kracht geproduceerd door de myofibril kan wiskundig worden afgeleid uit de interferometer gegevens. Interferometrie is gebaseerd op de superpositie of interferentie van twee of meer golven (in deze opstelling drie lichtgolven). Laserlicht met een golflengte tussen 1.528,77–1.563,85 nm wordt uitgestoten door de interferometer en wordt via de glasvezel verzonden. In de sonde wordt het licht gereflecteerd 1) op de interface tussen de optische vezel en het medium (figuur 3A); 2) op de interface van het medium en de cantilever (Figuur 3B); en 3) op de interface tussen de metalen en gouden coating van de cantilever (Figuur 3C). De reflectie bij interface A en B is afhankelijk van de brekingsindex(n)van het medium waarin de sonde wordt ondergedompeld. Het licht, bestaande uit de drie bovenliggende reflecties, keert terug naar een fotodiode in de interferometer. De fotodiode meet de intensiteit van het licht, wat het gevolg is van het interferentiepatroon van de drie boven elkaar geplaatste reflecties. Wanneer contractielkracht wordt gegenereerd door het activeren of uitrekken van een myofibril, trekt de myofibril aan de cantilever. Deze beweging verandert de spouwgrootte(d) en dus het aantal golflengten dat in de holte past. Het licht gereflecteerd op de cantilever zal een andere fase hebben, wat resulteert in een ander interferentiepatroon. De fotodiode registreert deze verandering van interferentie patroon intensiteit als een verandering in Volts. Vervolgens wordt myofibril krachtgeneratie berekend op basis van deze verandering, rekening houdend met de cantilever stijfheid. De krachtsonde wordt door de fabrikant gekalibreerd door het puntje van de montagenaald, bevestigd aan het vrije handeind van de cantilever, tegen een weegschaal te duwen terwijl het buigen van de cantilever gelijk blijft aan een veelvoud van de golflengte van de uitleeslaser13. Interferometrie is dus een zeer gevoelige methode om kleine veranderingen in afstand te detecteren, waardoor krachten met een nano-Newtonresolutie kunnen worden gemeten. Deze resolutie maakt de beoordeling van myofibrillar kracht productie met een hoge signaal-ruisverhouding. Terwijl traditionele interferometrie het bereik van metingen beperkt tot het lineaire deel van de interferentiecurve, overwint het gebruik van een lock-in versterker en modulatie van de lasergolflengte deze beperking14. Dit wordt nader toegelicht in de discussiesectie.
Om de actieve spanning van myofibril te meten, werd een fast-step perfusiesysteem geïntegreerd om de myofibril bloot te stellen aan calciumoplossingen(figuur 4A). Het snelle perfusiesysteem zorgt ervoor dat oplossingswijzigingen binnen 10 ms kunnen plaatsvinden. Vanwege hun kleine diameter is calciumdiffusie in de myofibrils bijna onmiddellijk. Daarom is dit systeem bijzonder geschikt voor het meten van de snelheid van actin-myosine binding tijdens activering en release tijdens ontspanning. De snelheid van activering (kACT)en ontspanning (kREL)kunnen worden bepaald aan de hand van de activatie-ontspanningscurven. Ook, door het blootstellen van de myofibrils aan calcium oplossingen van toenemende concentratie, de kracht-calcium relatie en calcium gevoeligheid kan worden bepaald.
Bovendien maakt een piëzolengtemotor het snel uitrekken en verkorten van de myofibril mogelijk. Dit biedt de mogelijkheid om de visco-elastische eigenschappen (d.w.z. passieve spanning) van de myofibril te bestuderen, evenals het uitvoeren van een snelle verkorting en restretch van de myofibril om de snelheid van spanningsherontwikkeling (kTR)te bepalen. De parameters die uit zowel actieve als passieve spanningsexperimenten worden opgehaald, kunnen worden gewijzigd door genmutaties in een sarcomerisch eiwit.
Deze op maat gemaakte setup werd gebruikt om de actieve en passieve contractiele kenmerken van myofibrils geïsoleerd van gezonde menselijke, geduldige en muis skeletspieren te meten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol voor het verkrijgen van menselijke biopten werd goedgekeurd door de instellingscommissie van het VU Medisch Centrum (#2014/396) en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van de proefpersonen. Het protocol voor het verkrijgen van dierlijke spierbiopten werd goedgekeurd door de lokale comité voor dierethiek van de Vrije Universiteit (AVD114002016501)
1. Voorbereiding en myofibril-isolatie
OPMERKING: Gebruik eerder beschreven methoden om biopten te glycereren, bereid de verschillende calciumconcentratie (pCa) oplossingenvoor 7,16,17en isoleert myofibrils2,18.
- Ontdooi de ontspannende (pCa 9.0, Rx) en activerende (pCa 4.5, Act) oplossingen evenals de remmers (1 M E64, 1 M DTT, 1 M leupeptine, 1 M PMSF), die worden opgeslagen bij -80 °C.
- Neem een glycerinated stuk gestreepte spierbiopsie van ongeveer 1 mm3 en plaats het in een kleine Petri schotel met 1:1 Rx/glycerol (v/v) oplossing en plaats de Petri schotel op een koude plaat bij 4 °C.
- Ontleden het stuk spier met behulp van dissectie microscoop en tangen, het scheiden van enkele spiervezels zonder ze te isoleren van het stuk van de spier.
OPMERKING: Verwijder zoveel mogelijk vet en bindweefsel om de besmetting van de myofibril suspensie te voorkomen. - Breng het stuk ontleed weefsel over in een buis van 5 mL met 1,5 mL ontspannende oplossing met remmers (1 μL/mL E-64, 1 μL/mL leupeptine, 1 μL/mL DTT en 125 μL/mL PMSF). Laat het weefsel gedurende 1 uur bij ongeveer 4 °C temperen.
- Tijdens de incubatie starten beide pc's, schakel u de apparaten in en opent u de bijbehorende software (zie Tabel met materialen).
- Dompel de krachtsonde onder in ultrazuiver water in een petrischaal en kalibreer de sonde.
- Druk op de'Wizard Starten'op de interferometer en volg de instructies op het scherm. Na het indrukken van Kalibreren,tik op de microscoop podium.
OPMERKING: Tikken op de microscoop stadium zal leiden tot de cantilever af te buigen en door franjes. Dit maakt kalibratie van de sonde mogelijk. - Laat de sonde ondergedompeld in het ultrazuivere water in de petrischaal na kalibratie.
- Druk op de'Wizard Starten'op de interferometer en volg de instructies op het scherm. Na het indrukken van Kalibreren,tik op de microscoop podium.
- Initialiseer de piëzomotorpositie. Volg hiervoor een van de onderstaande stappen.
- Wanneer de piëzomotor zal worden gebruikt voor kTR spanning, stel de lengte in op 0 μm.
De instellingen van de signaalgenerator zijn te vinden in tabel 1, figuur 5A. - Wanneer de piëzomotor wordt gebruikt voor passieve spanning, stelt u de lengte in op 50 μm.
De instellingen van de signaalgenerator zijn te vinden in tabel 1.
LET OP: Het verschil tussen de stappen is de initiële positie van de piëzolengtemotor. Om de myofibril uit te rekken, moet de piëzomotor trekken om de afstand tussen beide montagenaalden te vergroten en de myofibril te verlengen. Om de myofibril te verslappen, moet de piëzomotor duwen om de afstand tussen beide montagenaalden te verkleinen en de myofibril te verkorten.
- Wanneer de piëzomotor zal worden gebruikt voor kTR spanning, stel de lengte in op 0 μm.
- Maak een microscoopplaat. Pipette 150 μL polyhydroxyethylmethacrylaat (poly-HEMA) oplossing (5% poly-HEMA in 95% ethanol, w/v) op een microscoopglijbaan en spreid het over de glijbaan zodat het allemaal bedekt is.
LET OP: Als een myofibril hang is pipetted op een ongecoate microscoop dia, de myofibrils die zinken naar de bodem zal vasthouden aan de microscoop dia en het zal niet mogelijk zijn om ze te lijmen. - Vul spuiten met pCa-oplossingen (zie figuur 4A)en prime het perfusiesysteem.
LET OP: In deze stappen worden alle buizen voorgevuld met de juiste oplossing om ervoor te zorgen dat alle luchtbellen uit de slang worden verwijderd.- Vul de instroombuizen van de achtergrondstroom van de stroomkamer(figuur 3, 4A)met Rx.
- Spoel bij gebruik het spruitstuk door met ultrazuiver water om lucht te verwijderen. Sluit hiervoor de spuit met ultrazuiver water aan op de uitlaat en spoel erin in de omgekeerde richting. Blokkeer de ongebruikte poorten van het spruitstuk.
- Laat elke pCa spuit om hun respectieve buizen te vullen met pCa-oplossing. Sluit ze vervolgens aan op het spruitstuk en het Ɵ-glas.
- Open kleppen 1 en 6 met de data-acquisitie panel software (zie Tabel van materialen) door het controleren van de knop '1 +6' (Figuur 6A) om de Ɵ-glas te vullen met de ontspannende (pCa 9.0) en het activeren (4.5) oplossingen en sluit kleppen wanneer de Ɵ-glas is gevuld (Figuur 6B).
2. Montage van een myofibril
- Bekleed een microscoopplaat met poly-HEMA om te voorkomen dat myofibrils aan het glas blijven plakken.
- Bereid de homogenisator (zie Tabel van materialen)voor op weefselhomogenisatie. Reinig de interne rotorstaaf met schoon tissuepapier, monteer de homogenisator en draai 1x voor 15 s in alcohol en driemaal voor 15 s per stuk in ultrazuiver water. Prerinse de homogenisator in ontspannende oplossing 1 x voor 15 s op ijs.
- Plaats de homogenisatorstaaf in de buis met het spierweefsel zoals beschreven in stap 1.4 en draai, terwijl u de buis op ijs houdt, de rotor 15 s op snelheid 5 om het spierweefsel te scheuren en een myofibril-suspensie te verkrijgen.
- Pipette ~50 μL van de myofibril suspensie en ~250 μL van de ontspannende oplossing op de microscoopglijbaan bekleed met poly-HEMA in het weefselbad. Dit zal een vloeibare druppel vormen. Bedek het bad met een deksel om te beschermen tegen stof en wacht 5-10 minuten om de myofibrils naar de bodem te laten zinken.
LET OP: De verhouding tussen de ophanging en de ontspannende oplossing is afhankelijk van de kwaliteit van de isolatie, dus dienovereenkomstig aan te passen. Bijvoorbeeld, als de myofibril opbrengst laag is en weinig geschikte myofibrils aanwezig zijn in de ophanging, voeg meer myofibril suspensie toe en verdun met minder ontspannende oplossing (bijvoorbeeld 75 μL myofibril suspensie en 225 μL ontspannende oplossing). Hart- en skeletspierweefsel is gemakkelijk te herkennen door het strepenpatroon. Met behulp van een 10x of 40x doelstelling, dit patroon is ook zichtbaar in een enkele myofibril. In het geval dat er ander weefsel in de suspensie aanwezig is, kunnen myofibrils visueel worden geselecteerd. Men kan overslaan de 5-10 min wachten. Dit verhoogt echter de moeilijkheid van het lijmen van een myofibril. - Coat montagenaalden met lijm (shellac + ethanol; 120 mg shellac in 2 mL van 70% ethanol). Verwarm hiervoor de lijm op 65 °C voor 30-60 s en pipet ~6 μL op een nieuwe ongecoate glazen schuif. Dompel de punt van elke montagenaald in de lijm en herhaal tot een laag lijm zichtbaar is. Beweeg de sonde en piëzo verticaal met de micromanipulatoren om ruimte te maken om het weefselbad op het microscoopstadium te plaatsen. Verwijder de glazen schuif met de lijm.
- Montage van de myofibrils
- Plaats het weefselbad met de microscoopplaat bedekt met poly-HEMA met de myofibril suspensie op het microscooppodium. Gebruik het podium om een geschikte myofibril te vinden met de 40x doelstelling. Indien nodig, bewegen en draaien van het weefsel bad om de myofibril te verplaatsen naar een bestelbare positie.
OPMERKING: Zoek naar myofibrils met een zichtbaar strepenpatroon van ongeveer 30 μm lang. Zoals in detail beschreven in de stappen 3.1 en 3.2.1 is het mogelijk om de lengte en sarcomere lengte te controleren voordat de myofibril wordt gelijmd. Lijm gescheurde myofibrils niet, omdat deze waarschijnlijk zullen breken tijdens contractie. - Schuif de stroomkamer direct boven de vloeistofdruppel met de myofibrils in het weefselbad (gepipeteerd op de glijbaan in stap 2.4) en laat deze zakken. Stop voordat het de vloeistofdruppel raakt.
- Laat de piëzo-montagenaald zakken en druk deze op de onderste punt van de myofibril. Til het iets op om te controleren of de myofibril aan de naald is bevestigd.
- Laat de stroomkamer ver genoeg zakken voor de montagenaald van de sonde om de bodem te bereiken zonder dat de sonde de stroomkamer aanraakt.
- Druk op de montagenaald van de sonde op het bovenste puntje van de myofibril. Til het iets op om te controleren of de myofibril aan de naald is bevestigd.
- Til de myofibril zo ver mogelijk van de bodem van het bad op zonder de mogelijkheid te verliezen om scherp te stellen zonder dat het doel de onderkant van het glas aanraakt.
- Plaats het weefselbad met de microscoopplaat bedekt met poly-HEMA met de myofibril suspensie op het microscooppodium. Gebruik het podium om een geschikte myofibril te vinden met de 40x doelstelling. Indien nodig, bewegen en draaien van het weefsel bad om de myofibril te verplaatsen naar een bestelbare positie.
3. Initialiserend experiment
- Gebruik de software voor micromanipulatoren, camera en systeemcontroller(figuur 7A, zie Tabel van materialen)om de sarcomerelengte te meten. Verplaats de piëzo- en/of krachtsonde om de initiële sarcomerelengte van de myofibril in te stellen op 2,5 μm.
LET OP: Een sarcomerelengte van 2,5 μm zorgt voor een optimale overlap tussen myosinekoppen en actine. - Met behulp van de vatfunctie van de systeemcontroller-software meet de myofibrillengte en -breedte(figuur 7B,C).
OPMERKING: Bij het draaien van de camera kan deze horizontaal en/of verticaal kantelen. Om de uitlijning van de camera te controleren, kan een spirit level worden gebruikt om te controleren of de camera is gedraaid en niet gekanteld.- Plaats de myofibril in het midden van het videobeeld met behulp van het microscoopstadium.
- Teken een vierkant van de ene kant van de myofibril naar de andere. Zorg er voor de lengte voor dat u de donkere rand van de lijmdruppels(Figuur 2A)in het vierkant opneemt, omdat de beeldverwerking is gebaseerd op contrast.
- Begin met het opnemen van de gegevens in de systeemcontrollersoftware (zie Tabel van materialen)door op 'Start'te drukken en na 5 s pauze de systeemcontroller software gegevens opname door op de knop' Pauze' te drukken. De lengte wordt nu vastgelegd in de gegevens.
- Voor de breedte eerst draaien de camera 90° (zie Tabel van materialen)en gebruik dan het contrast van de rand van de myofibril zelf.
- Begin met het opnemen van de gegevens in de systeemcontrollersoftware (zie Tabel van materialen)door op 'Start'te drukken en na 5 s pauze de systeemcontroller software gegevens opname door op de knop'Pauze' te drukken. De breedte wordt nu vastgelegd in de gegevens.
- Als actieve spanning van de myofibril moet worden bepaald, moet de perfusie-setup worden gebruikt. Als dat zo is, blijf dan stap 3.4. Als alleen passieve spanning wordt bepaald, sla stappen 3.4–4.1.3.7 over en ga verder bij stap 4.2.
- Plaats en initialiseer de perfusiesetup.
LET OP: Dit is alleen nodig voor het genereren van actieve kracht. Blijf stap 4.2 bij het uitvoeren van passieve spanningsexperimenten.- Stel de snelle motorpositie in op 4 V (Figuur 5B).
- Schuif de perfusiestandaard op de tafel om de linkerbenedenhoek van de standaard uit te lijnen met de tape op de tafel.
LET OP: Let op: Zorg ervoor dat u de krachtsonde of de piëzomotor niet raakt. - Gebruik de manipulator om de Ɵ glas ruwweg door het oog te positioneren.
- Kijk door het oculair en beweeg het Ɵ glas voorzichtig naar de myofibril met behulp van de manipulator.
- Lijn het bovenste kanaal van het Ɵ-glas uit met de myofibril met behulp van de manipulator en controleer de positie door het uitvoeren van een snelle stap (signaalgenerator instellingen kan worden gevonden in tabel 1) met de systeemcontroller software (Figuur 2B–C, zie Tabel van Materialen).
LET OP: Zorg ervoor dat het onderste kanaal wordt uitgelijnd met de myofibril tijdens de activeringsfase van de fast-step(figuur 2B–C).
- Schakel de achtergrondstroom van Rx (Figuur 4A) in om een laminaire achtergrondstroom in de stroomkamer te maken.
OPMERKING: De achtergrondstroom is nodig om turbulente doorstroming als gevolg van de pCa-oplossingsstroom van het Ɵ-glas te voorkomen.- Zet de instroom van de stroomkamer aan met een Luer-klephendel.
- Stuur de volgende parameters naar de uitstroompomp om te beginnen met het aftappen van de stroomkamer en overloop van de stroomkamer te voorkomen (Figuur 9): Klep = Badklep (2); Microstep-modus = Micro; Plunger doel = 48.000; Zuigersnelheid = 38–40 (willekeurig).
LET OP: Zorg ervoor dat het vloeistofniveau te allen tijde stabiel is. De myofibril mag niet droog lopen en mag de cantilever ook niet. Het is beter om een beetje overloop dan te weinig stroom.
- Stuur de volgende parameters naar de uitstroompomp om te beginnen met het aftappen van de stroomkamer en overloop van de stroomkamer te voorkomen (Figuur 9): Klep = Badklep (2); Microstep-modus = Micro; Plunger doel = 48.000; Zuigersnelheid = 38–40 (willekeurig).
- Zet de instroom van de stroomkamer aan met een Luer-klephendel.
- Voer de gewenste temperatuur in en druk op 'Figure 8Start'. Table of Materials Wacht tot de gewenste temperatuur is bereikt door de grafiek in de software voor thermo-elektrische temperatuurregelaar te controleren en ga verder.
OPMERKING: Bij het uitvoeren van experimenten bij kamertemperatuur hoeft de thermo-elektrische temperatuurregelaar niet te worden gebruikt.
4. Experimenteel protocol(en)
- Bepaal welke active force protocols moeten worden uitgevoerd.
OPMERKING: Afhankelijk van de gegevens die nodig zijn voor het onderzoek, kunnen meerdere soorten experimenten met actieve kracht worden uitgevoerd: stap 4.1.1, meting van de maximale kracht bij verzadiging [Ca2+]; stap 4.1.2, waarbij een Force-pCa-curve wordt verkrijgt om de calciumgevoeligheid te bepalen naast stap 4.1.1; stap 4.1.3, waarbij het spanningstempo wordt bepaald door naast stap 4.1.1 of 4.1.2 een verkortingsprotocol te maken.- Meet maximale actieve kracht.
- Begin met het opnemen van de gegevens in de systeemcontrollersoftware (zie Tabel van Materialen)door op 'Start'te drukken.
- Open kleppen 1 en 6 met het data-acquisitiepaneel (zie Tabel van Materialen)software door de knop '1+6'te controleren om Ɵ-glasstroom van de ontspannende oplossing en activerende oplossing door de Ɵ-glas te starten (Figuur 6A).
- Reset het bereik van de interferometer zodat de basiskracht 0 V is door 'Resetbereik'op de interferometer te selecteren en te drukken (zie Tabel met materialen).
- Wanneer het krachtspoor stabiel is, voert u de Ɵ-glassnelle stap uit (stapgrootte = 100 μm).
De instellingen van de signaalgenerator zijn te vinden in tabel 1 (figuur 5C). Een activeringsontspanningsspoor dat vergelijkbaar is met figuur 4D wordt geregistreerd en zichtbaar in de software van de systeemcontroller. - Pauzeer de registratie van de systeemcontrollersoftware door op de knop'Pauze'te drukken.
- Als er geen activeringen meer moeten worden uitgevoerd, sluit dan de kleppen 1 en 6 om Ɵ-glasstroom te stoppen door de knop '1+6' (Figuur 6B)uit te vinken, stop de spuitpomp (Figuur 9, zie Tabel van Materialen) door op 'Terminate'te drukken en stop de achtergrondstroom door de Luerklep te sluiten.
- Force-pCa-curve
OPMERKING: Dit is vergelijkbaar met stap 4.1.1 om de maximale actieve kracht te verkrijgen, maar met meerdere activeringen met behulp van verschillende pCa-oplossingen.- Begin met het opnemen van de gegevens in de systeemcontrollersoftware door op'Start'te drukken.
- Open kleppen 1 en 2 met de data acquisition panel software om de stroom van ontspannende oplossing en pCa 6.2 door de Ɵ-glas te starten.
- Reset het bereik van de interferometer zodat de basiskracht 0 V is door 'Resetbereik'op de interferometer te selecteren en te drukken.
- Wanneer het krachtspoor stabiel is, voert u de Ɵ-glassnelle stap uit (stapgrootte = 100 μm).
De instellingen van de signaalgenerator zijn te vinden in tabel 1. - Pauzeer de systeemcontrollersoftware door op de knop'Pauze'te drukken.
- Herhaal de stappen 4.1.2.1–4.1.2.4 voor kleppen 1 en 3 (pCa 5.8), kleppen 1 en 4 (pCa 5.6), kleppen 1 en 5 (pCa 5.4) en kleppen 1 en 6 (pCa 4.5).
- Als er geen activeringen meer moeten worden uitgevoerd, sluit dan de kleppen 1 en 6 om Ɵ-glasstroom te stoppen door de knop '1+6' (Figuur 6A)uit te vinken, stop de spuitpomp (figuur 9) door op 'Terminate'te drukken en stop de achtergrondstroom door de Luer-klep te sluiten.
- Meetsnelheid van spanningsherontwikkeling (kTR).
OPMERKING: Dit is vergelijkbaar met stap 4.1.1 voor maximale actieve kracht, maar met enkele wijzigingen en toegevoegde stappen.- Bereken de piëzobeweging die nodig is om de myofibril 15% te verslappen en voer deze waarde in de signaalgenerator in (figuur 5D, tabel 1).
- Begin met het opnemen van de gegevens in de systeemcontrollersoftware door op 'Start'te drukken.
- Open kleppen 1 en 6 met het data acquisition panel(Figuur 6A)software om de stroom van de ontspannende oplossing en pCa 4.5 door de Ɵ-glas te starten.
- Reset het bereik van de interferometer zodat de basiskracht 0 V is door 'Resetbereik'op de interferometer te selecteren en te drukken.
- Wanneer het krachtspoor stabiel is, voert u de Ɵ-glassnelle stap uit (stapgrootte = 100 μm).
De instellingen van de signaalgenerator zijn te vinden in tabel 1. - Wanneer het krachtplateau is bereikt, voert u de verkortingsrestretch uit met de piëzo.
De instellingen van de signaalgenerator zijn te vinden in (Figuur 5D, Tabel 1). Een activeringsontspanningsspoor dat vergelijkbaar is met figuur 4E wordt geregistreerd en zichtbaar in de systeemcontrollersoftware.
OPMERKING: Er kan een aangepast protocol worden gemaakt om de bovenstaande stappen te automatiseren. - Pauzeer de systeemcontrollersoftware door op de knop'Pauze'te drukken.
- Als er geen activeringen meer moeten worden uitgevoerd, sluit dan de kleppen 1 en 6 om Ɵ-glasstroom te stoppen door de knop '1+6' (Figuur 6B)uit te vinken, stop de spuitpomp (Figuur 9) door op 'Terminate'te drukken en stop de achtergrondstroom door de Luer-klep te sluiten.
- Meet maximale actieve kracht.
- Passieve krachtmetingen uitvoeren.
- Voer een continu stuk uit.
- Bereken de piëzobeweging die nodig is om de myofibril uit te rekken en voer deze waarde in de signaalgenerator in(tabel 1).
OPMERKING: Dit zijn voorbeeldinstellingen. Bereken de hoeveelheid rek en de tijd van rek ten opzichte van de sarcomere lengte. Deze instellingen zijn nodig om ervoor te zorgen dat de snelheid van rek per sarcomere gelijk blijft over myofibrils. - Begin met het opnemen van de gegevens in de systeemcontrollersoftware door op 'Start'te drukken.
- Reset het bereik van de interferometer zodat de basiskracht 0 V is door 'Resetbereik'op de interferometer te selecteren en te drukken.
- Voer continu stretch uit met de signaalgenerator in de systeemcontrollersoftware om de piëzo te bedienen. De instellingen van voorbeeldsignaalgeneratoren zijn te vinden in tabel 1.
- Verkort de myofibril tot slappe lengte met de piëzo nadat de rek is voltooid(Tabel 1).
- Bereken de piëzobeweging die nodig is om de myofibril uit te rekken en voer deze waarde in de signaalgenerator in(tabel 1).
- Voer een stapsgewijs stuk uit.
- Begin met het opnemen van de gegevens in de systeemcontrollersoftware door op 'Start'te drukken.
- Reset het bereik van de interferometer zodat de basiskracht 0 V is door 'Resetbereik'op de interferometer te selecteren en te drukken.
- Voer een stapsgewijs stretch uit met de signaalgenerator in de systeemcontrollersoftware om de piëzo te bedienen. De instellingen van voorbeeldsignaalgeneratoren zijn te vinden in tabel 1 (figuur 5E).
- Verkort de myofibril tot slappe lengte met de piëzo nadat de rek is voltooid. De instellingen van voorbeeldsignaalgeneratoren zijn te vinden in tabel 1.
- Voer een continu stuk uit.
- Pauzeer de systeemcontrollersoftware door op de knop'Pauze'te drukken.
- Stop de registratie van gegevens door op de knop' Stop'in de systeemcontrollersoftware te drukken.
- Sla de gegevens op door op 'Bestand' en 'Save Data'te drukken in de software van de systeemcontroller.
5. Schoonmaken
- Verwijder de gemeten myofibril en bereid je voor op de volgende myofibril.
- Om dit te doen, voorzichtig afscheuren van de myofibril tijdens het kijken door de oculaire met de 40x doelstelling.
- Verplaats de krachtsonde en piëzo. Ga omhoog de Ɵ-glas helemaal naar boven, naar rechts en naar achteren. Ga dan omhoog en schuif de stroomkamer weg. Verwijder het weefselbad.
- Om de montagenaald schoon te maken, breng deze in beeld met behulp van de 10x en de oculair. Dompel de borstel in ethanol en borstel voorzichtig af en verwijder de lijm van de naald.
OPMERKING: Houd er rekening mee dat het enige tijd kan duren voordat de lijm loskomt. - Spoel de flow chamber en weefsel bad met ultrazuiver water.
- Plaats de sonde in een kleine petrischaal gevuld met ultrazuiver water. Zorg ervoor dat de sonde volledig onder water is.
- Wanneer de experimenten zijn voltooid, reinigt u de installatie zoals hierboven en voert u de volgende extra stappen uit.
- Maak de slang leeg uit het stroombad. Stuur de parameters naar de uitstroomspuitpomp (zie tabel met materialen, figuur 9). Klep = Badklep (2); Microstep-modus = Normaal; Zuigerdoel = 0; Zuigersnelheid = 30.
OPMERKING: Beëindig de opdracht wanneer de slang leeg is. - Initialiseer de pomp meerdere malen(figuur 9B).
- Giet de spuiten af. Om dit te doen, sluit alle Luer kleppen, open alle kleppen, verwijder de slang van de naald van de spuit, houd de buis van specifieke pCa onder de naald, en open de Luer klep. Gebruik de drukpluggen om het proces te versnellen.
- Plaats de slang opnieuw aan de naald van de spuit. Vul spuiten met ~ 5 mL ultrazuiver water. Plaats een kopje onder de Ɵ-glas. Open alle kleppen en open de drukklep om het systeem te spoelen.
- Sluit het systeem af. Schakel het stroomblok van de pc, interferometer en piëzo-controller uit.
- Maak de slang leeg uit het stroombad. Stuur de parameters naar de uitstroomspuitpomp (zie tabel met materialen, figuur 9). Klep = Badklep (2); Microstep-modus = Normaal; Zuigerdoel = 0; Zuigersnelheid = 30.
6. Gegevensanalyse
- Exporteer gegevenssporen van de systeemcontrollersoftware (zie Tabel van materialen)naar een spreadsheetsoftwareprogramma of klembord door het gegevensbestand te openen en het gewenste segment te selecteren. De getoonde sporen worden geëxporteerd (bijvoorbeeld ruwe kracht, sarcomerelengte en piëzopositie).
- Analyse uitvoeren met de software van keuze (bijv. MATLAB).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gegevenssporen werden geregistreerd en geopend met de systeemcontrollersoftware (zie Tabel van Materialen). Volledige sporen of geselecteerde segmenten werden geëxporteerd naar het klembord of tekstbestand voor verdere analyse met een gewenste software. Kleppen om de stroom van de verschillende oplossingen te regelen werden geschakeld met aangepaste software of handmatig. Een aangepaste MATLAB script werd gebruikt om de tarieven van activering, spanning herontwikkeling, en ontspanning te analyseren. De maximale actieve kracht en de piek en de plateaukracht van de passieve krachtexperimenten werden rechtstreeks uit het spoor van de softwareforce van de systeemcontroleur genomen. Na het monteren van een myofibril (Figuur 2), werd het gewenste protocol geselecteerd.
Maximale actieve kracht en calcium- gevoeligheid van de kracht inmyofibrils geïsoleerd van muis- en skeletspierenbiopten
In figuur 4A wordt de experimentele opstelling die wordt gebruikt voor de actieve krachtexperimenten schematisch weergegeven. Kracht sporen van een actieve kracht experiment met een myofibril geïsoleerd van gezonde menselijke quadriceps spier worden getoond. De myofibril werd 5 keer geactiveerd met oplossingen met verschillende pCa (pCa 6.2, 5.8, 5.6, 5.4, 4.5; gegevens weergegeven in figuur 4B). De gemiddelde maximale kracht van alle myofibrils in dit experiment was ~123 mN/mm2. Een kracht-pCa curve werd geconstrueerd van het plateau krachten bereikt tijdens elke activering in elk van de vijf calcium oplossingen. De resultaten worden weergegeven in figuur 4C. Uit deze curve werd de pCa berekend op 50% van de maximale krachtproductie (pCa50). In deze myofibril, de pCa50 was 5.75.
Bovendien kunnen een of meerdere verbindingen worden toegevoegd aan de perfused-oplossing om het effect ervan op de kracht van de myofibril te meten. In figuur 4Dwordt het effect van N-benzyl-p-tolueen sulphonamide (BTS), een snelle spiertrekking (type II) myosine zware ketting II (MHCII) remmer, geïllustreerd. 19 Een myofibril werd eerst geactiveerd met een pCa 5.6 oplossing, en vervolgens met een pCa 5.6 + BTS oplossing. Tijdens de tweede activering werd minder kracht geproduceerd, wat aangeeft dat dit een myofibril was die MHCII bevatte. Er zijn mutaties in eiwitten die uitsluitend aanwezig zijn in specifieke spiertypes, en dus alleen myofibrils van dat specifieke spiertype beïnvloeden. In dat geval is het 'typen' van de myofibrils belangrijk om het mutatie-effect op de verschillende spiertypen te onderscheiden. Ook illustreert dit voorbeeld de mogelijkheid voor het testen van de werkzaamheid van therapeutische verbindingen in myofibrils.
Figuur 4E toont een actief krachtspoor van een enkele myofibril geïsoleerd uit muis skeletzolzol spierweefsel. De myofibril werd gemonteerd in de setup en doordrenkt met ontspannende oplossing (pCa 9.0), gevolgd door perfusie met activerende oplossing (pCa 4.5, ~0.032 mM calcium). We hebben tegelijkertijd de kracht en sarcomere lengte geregistreerd. Dit was een bijna isometrische samentrekking, omdat de cantileverafbuiging ~0,5 μm was, wat ongeveer 1% van de slappe lengte van de myofibril was (~ 50 μm). In figuur 4E werd een snelle verkorting-restretch protocol uitgevoerd tijdens actieve contractie om de snelheid van spanning herontwikkeling te beoordelen (kTR, gele stippellijn). De kTR is een maat voor cross-bridge fietsen kinetiek. Ook werden de activerings- en ontspanningscurven aangebracht om de activeringssnelheid (kACT, rode stippellijn) en ontspanning (kREL, groene stippellijn) te bepalen. Figuur 4 toont een gedetailleerder beeld van de ontspanningsfase die in figuur 4Fwordt benadrukt . Twee fasen werden duidelijk: 1) een eerste langzame fase van ontspanning (gedomineerd door cross-bridge detachement) en 2) een snelle fase van ontspanning (gedomineerd door cross-bridge detachement en calcium-dissociatie)20.
Passieve kracht in myofibrils geïsoleerd van een menselijke skeletspierbiopsie
Figuur 10 toont een spoor van een passief krachtexperiment met een myofibril geïsoleerd van gezond menselijk membraanspierweefsel. Het eerste protocol betrof een of meerdere passieve rektissen om de visco-elastische eigenschappen van de sarcomeres te bepalen. Figuur 10 toont een krachtspoor van een continu stuk van een myofibril (stretch van sarcomerelengte 2,2–3,0 μm). Tijdens het stuk, myofibrils weergegeven zowel viskeuze en elastische kenmerken. Dit blijkt uit de curve in figuur 10A. De scherpe piek vertegenwoordigt beide kenmerken, terwijl de plateaukracht een maat van elasticiteit is. Viscositeit weerstaat spanning lineair. Zo viel de kracht nadat de stam was verwijderd. Figuur 10B benadrukt het stuk zelf en illustreert de hoge signaal-ruisverhouding. Houd er rekening mee dat krachtsporen ongefilterd zijn.
Figuur 1: Schematische weergave en elektronenmicroscopie beelden van een skeletspier en de morfologie. (A) Toont de structuur van de skeletspieren en (B) toont de structuur van de sarcomere, de kleinste contractieleenheid. Deze schematische beelden zijn aangepast van Servier Medical Art. (C) Toont een beeld van een enkele spiervezel en (D) toont een elektronenmicroscopie beeld van een spiervezel onthullen myofibrillar schade evenals bewaard myofibrillar ultrastructuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Afbeeldingen met een gemonteerde myofibril, Ɵ-glas uitlijning, en piëzo montage naald. (A) Een myofibril gemonteerd op slappe lengte tussen de glasvezel naalden bekleed met shellac zoals gezien door middel van een 40x doelstelling. (B) Afbeeldingen van de positie van het Ɵ-glas ten opzichte van de myofibril (gemarkeerd met de witte ovalen) zoals gezien door middel van een 10x doelstelling. (Top) Uitgelijnd op het bovenste kanaal (ontspannende oplossing, pCa 9.0); (Onder) Uitgelijnd op het onderste kanaal (activerende oplossing, pCa 4.5) om de myofibril te doorsluizen met calcium en contractie te veroorzaken. (C) Schematische afbeeldingen van de positie van het Ɵ-glas ten opzichte van de myofibril. (Top) Uitgelijnd met het bovenste kanaal (ontspannende oplossing, pCa 9.0); (Onder) Uitgelijnd met het onderste kanaal (activerende oplossing, pCa 4.5) om de myofibril te doorsluizen met calcium en contractie te veroorzaken. (D) Montagenaald bevestigd aan de koolstofstaaf van de piëzohouder. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Schematische weergave van de opstelling en het eindgedeelte van de weefselstroomkamer. In donkerblauw is de weefselstroomkamer gemaakt van aluminium, en in het wit de holte waarin de krachtsonde en Ɵ-glas in positie worden getoond; (Midden) Myofibril bevestigd tussen twee glasvezel montagenaalden bevestigd aan de krachtsonde en piëzo lengte motor. Het Ɵ-glas is uitgelijnd met de myofibril. Het Ɵ-glas kan op en neer bewegen om de myofibril bloot te stellen aan de calciumoplossing. (Rechts) Close-up van de cantilever krachtsonde. Aangegeven zijn de holtegrootte (of Fabry-Pérot holte, d); reflectie-interfaces A, B en C; en een voorbeeld van een lichtgolf uitgezonden door de laser (rood). De cantilever is gemonteerd op de schouder van de ferrule. De vezel die de laser van de interferometer draagt verlaat de ferrule aan het puntje van de cantilever. Een glasvezel wordt met behulp van was op de cantilever bevestigd. (Linksboven) De interferometer analyseert het interferometersignaal dat naar de systeemcontrollersoftware wordt verzonden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Experimentele opstelling en gegevens uit actieve spanningsexperimenten. (A) Schematische weergave van de perfusieopstelling en de gebruikte oplossingen. Houd er rekening mee dat de eerste en laatste buis (lichtblauw) calciumvrije oplossing bevatten (d.w.z. ontspannende oplossing). (B) Voorbeeld force sporen van een actief spanningsexperiment met een myofibril geïsoleerd uit menselijk skeletspierweefsel met vijf activeringen van ontspannende oplossing (pCa 9.0) tot meerdere activeringsoplossingen (pCa 6.2 – 4.5). c) een krachtcalciumcurve; krachtniveaus op de plateaus in paneel(B)werden genormaliseerd en uitgezet tegen hun respectieve calciumniveaus. (D) Voorbeeld force trace van een type II (fast twitch) myofibril geïsoleerd van menselijke skeletspieren geactiveerd met pCa 5.6 oplossing (blauw) en vervolgens met pCa 5.6 + BTS (een type II specifieke cross-bridge remmer, rood). (E) Voorbeeld gegevens spoor van een actieve spanning experiment met myofibrils geïsoleerd van muis soleus skeletspierweefsel met een snelle verkorting-restretch protocol tijdens activering om de snelheid van spanning herontwikkeling te bepalen (kTR, gele stippellijn). Ook werden de activerings- en ontspanningscurve aangebracht om de activeringssnelheid (kACT, rode stippellijn) en ontspanning (kREL, groene stippellijn) te bepalen. (F) Een zoom van de ontspanningsfase (linksboven), gemarkeerd in (E). Het snelle motorsignaal (linksonder) gaf het tijdstip aan waarop de oplossing veranderde van een activeringsoplossing (pCa 4.5) naar een ontspannende oplossing (pCa 9.0). De ontspanningsfase bestond uit een lineaire, langzame fase (Rechtsboven) en een exponentiële, snelle fase (Rechtsonder). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Voorbeeldinstelling voor de signaalgenerator in de systeembesturingssoftware. (zie tabel met materialen). 1) Geeft de knop aan om opdrachten uit te voeren die in de signaalgenerator zijn ingevoerd. (A) Het instellen van de piëzo lengte motor. (B) Het opzetten van de fast-step motor. (C) Het uitvoeren van een fast-step om een myofibril te activeren voor een duur van 5 s. (D) Het uitvoeren van een snelle verkorting-restretch van een myofibril om de kTRte bepalen . (E) Het uitvoeren van een stapsgewijze rek van een myofibril om de visco-elastische eigenschappen te bepalen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Valve controller software zoals gebruikt op de PC. (A) De knop die wordt gebruikt om kleppen 1 (Rx) en 6 (Wet) te openen. (B) De toestand van de knoppen wanneer alle kleppen gesloten zijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Het meten van sarcomere lengte, myofibril lengte, en myofibril breedte met de systeemcontroller software. Een liniaal wordt als voorbeeld gebruikt. (A) Het meten van de sarcomere lengte: de paarse doos wordt geplaatst rond de myofibril en de sarcomere lengte wordt weergegeven in (1). (B) Het meten van de lengte: De cyaandoos wordt van begin tot eind van de myofibril geplaatst. (C) Meetbreedte: Na het 90° draaien van de camera wordt de cyaandoos van de ene kant van de myofibril naar de andere geplaatst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Thermo-elektrische temperatuurregelaarsoftware. (A) Verbinding maken met de thermo-elektrische temperatuurregelaar. (B) Uitvouwen temperatuurinstellingen. (C) Stel de gewenste temperatuur in, in dit geval: 15 °C. (D) Zet de thermo-elektrische temperatuurregelaar aan en stuur spanning naar peltier thermo-elektrische koelermodule. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: Instellingen voor de uitstroompomp van de spuit. (A) Open verbinding met de pomp door te drukken (1). (B) Start de pomp met vooraf gedefinieerde instellingen door op te drukken (2). (C) Begin met het pompen van de uitstroom door de 'Valve Commands' in te stellen op 'Bath Valve' (2) en de ' CommandSet Parameters' in te voeren zoals afgebeeld. Voer de opdracht uit door op (3) te drukken. Commando's kunnen worden beëindigd door op te drukken (4). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 10: Voorbeeld gegevens spoor van een passief spanningsexperiment met myofibrils geïsoleerd van menselijk skeletspierweefsel. (A) Opname van de kracht (Boven) en sarcomere lengte (Lager) tijdens een stretch en release protocol. (B) Zoom van (A) met de kracht (Boven) en sarcomere lengte tijdens de stretchfase van de myofibril. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 11: Experimentele installatie en gegevens van cardiomyocyte calcium preactivatie experimenten. (A) Schematische weergave van de perfusieopstelling. Houd er rekening mee dat de laatste buis (lichtblauw) calciumvrije oplossing (ontspannende oplossing) bevat. (B) Over elkaar geplaatste krommen van activering van een cardiomyocyte zonder (lichtblauw) en met (donkerblauwe) calciumvooractivering, met calciumconcentraties van respectievelijk 1 nM en 80 nM. (C) Vergelijking van calciumpreactivatie bij wilde type (WT) en heterozygoot RBM20 (HET) cardiomyocyten geïsoleerd van ratten linker ventrikel. Dit cijfer is gewijzigd van Najafi et al.21. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Stap | Apparaat | Beschrijving | Vorm | Eerste | ||||||||
| 1.7.1. | Piëzo | Initialisatie passieve spanning | Vaste | 51,6 μm | ||||||||
| 1.7.2. | Piëzo | Initialisatie actieve spanning | Vaste | 0 μm | ||||||||
| Stap | Apparaat | Beschrijving | Vorm | Eerste | Vertraging | Herhalingen | Niveau | Vertraging | Niveau | Vertraging | ||
| 3.4.4. / 4.1.1.4. / 4.1.2.4. | Snelle stap | Testen ɵ-glaspositie / Activering van myofibril | Pulse | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 5 s | 4 V | 1 s | ||
| 4.1.3.4. | Snelle stap | Activering van myofibril (o.a. kTR) | Pulse | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 10s | 4 V | 1 s | ||
| Stap | Apparaat | Beschrijving | Vorm | Eerste | Vertraging | Herhalingen | Opritniveau | Opritduur | Vertraging | Opritniveau | Opritduur | Vertraging |
| 4.1.3.1. / 4.1.3.6. | Piëzo | Shortening-Restretch voor kTR | Trapezium | 0 μm | 0,5 s | 1 x | 0 + 0,15 * L0 = __ μm | 0,01 s | 0,01 s | 0 μm | 0,01 s | 1 s |
| 4.2.1.1. / 4.2.1.4. | Piëzo | Blijft stretch | Trapezium | 51,6 μm | 2 s | 1 x | 51,6 - 0,30 * L0 = __ μm | 2 s | 0 s | 51,6 - 0,30 * L0 = __ μm | 0 s | 1 s |
| 4.2.1.4. | Piëzo | Breng myofibril terug naar slappe lengte | Trapezium | 1,6 μm | 2 s | 1 x | 51,6 μm | 5 s | 0 s | 51,6 μm | 0 s | 1 s |
| 4.2.2.3. | Piëzo | Stapsgewijs rekken | Trapezium | 51,6 μm | 2 s | 10 x | 51,6 - 5 μm | 0,5 s | 10 s | 51,6 - 5 μm | 0 s | 0 s |
| 4.2.3. | Piëzo | Breng myofibril terug naar slappe lengte | Trapezium | 1,6 μm | 2 s | 1 x | 51,6 μm | 5 s | 0 s | 51,6 μm | 0 s | 0 s |
Tabel 1: Tabel met een beschrijving van de verschillende signaalgeneratorinstellingen die worden gebruikt in de systeemcontrollersoftware voor het bedienen van de piëzolengtemotor en de snelle motor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beschreven is een protocol om de contractiele functie van myofibrils geïsoleerd van menselijke of dierlijke skeletspierweefsels te beoordelen. De krachtresolutie van deze opstelling is al eerder beschreven door Chavan et al.12. Kortom, het wordt bepaald door de willekeurige schommelingen van de lengte van de Fabry-Pérot holte gevormd tussen de detectievezel en de cantilever, die het dominante deel van het geluid produceren bij de uitgang van de uitlezing (uitgedrukt in V) die, vermenigvuldigd met de afbuigingsgevoeligheid (uitgedrukt in m/V) en door de veerconstante van de cantilever (uitgedrukt in N/m), de kracht geeft. Voor onze setup is het gemiddelde vierkant (rms) geluid in de lucht bij de uitvoer van de uitlezing, bemonsterd bij een 1.000 datapunten/s (monster/s), ongeveer 2 mV. Voor een typische myofibril meting wordt een ferrule-top sonde gebruikt met een veerconstante van ~0,7 N/m (afbuigingsgevoeligheid ∼300 nm/V). Deze rms-waarde komt overeen met een cantileverafbuigingsresolutie van 0,6 nm, wat zich vertaalt in een krachtgevoeligheid van ~0,37 nN. De krachtsonde wordt gekalibreerd door de punt van de montagenaald tegen een weegschaal te duwen terwijl de buigruimte van de cantilever gelijk blijft aan een veelvoud van de golflengte van de uitleeslaser13. Deze kalibratiemethode houdt zowel de cantilever als de montage van naaldstijfheid in, evenals mogelijke variaties in koppel van de cantilever en montagenaald als gevolg van snelheid en omvang van myofibril contractie. Momenteel is een opstelling voor het beoordelen van myofibril contractiliteit beschikbaar, die is gebaseerd op de detectie van een laser afgebogen van de cantilever, dat wil zeggen, optische bundel afbuiging (1.700 A; ~ 1 nN kracht resolutie). Dit systeem is ontwikkeld door Labuda et al. met behulp van een optische periscoop om een laserlicht naar en uit de buurt van de cantilever in beperkende configuraties11te begeleiden. In dit systeem wordt een myofibril gemonteerd tussen de atoomkracht cantilever en een stijve glazen naald. Een voordeel van het hier beschreven systeem is de hogere krachtgevoeligheid en signaal-ruisverhouding. Bovendien kunnen in deze opstelling relatief stijve cantilevers worden gebruikt, wat resulteert in kleine cantileverafbuiging wanneer myofibrillar kracht wordt toegepast. Dit is belangrijk, omdat het zorgt voor krachtmetingen op bijna constante sarcomere lengte. Ten slotte, in vergelijking met het systeem beschreven door Labuda et al., het systeem hier maakt gebruik van soortgelijke of identieke methoden om de temperatuur te regelen, om lengte veranderingen op de myofibril te induceren, en om de perfusie oplossingen te veranderen met behulp van een Ɵ-glas en fast-step motor. Het voordeel van het door Labuda et al. beschreven systeem is dat een verandering van oplossingssamenstelling (tussen cantilever en optische periscoop) geen invloed heeft op de signaaloutput. In het hier beschreven systeem moet de oplossingssamenstelling tussen cantilever en glasvezel constant blijven. De oplossing voor deze beperking wordt hieronder nader beschreven.
Optimalisatie
De optische krachtsonde in combinatie met het snelle perfusiesysteem leidde tot complicaties. Het verschil in optische eigenschappen tussen lage en hoge concentratie Ca2+ oplossingen interfereert met de krachtmetingen. Om terugstroom van de hoge calciumoplossing te voorkomen, werd een aangepaste stroomkamer ontworpen(figuur 3). Een constante achtergrondstroom van calciumvrije oplossing wordt van rechts naar links opgewekt om de oplossing constant te houden tussen de bovenkant van de optische vezel en de cantilever(figuur 3D).
Om de temperatuur te regelen, wordt een Peltier-element met vloeistofkoeling op de stroomkamer gemonteerd. Deze stroomkamer wordt thermisch losgekoppeld van de microscoop door deze op een plastic adapter te monteren. Met het Peltier-element, aangestuurd door een TEC-systeem, is het mogelijk om de temperatuur van de oplossing na verloop van tijd te regelen met een precisie van 0,1 °C. De temperatuur wordt bewaakt door een temperatuursensor die op de stroomkamer is gemonteerd. Temperatuurstabiliteit is belangrijk vanwege de aard van de krachttransducer. De cantilever bestaat uit een goudgecoate glazen strip, waardoor het effectief een thermometer is. Zo buigt de cantilever met temperatuurveranderingen.
De opstelling maakt gebruik van een fast-step perfusiesysteem (zie Tabel van Materialen)om de beweging van het Ɵ-glas te regelen. Dit systeem maakt perfusieschakelaars binnen 10 ms mogelijk. De combinatie van de methode van temperatuurregeling en het schakelen van oplossingen maakt dit systeem bijzonder geschikt om de kinetiek van sarcomere contractility (d.w.z., tarieven van krachtontwikkeling, spanningsherontwikkeling, en ontspanning) in myofibrils te meten.
Aanvankelijk was het nadeel van het gebruik van interferometrie het kleine bruikbare bereik vanwege de noodzaak om het lineaire deel van de interferentiecurve te gebruiken (λ/8, waarbij λ de golflengte van de laser was). Recente innovaties elimineerden deze behoefte echter door golflengtemodulatie te combineren met een lock-in versterker. Daarom is het systeem niet beperkt tot een enkel lineair deel van de interferentiecurve. Dit maakt het mogelijk om oneindige afbuiging van de cantilever14te meten. Zo is het bereik van cantilever afbuiging uitlezing van dit systeem sterk vergroot in vergelijking met traditionele interferometrie. Bovendien zijn de beschreven krachtsondes eenvoudig te vervangen en zijn er veel cantilevers beschikbaar, met stijfheid variërend van 0,5 N/m tot >20 N/m. Daarom is het mogelijk om snel te schakelen tussen cantilevers en de stijfheid te selecteren die het meest geschikt is voor het uitgevoerde experiment.
Uitdagingen
Het huidige systeem is een prototype gebaseerd op een cardiomyocyte meetsysteem (zie Tabel van Materialen). Verschillende componenten kunnen worden verbeterd om een betere gebruikerservaring en gegevens van hogere kwaliteit te bieden. Ten eerste, als gevolg van add-ons aan het systeem, trillingen en resonantie kan een probleem dat ruis zal toevoegen aan het signaal. Ook de Ɵ-glas houder en fast-step motor bevestigingsmethode kan worden verbeterd om het minder gevoelig voor trillingen.
Ten tweede is het wenselijk om de fast-step motor te vervangen door een piëzo lengte actuator om de snelheid van de oplossing schakelen te verhogen en om een meer consistente beweging te verkrijgen.
Ten derde, de calcium oplossingen die we eerder gebruikt om enkele gestreepte spiervezels activeren opgenomen propionzuur, maar deze oplossingen absorberen nabij-infrarood licht, interfereren met de kracht metingen. Calciumchloride werd gebruikt om de noodzaak van propionzuur te elimineren, wat dit effect sterk verminderde. Dit probleem is inherent aan een systeem op basis van interferometrie en niet aanwezig bij het gebruik van optische bundelafbuiging.
Ten vierde werd een aangepaste stroombad ontworpen om een laminaire stroom te creëren, om de stroom van het Ɵ-glas aan te passen. Dit voorkomt terugstroom door turbulentie van de calciumrijke oplossing. Daarom blijft de oplossing tussen de punt van de optische vezel en de cantilever constant. De coverslip met de myofibrils kan vrij bewegen onder de stroomkamer en daarom is de selectie van geschikte myofibrils niet beperkt tot het kleine gebied van de stroomkamer.
Reproduceerbaarheid en variabiliteit
Er zijn verschillende elementen van het systeem en protocol die belangrijk zijn voor de mate van reproduceerbaarheid en variabiliteit van de verkregen gegevens.
Ten eerste hangt de kwaliteit van de metingen sterk af van de kwaliteit van de myofibril isolatie. Identieke protocollen leveren verschillende kwaliteiten en hoeveelheden myofibrils op uit verschillende biopten. In sommige gevallen leveren biopten nauwelijks bruikbare myofibrils of helemaal geen op. Gemeenschappelijke consensus is dat beschadigde myofibrils zal breken tijdens de contractie en dus niet worden verantwoord in de resultaten.
Ten tweede is er onzekerheid in de bepaling van het transversale gebied van de myofibril. Door technische beperkingen is het mogelijk om de breedte van de myofibril in slechts één vlak te meten. Daarom, om het dwarsdoorsnedegebied te berekenen gaan we ervan uit dat de breedte en diepte gelijk zijn. Wanneer kracht wordt genormaliseerd naar een dwarsdoorsnedegebied om maximale actieve spanning te berekenen, moet men zich bewust zijn van deze veronderstelling.
Montage van myofibrils als gevolg van myofibril montagehoek, positie, en de integriteit van de lijm.
Hoewel de montagehoek en positie grotendeels visueel kunnen worden gecontroleerd, kunnen er kleine variaties tussen myofibrils aanwezig zijn. Lijmintegriteit is niet uitgebreid onderzocht. De lijmintegriteit kan echter worden geverifieerd door de sarcomerelengte in de myofibril voor en na activering te controleren. Wanneer er meer sarcomeres tussen de lijm na een protocol zitten, suggereert dit dat er ontsporing van de myofibril in de lijm is opgetreden. Daarom moet deze myofibril van de gegevensset worden uitgesloten.
Andere toepassingen van de setup: Calcium preactivatie in cardiomyocyten geïsoleerd van rat linker ventrikel
Naast het beoordelen van de contractiele functie van myofibrils, kan het systeem ook worden gebruikt om cardiomyocyte mechanica te meten. Figuur 11 illustreert bijvoorbeeld het gebruik van door membraan-permeabiliseerde enkele cardiomyocyten geïsoleerd van rat linker ventrikel21. In tegenstelling tot de hierboven beschreven experimenten werd de ontspannende oplossing gewijzigd en werd de activerende oplossing constant gehouden. Elke cardiomyocyte onderging vijf sets van activeringen, waardoor het bloot aan een 2 μM gratis calcium oplossing voor 1 s. De 1 s tijdsdruk wordt gekozen om de tijd-beperkte aard van cardiale contracties na te bootsen, waarbij de blootstelling aan lage calciumconcentratieoplossingen de diastolische fase nabootst en de blootstelling aan oplossingen met een hoge calciumconcentratie de systolische fase van hartspiercontractie nabootst(figuur 11A). Voor elk van de vijf sets diastolisch calcium was gevarieerd (1, 80, 160, 250, en 400 nM calcium), terwijl systolisch calcium constant bleef (Figuur 11A). Een set bestond uit twee sets van drie activerings-ontspanningscycli op 1,8 μm versus 2,0 μm en 2,0 μm versus 2,2 μm voor verschillende experimentele groepen. Piekkracht werd gemeten op 1 s van de schakelaar van de pipet en gemiddeld voor de set van drie activering-ontspanningscycli. De hoge signaal-ruisverhouding en het hoge dynamische bereik van deze krachttransducer stelden ons in staat om zowel de kleine veranderingen in de diastolische kracht als de veel grotere systolische krachten te meten (figuur 11B). Het verhogen van diastolisch calcium resulteerde in een hogere kracht bij 2 μM calcium ten opzichte van de eerste activering(figuur 11B). WT rat cardiomyocyten werden vergeleken met heterozygoot (HET) RMB20 rat cardiomyocyten. Door alternatieve splicing hebben DE ratten een meer conform titin eiwit in vergelijking met de WT ratten. Het effect werd overdreven bij HET cardiomyocyten op 80 en 160 μM calcium (figuur 11C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Michiel Helmes is aandeelhouder en mede-eigenaar van IONOptix Inc.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door AFM-Telethon en A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies. De auteurs willen de maker van de producten die in dit artikel, IONOptix Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
References
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C.
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, Pt 2 535-548 (1997).
- Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
- Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, Suppl 1 127-135 (2002).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
- Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
- de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
- Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
- Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
- Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
- Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
- Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
- van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
- Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
- Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
- Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
- Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
- Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
- Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).
