Vi har optimeret en kommercielt tilgængelig østrogen receptor β reporter analyse for screening menneskelige og ikke-menneskelige primat fødevarer til østrogen aktivitet. Vi validerede denne analyse ved at vise, at den kendte østrogene menneskelige fødevarer soja registre høj, mens andre fødevarer viser ingen aktivitet.
Planter er en fødekilde for mange dyr, og de kan producere tusindvis af kemikalier. Nogle af disse forbindelser påvirker fysiologiske processer i hvirveldyrene, der forbruger dem, såsom endokrine funktion. Phytoøstrogener, de mest velundersøgte endokrine-aktive fytokemikalier, interagerer direkte med den hypothalamo-hypofyse gonadal akse i hvirveldyr endokrine system. Her præsenterer vi den nye brug af en cellebaseret analyse til at screene planteekstrakter for tilstedeværelsen af forbindelser, der har østrogen biologisk aktivitet. Denne analyse bruger pattedyrsceller, der er konstrueret til at udtrykke østrogenreceptor beta (ERβ), og som er blevet transfected med et luciferase gen. Eksponering for forbindelser med østrogen aktivitet resulterer i, at cellerne producerer lys. Denne analyse er en pålidelig og enkel måde at teste for biologisk østrogen aktivitet. Det har flere forbedringer i forhold til forbigående transfekt assays, især brugervenlighed, stabiliteten af cellerne, og følsomheden af analysen.
Planter er en nødvendig fødekilde for mange dyr, der giver kalorier og næringsstoffer, der er kritiske for overlevelse, reproduktion, vækst, udvikling og adfærd1. Planter producerer tusindvis af kemikalier, mange som tilpasninger til deres egen vækst, stomatisk vedligeholdelse og reproduktion. Andre forbindelser, anses plante sekundære metabolitter (PSMs), har funktioner, der er mindre klare, selv om nogle er giftige og sandsynligvis anvendes som et forsvar mod planteædende og parasitisme (f.eks alkaloider, tanniner)2,3. Nogle af disse kemikalier har evnen til at påvirke langsigtede fysiologiske processer hos dyr, såsom endokrine funktion, selv om hvorfor disse endokrine-aktive fytokemikalier interagerer med hvirveldyr endokrine system er stadig uklart2,4.
Fytoøstrogener, de mest velundersøgte endokrine-aktive fytokemikalier, er polyphenoliske PSM’er, der strukturelt og funktionelt efterligner østrogener, der direkte interagerer med hypothalomo-hypofyse-gonadal aksen i hvirveldyrets endokrine system5. Indtagelse af fytoøstrogener i den menneskelige kost er forbundet med beskyttelse mod nogle kræftformer, hjertesygdomme, og overgangsalderen symptomer, selv om andre virkninger omfatter fertilitetsproblemer. Faktisk blev de fysiologiske virkninger af disse forbindelser opdaget i 1940’erne, da infertilitet hos får blev tilskrevet deres græsning på fytoøstrogen-rige kløver (Trifolium subterrareum)6. Når de indtages, kan fytoøstrogener passere ind i cellerne og efterligne virkningerne af østrogen. Mens fytoøstrogener havde negative virkninger på fårefertiliteten, er forholdet mellem fytoøstrogener og fysiologi ikke enkelt. Ligesom får udviser sydlige hvide næsehorn følsomhed over for østrogenforbindelser i foder, der stammer fra store mængder soja og lucerne. Døtre af kvinder fodret denne kost under graviditeten er mindre tilbøjelige til at reproducere7. Andre undersøgelser har imidlertid vist, at fytoøstrogener også kan have positive virkninger, herunder modning af æggestokkenes follikler hos ældre mus8, forebyggelse af visse kræftformer, antioxidantaktivitet og antiproliferative virkninger9.
Bredden af virkninger af fytoøstrogener er ikke overraskende, da østrogener påvirker en bred vifte af biologiske funktioner, herunder vækst, udvikling og regulering af reproduktions- og centralnervesystemet10. Selv om der er mange virkningsmekanismer, phytoestrogens ofte har evnen til at ændre, forbedre eller forstyrre østrogen signalering gennem deres evne til at fungere som ligands for intranukleare østrogen receptorer alfa og beta (ERα og ERβ). Mange fytoøstrogener har en phenol ring struktur svarende til østrogener, der giver dem mulighed for at binde østrogen receptorer. Dem med agonistisk østrogen aktivitet fungerer som østrogen, danner en aktiveret ER-ligand kompleks, der kan dæmpe og binde sig til en østrogen respons element (ERE) og udløse gen transskription11. Således regulerer østrogener og fytoøstrogener celleaktivitet og systemfunktioner gennem deres handlinger som transskriberingsfaktorer.
Her præsenterer vi den nye brug af en cellebaseret analyse til at screene planteekstrakter for tilstedeværelsen af forbindelser, der har østrogen biologisk aktivitet. Denne analyse bruger kinesiske hamster æggestokke CHO celler manipuleret til meget udtrykke ERβ, som er blevet transfected med firefly (Photinus pyralis) luciferase gen knyttet til en ERE promotor12. Når østrogene forbindelser er til stede, binder de sig til ER, dimerize og binder sig til ERE, hvilket fører til transskription af luciferase-genet. Ved tilsætning af en substratopløsning katalyserer luciferase en reaktion, der fører til fotonemission. Derfor producerer positive prøver lys, og negative prøver producerer ikke.
Denne kommercielt tilgængelige analyse eliminerer behovet for laboratorier til at transfektere pattedyrcellerne med reportergenet og østrogenreceptoren13,14, som var ustabil og variabel i effekt. Analysen giver en stabil transfektplatform, der giver mulighed for hurtigt og enkelt at afgøre, om en plante har østrogen aktivitet via receptorbinding.
Vi tester hypotesen om, at sojabønner har højere østrogen aktivitet end alle andre fødevarer i betragtning af deres kendte koncentrationer af østrogen isoflavoner15 ved hjælp af menneskelige fødevarer fra lokale købmænd.
ERβ reporter assay udviklet til individuelt screene farmaceutiske agenser er også egnet til screening plantefødevarer for fytoøstrogener biologisk aktive gennem ERβ. Vigtige overvejelser i protokollen omfatter behandling af planteprøverne med omhu: Frisk plantemateriale skal tørres hurtigt for at forhindre støbning eller anden biologisk nedbrydning, og det skal holdes væk fra lys for at forhindre fotolyse af forbindelserne18. Analysen protokol12 fra producenten er …
The authors have nothing to disclose.
Forfattere er taknemmelige for Dale Leitman for grunduddannelse i brug af forbigående forbigående assays at bestemme østrogen aktivitet primat plantefødevarer. Tak til Bradford Westrich og C. Eric Johnson for at hjælpe med at oprette laboratorieudstyr og uddanne studerende i ekstraktionsmetoder. Endelig tak til Indiana University for at finansiere denne forskning.
1000 µL pipette | |||
20 µL pipette | |||
200 µL pipette | |||
37 ℃ water bath | |||
37 ℃, humidified 5% CO2 incubator | |||
70% ethanol | |||
analytical balance | |||
cell culture-rated laminar flow hood | |||
dimethyl sulfoxide | |||
disposable media basin, sterile | |||
drip filtration system | |||
Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
HPLC grade methanol | |||
Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit – analyzes 24 samples plus standard curve |
lyophilizer | |||
multi-channel pipette | |||
orbital shaker | |||
plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
rotory evaporator | |||
round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
Whatman grade 1 paper | |||
whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |