Screening for fytoøstrogener ved hjelp av en cellebasert østrogenreseptor β Reporter Analyse

Summary

Vi har optimalisert en kommersielt tilgjengelig østrogenreseptor β reporter analyse for screening menneskelige og ikke-menneskelige primat mat for østrogen aktivitet. Vi validerte denne analysen ved å vise at den kjente estrogenic menneskelig mat soy registrerer høy, mens andre matvarer viser ingen aktivitet.

Abstract

Planter er en kilde til mat for mange dyr, og de kan produsere tusenvis av kjemikalier. Noen av disse forbindelsene påvirker fysiologiske prosesser i virveldyr som forbruker dem, som endokrin funksjon. Fytoøstrogener, de mest studerte endokrine aktive fytokjemikalier, samhandler direkte med hypothalamo-hypofysen gonadalaksen i virveldyr endokrine systemet. Her presenterer vi den nye bruken av en cellebasert analyse for å screene planteekstrakter for tilstedeværelse av forbindelser som har estrogenic biologisk aktivitet. Denne analysen bruker pattedyrceller konstruert for å uttrykke østrogenreseptor beta (ERβ) og som har blitt trans infisert med et luciferase gen. Eksponering for forbindelser med estrogenic aktivitet resulterer i cellene som produserer lys. Denne analysen er en pålitelig og enkel måte å teste for biologisk estrogenic aktivitet. Den har flere forbedringer over forbigående transfeksjonsanalyser, spesielt brukervennlighet, cellenes stabilitet og følsomheten til analysen.

Introduction

Planter er en nødvendig kilde til mat for mange dyr, og gir kalorier og næringsstoffer som er kritiske til overlevelse, reproduksjon, vekst, utvikling og atferd¹. Planter produserer tusenvis av kjemikalier, mange som tilpasninger for egen vekst, stomatisk vedlikehold og reproduksjon. Andre forbindelser, anses plante sekundære metabolitter (PSMs), har funksjoner som er mindre klare, selv om noen er giftige og sannsynligvis brukes som et forsvar mot planteetende og parasitisme (f.eks alkaloider, tanniner)^2,3. Noen av disse kjemikaliene har evnen til å påvirke langsiktige fysiologiske prosesser hos dyr, som endokrine funksjoner, selv om hvorfor disse endokrine-aktive fytokjemikalier samhandler med virveldyr endokrine systemet er fortsatt^{uklart 2,4}.

Fytoøstrogener, de mest studerte endokrine aktive fytokjemikalier, er polyfenoliske PSMer som strukturelt og funksjonelt etterligner østrogener, direkte samhandler med hypothalomo-hypofysen gonadal aksen av virveldyr endokrine systemet⁵. Inntak av fytoøstrogener i det menneskelige kostholdet er forbundet med beskyttelse mot noen kreftformer, hjertesykdom, og menopausale symptomer, selv om andre effekter inkluderer fruktbarhet problemer. Faktisk ble de fysiologiske effektene av disse forbindelsene oppdaget på 1940-tallet da infertilitet hos sauer ble tilskrevet deres beite på fytoøstrogenrik kløver (Trifolium subterrareum)⁶. Når inntok, fytoøstrogener kan passere inn i celler og etterligne effekten av østrogen. Mens fytoøstrogener hadde negative effekter på sauefruktbarhet, forholdet mellom fytoøstrogener og fysiologi er ikke enkelt. Som sauer, sørlige hvite neshorn vise følsomhet for estrogenic forbindelser i fôr avledet fra store mengder soy og alfalfa. Døtre av kvinner matet denne dietten under graviditet er mindre sannsynlig å reprodusere⁷. Andre studier har imidlertid vist at fytoøstrogener også kan ha positive effekter, inkludert modning av eggstokkfollikler hos eldre mus⁸, forebygging av visse kreftformer, antioksidantaktivitet og antiproliferative effekter⁹.

Bredden av effektene av fytoøstrogener er ikke overraskende gitt at østrogener påvirker et bredt spekter av biologiske funksjoner, inkludert vekst, utvikling og regulering av reproduktive og sentralnervesystemet¹⁰. Selv om det er mange virkningsmekanismer, har fytoøstrogener ofte evnen til å modifisere, forbedre eller forstyrre østrogensignalering gjennom deres evne til å fungere som ligands for intranukleære østrogenreseptorer alfa og beta (ERα og ERβ). Mange fytoøstrogener har en fenolisk ringstruktur som ligner østrogener som gjør at de kan binde østrogenreseptorer. De med pinefull østrogen aktivitet fungerer som østrogen, danner et aktivert ER-ligand kompleks som kan dimme og binde seg til et østrogenresponselement (ERE) og utløse gentranskripsjon¹¹. Dermed regulerer østrogener og fytoøstrogener celleaktivitet og systemfunksjoner gjennom sine handlinger som transkripsjonsfaktorer.

Her presenterer vi den nye bruken av en cellebasert analyse for å screene planteekstrakter for tilstedeværelse av forbindelser som har estrogenic biologisk aktivitet. Denne analysen bruker kinesisk hamster eggstokk CHO celler konstruert for å uttrykke svært uttrykke ERβ, som har blitt transifisert med firefly (Photinus pyralis) luciferase genet knyttet til en ERE promotor¹². Når estrogenic forbindelser er til stede, binder de seg til ER, dimerize, og binder seg til ERE, noe som fører til transkripsjon av luciferase genet. Ved tilsetning av en substratløsning katalyserer luciferase en reaksjon som fører til fotonutslipp. Derfor produserer positive prøver lette og negative prøver ikke.

Denne kommersielt tilgjengelige analysen eliminerer behovet for laboratorier for å transfisere pattedyrcellene med reportergenet og østrogenreseptoren^13,14, som var ustabil og variabel i effekt. Analysen gir en stabil transfection plattform som gjør det mulig for raskt og enkelt å avgjøre om en plante har estrogenic aktivitet via reseptor binding.

Vi tester hypotesen om at soyabønner har høyere estrogenic aktivitet enn alle andre matvarer gitt sine kjente konsentrasjoner av estrogenic isoflavoner^{15 ved} hjelp av menneskelig mat fra lokale kjøpmenn.

Protocol

1. Utarbeidelse av plantematerialer Frys tørre planteelementer som ble samlet friske ved hjelp av en lyofilisator. For å beskytte prøver mot lys, dekk kamre med aluminiumsfolie under tørkeprosessen. For å sikre at prøvene er helt tørre, lyofilisere til kamre ikke lenger føler seg kalde å berøre og plantematerialer ikke lenger mister masse når de veies. Oppbevar tørkede planter i sterile lave rester poser i fravær av lys til sliping. Finslip prøv…

Representative Results

Tjueto ekstrakter av frukt og grønnsaker som vanligvis finnes i menneskelige dietter ble screenet for tilstedeværelse av estrogenic forbindelser. En rekke matvarer ble analysert, inkludert belgfrukter, som soyabønner, snøerter og snap erter, da ertfamilien er en kjent kilde til fytoøstrogener16, samt fiken, datoer, mais, gulrøtter, epler, bananer, jordbær, tomat, grønnkål og kål. Endokrine forstyrrende forbindelser finnes i vanlige stoffer (f.eks. plast og plantevernmidler) og noen er bi…

Discussion

ERβ reporter analyse utviklet for å individuelt screene farmasøytiske midler er også egnet for screening plantemat for fytoøstrogener biologisk aktive gjennom ERβ. Viktige hensyn i protokollen inkluderer behandling av planteprøvene med forsiktighet: ferskt plantemateriale må tørkes raskt for å forhindre støping eller annen biologisk nedbrytning, og det må holdes borte fra lys for å forhindre fotolyse^{av forbindelsene 18}. Analyseprotokollen¹² fra produsenten er k…

Materials

1000 µL pipette
20 µL pipette
200 µL pipette
37 ℃ water bath
37 ℃, humidified 5% CO2 incubator
70% ethanol
analytical balance
cell culture-rated laminar flow hood
dimethyl sulfoxide
disposable media basin, sterile
drip filtration system
Erlenmeyer flasks			125 mL and 250 mL
HPLC grade methanol
Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays	Indigo Biosciences	IB00411	Assay kit – analyzes 24 samples plus standard curve
lyophilizer
multi-channel pipette
orbital shaker
plate-reading luminometer			ex. Bioteck Synergy HTX
rotory evaporator
round bottom flasks			50 mL and 300 mL
sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins
sterile tips			200 µL and 1000 µL
Whatman grade 1 paper
whirl-pak bags			sterile polyethylene bags