Summary
Vi har optimerat en kommersiellt tillgänglig östrogenreceptor β reporteranalys för screening av mänskliga och icke-mänskliga primatmat för östrogen aktivitet. Vi validerade denna analys genom att visa att den kända östrogena mänskliga mat soja registrerar hög, medan andra livsmedel visar ingen aktivitet.
Abstract
Växter är en källa till mat för många djur, och de kan producera tusentals kemikalier. Vissa av dessa föreningar påverkar fysiologiska processer hos ryggradsdjuren som konsumerar dem, såsom endokrin funktion. Fytoöstrogener, den mest väl studerade endokrina aktiva fytokemikalier, interagerar direkt med hypotalamus-hypofysen gonadal axeln i ryggradsdjur endokrina systemet. Här presenterar vi den nya användningen av en cellbaserad analys för att screena växtextrakt för förekomst av föreningar som har östrogen biologisk aktivitet. Denna analys använder däggdjursceller konstruerade för att mycket uttrycka östrogenreceptor beta (ERβ) och som har transfecterats med en luciferas gen. Exponering för föreningar med östrogen aktivitet resulterar i att cellerna producerar ljus. Denna analys är ett tillförlitligt och enkelt sätt att testa för biologisk östrogen aktivitet. Det har flera förbättringar över övergående transfection analyser, särskilt användarvänlighet, cellernas stabilitet och känsligheten hos analysen.
Introduction
Växter är en nödvändig källa till mat för många djur, vilket ger kalorier och näringsämnen som är kritiska för överlevnad, reproduktion, tillväxt, utveckling och beteende1. Växter producerar tusentals kemikalier, många som anpassningar för sin egen tillväxt, stomatiskt underhåll och reproduktion. Andra föreningar, som anses vara växt sekundära metaboliter (PSM), har funktioner som är mindre tydliga, även om vissa är giftiga och sannolikt används som ett försvar mot växtätande och parasitism (t.ex. alkaloider, tanniner)2,3. Vissa av dessa kemikalier har förmågan att påverka långsiktiga fysiologiska processer hos djur, såsom endokrin funktion, även om varför dessa endokrina aktiva fytokemikalier interagerar med ryggradsdjurens endokrina system är fortfarande oklart2,4.
Fytoöstrogener, de mest väl studerade endokrina aktiva fytokemikalier, är polyfenoliska PSMs som strukturellt och funktionellt efterliknar östrogener, direkt interagerar med hypotalaomo-hypofysen gonadal axeln i ryggradsdjur endokrina systemet5. Intag av fytoöstrogener i den mänskliga kosten är förknippat med skydd mot vissa cancerformer, hjärtsjukdomar och klimakteriebesvär, även om andra effekter inkluderar fertilitetsproblem. Faktum är att de fysiologiska effekterna av dessa föreningar upptäcktes på 1940-talet när infertilitet hos får tillskrevs deras bete på fytoöstrogenrik klöver (Trifolium subterrareum)6. När intas, fytoöstrogener kan passera in i celler och efterlikna effekterna av östrogen. Medan fytoöstrogener hade negativa effekter på fårens fertilitet, är förhållandet mellan fytoöstrogener och fysiologi inte enkelt. Liksom får visar södra vita noshörningar känslighet för östrogena föreningar i foder som härrör från stora mängder soja och alfalfa. Döttrar till kvinnor som matas denna diet under graviditeten är mindre benägna att reproducera7. Andra studier har dock visat att fytoöstrogener också kan ha positiva effekter, inklusive mognad av äggstockssäckar hos äldre möss8, förebyggande av vissa cancerformer, antioxidantaktivitet och antiproliferativa effekter9.
Bredden av effekterna av fytoöstrogener är inte förvånande med tanke på att östrogener påverkar ett brett spektrum av biologiska funktioner, inklusive tillväxt, utveckling, och reglering av de reproduktiva och centrala nervsystemet10. Även om det finns många verkningsmekanismer, fytoöstrogener har ofta förmågan att modifiera, förbättra eller störa östrogen signalering genom sin förmåga att fungera som ligands för de intranukleära östrogenreceptorerna alfa och beta (ERα och ERβ). Många fytoöstrogener har en fenolisk ringstruktur som liknar östrogener som gör det möjligt för dem att binda östrogenreceptorer. De med agonistisk östrogen aktivitet fungerar som östrogen, bildar ett aktiverat ER-ligand komplex som kan dimerize och binda till ett östrogen svar element (ERE) och utlösa gen transkription11. Således reglerar östrogener och fytoöstrogener cellaktivitet och systemfunktioner genom sina handlingar som transkriptionsfaktorer.
Här presenterar vi den nya användningen av en cellbaserad analys för att screena växtextrakt för förekomst av föreningar som har östrogen biologisk aktivitet. Denna analys använder kinesiska hamster äggstock CHO celler konstruerade för att mycket uttrycka ERβ, som har transfected med firefly (Photinus pyralis) luciferase gen kopplad till en ERE promotor12. När östrogena föreningar finns binder de till akuten, dimeriserar och binder till ERE, vilket leder till transkription av luciferasgenen. Vid tillsats av en substratlösning katalyserar luciferasen en reaktion som leder till fotonutsläpp. Därför producerar positiva prover lätta och negativa prover gör det inte.
Denna kommersiellt tillgängliga analys eliminerar behovet av laboratorier att transfekterade däggdjurscellerna med reportergenen och östrogenreceptorn13,14, som var instabil och varierande i effekt. Analysen ger en stabil transfection plattform som möjliggör snabbt och enkelt avgöra om en växt har östrogen aktivitet via receptorbindning.
Vi testar hypotesen att sojabönor har högre östrogen aktivitet än alla andra livsmedel med tanke på deras kända koncentrationer av östrogena isoflavoner15 med humana livsmedel från lokala livsmedelsbutiker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av växtmaterial
- Frys torra växtartiklar som samlades färska med en lyofilis.
- För att skydda prover från ljus, täck kamrar med aluminiumfolie under torkningsprocessen.
- För att säkerställa att proverna är helt torra, frys tills kamrarna inte längre känner sig kalla att röra vid och växtmaterial inte längre förlorar massa när de vägs.
- Förvara torkade växter i sterila påsar med låg resthalt i avsaknad av ljus fram till slipning.
- Finmala prover med en slipkvarn med 0,85 mm nätskärm.
- Förvara markproverna i påsarna i avsaknad av ljus fram till extraktionen.
2. Extraktion av sekundära metaboliter
- För att extrahera sekundära växtmetaboliter, använd ett förhållande på 1 g torkat prov till 10 ml metanol av HPLC-klass.
- Väg provet på en analytisk balans och tillsätt det i en erlenmeyerkolv av lämplig storlek (125 – 250 ml). Tillsätt sedan lämplig volym metanol. Registrera massan av extraherat prov.
- Täck växt-metanollösningen med aluminiumfolie och ställ sedan in för att rotera vid 100 rpm hastighet vid rumstemperatur (RT) i 3 dagar på en orbital shaker, så att de potentiellt östrogena föreningarna kan lösas upp i metanol.
- Dekantera supernatanten till ett droppfiltreringssystem med filterpapper (125 mm).
- Använd en roterande förångare, torka växtextraktet tills provet är förtjockat, men hällbart, i en 300 ml rund bottenkolv. Häll provet i en kolv på 50 ml rund botten och skölj den stora kolven med en liten mängd metanol. Fortsätt att torka provet i den lilla kolven tills metanolen är helt avdunstad.
- Väg provresterna med hjälp av en analytisk balans. Registrera restmassa.
- Lös upp växtextraktet i dimetylsulfoxid (DMSO) vid en koncentration av 0,1 g extrakt till 2 ml DMSO. Virvel tills den är homogeniserad.
- Förvara anläggningens extrakt-DMSO-lösning vid 4 °C i bärnstensfärgade glasflaskor tills analysen.
VARNING: Växter kan producera okända biologiskt aktiva kemikalier, och DMSO är ett fordon som kan transportera dem över cellmembran. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och var försiktig när du hanterar dessa prover.
3. Human östrogenreceptor β transfection assay12
OBS: Aseptisk teknik och en laminär flödeshuv krävs för dag 1 i analysprotokollet.
- Förbered utspädningar av 17β-Estradiol för standardkurvan.
- Överför cellåtervinningsmediet och compound screening medium (CSM) från frysförvaringen och tina i ett 37 °C vattenbad.
- Etikett microcentrifuge rör Mellanliggande 1 och 2 (INT1, INT2) och 1-8.
- Fyll INT1 med 995 μL CSM, INT2 med 615 μL CSM, rör 1 med 900 μL CSM och rör 2-8 med 600 μL CSM. Ställ röret 8 åt sidan.
- Överför 5 μL 100 μM 17β-Estradiol-bestånd till INT1. Kassera spetsen. Vortex.
- Skölj pipetten 3 gånger före varje överföring och överför sedan 10 μL från INT1 till INT2. Kassera spetsen.
- Skölj pipetten 3 gånger och överför sedan 100 μL från INT2 till rör 1. Kassera spetsen. Överför 300 μL från rör 1 till rör 2. Upprepa för rör 3 till 7. Kassera 300 μL från rör 7 i avfallsbehållaren. Rör 8 är en nolla och får inte estradiol. Slutliga koncentrationer av pläterade standarder är: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 och 0 pM estradiol.
- Förbered provföreningar.
- Vortex prover.
- Ta 4 μL av varje växtprov i DMSO och tillsätt till 496 μL CSM för att ge en 0,8% DMSO-lösning.
- Tina snabbt upp reporterceller.
- Hämta cellåtervinningsmediets rör från vattenbadet på 37 °C. Desinficera utsidan med 70% etanol.
- Hämta reporterceller från -80 °C lagring och tina genom att överföra 10 ml av den förvärmda CRM till röret av frusna celler.
- Stäng röret på Reporter Cells och överför till ett 37°C vattenbad i 5-10 min.
- Hämta röret med Reporter Cell Suspension från vattenbadet. Vänd cellröret flera gånger försiktigt för att bryta upp aggregat av celler och producera en homogen suspension. Rengör rörytan med 70% etanol.
- Analysplätering
- Dispensera 100 μL av Reporter Cell Suspension i varje brunn med en flerkanalspipett.
- Dela ut 100 μL prover i tre exemplar i lämpliga analysbrunnar.
- Överför plattan till en 37 °C, fuktad 5% CO2 inkubator i 22-24 h.
- Thaw Detection Substrate and Detection Buffer i ett mörkt kylskåp över natten för att förbereda sig för dag 2.
- Strax före slutet av plattans inkubation, ta bort detektionssubstrat och detekteringsbuffert från kylskåpet och placera i svagt ljusområde tills det är jämvikt till RT. En gång på RT, vänd försiktigt varje rör flera gånger för att noggrant blanda lösningar.
- Omedelbart innan inkubationen är klar häller du hela innehållet i detektionsbufferten i röret på detektionssubstratet för att skapa Luciferase Detection Reagens. Blanda försiktigt för att inte producera skum.
- När inkubationen är klar, vänd plattan för att kassera innehållet i en lämplig avfallsbehållare. Knacka försiktigt på plattan på en ren absorberande pappershandduk för att ta bort de sista dropparna från brunnarna.
- Tillsätt 100 μL luciferasdetekteringsreagens till varje brunn. Låt analysplattan vila på RT i 15 minuter. Skaka inte tallriken.
- Kvantifiera luminescence med hjälp av en 96-brunns skyltavläsningsluminometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tjugotvå extrakt av frukt och grönsaker som ofta finns i mänskliga dieter screenades för förekomst av östrogena föreningar. En mängd olika livsmedel analyserades, inklusive baljväxter, såsom sojabönor, snöärter och snapärter, eftersom ärtfamiljen är en känd källa till fytoöstrogener16, liksom fikon, datum, majs, morötter, äpplen, bananer, jordgubbar, tomat, grönkål och kål. Hormonstörande föreningar finns i vanliga ämnen (t.ex. plast och bekämpningsmedel) och vissa är biologiskt aktiva genom ERs17. När det var möjligt analyserades både ekologiska och oorganiskt odlade föremål för att ta hänsyn till möjligheten att bekämpningsmedel med östrogen aktivitet kunde ha påverkat resultaten.
Varje växtmatspost pläterades i tre exemplar och luminometern rapporterade varje brunns aktivitet i relativa ljusenheter (RLUs). Bakgrundsnivåer för RRLUs bestäms i standardkurvan med standard 8, nollkoncentrationen och används som referens. Vikaktiveringsvärdet, som är multiplikatorn ovanför RLU för nollpunkten på kurvan, beräknas med ekvationen:
Vikaktivering = Okänd (RLU) ÷ standard 8 (RLU)
För tolkningsändamål presenteras östrogen aktivitet på ett ordinalt, kvalitativt sätt av hög, med, låg eller ingen aktivitet. Höga aktivitetsnivåer registrerar sig över standardvärdet för 4-viks aktivering. Medelstora fall mellan Standard 5 och Standard 4, och låga värden ligger mellan Standard 6 och Standard 5. Alla prover med vikaktiveringsvärden under standard 7 betraktas som ingen aktivitet. Med hänvisning till tabell 1,sojabönor, både ekologiska och icke-ekologiska, screenade vid höga aktivitetsnivåer, medan alla andra frukt- och grönsaksartiklar inte registrerade någon aktivitet. Att jämföra sojabönsresultat med standardkurvan (figur 1), visar att oavsett om de odlas organiskt eller inte, får de höga poäng från kurvan för estradiolaktivitetsnivåer vid denna koncentration. Sojabönsextrakt, en känd potent källa till isoflavoner daidzein och genistein9, användes vidare för att bestämma utspädningen som gav en 50% signal till maximalt (Figur 2). Detta extrakt kräver 422 gånger mer utspädning för att producera hälften av signalen i vårt standardutspädningsprotokoll.
| Producera artikel | Ekologisk/ icke-ekologisk | Relativa ljusenheter (Lum) | Vik aktivering | Vik aktivering (medelvärde) | Fytoöstrogen aktivitet |
| Sojabönor | Ekologiska | 1687 | 29.016 | 31.06 | Hög |
| 2023 | 34.796 | ||||
| 1706 | 29.353 | ||||
| Sojabönor | Icke-ekologisk | 2041 | 35.106 | 32.05 | Hög |
| 1956 | 33.647 | ||||
| 1593 | 27.399 | ||||
| Snöärter | Icke-ekologisk | 53 | 0.919 | 0.92 | Ingen aktivitet |
| 59 | 1.015 | ||||
| 49 | 0.836 | ||||
| Snap ärter | Icke-ekologisk | 66 | 1.142 | 1.21 | Ingen aktivitet |
| 60 | 1.032 | ||||
| 85 | 1.462 | ||||
| Majs | Icke-ekologisk | 29 | 0.502 | 0.53 | Ingen aktivitet |
| 30 | 0.513 | ||||
| 33 | 0.575 | ||||
| Jordgubb | Icke-ekologisk | 35 | 0.609 | 0.77 | Ingen aktivitet |
| 47 | 0.808 | ||||
| 51 | 0.884 | ||||
| Jordgubb | Ekologiska | 56 | 0.956 | 0.88 | Ingen aktivitet |
| 59 | 1.015 | ||||
| 39 | 0.678 | ||||
| Banan | Ekologiska | 32 | 0.544 | 0.52 | Ingen aktivitet |
| 28 | 0.489 | ||||
| 31 | 0.533 | ||||
| Banan | Icke-ekologisk | 33 | 0.564 | 0.60 | Ingen aktivitet |
| 41 | 0.712 | ||||
| 31 | 0.533 | ||||
| Groblad | Icke-ekologisk | 37 | 0.64 | 0.70 | Ingen aktivitet |
| 39 | 0.667 | ||||
| 47 | 0.805 | ||||
| Grönkål | Ekologiska | 26 | 0.447 | 0.47 | Ingen aktivitet |
| 26 | 0.444 | ||||
| 30 | 0.519 | ||||
| Grönkål | Icke-ekologisk | 40 | 0.685 | 0.63 | Ingen aktivitet |
| 28 | 0.485 | ||||
| 42 | 0.719 | ||||
| Kål | Ekologiska | 33 | 0.568 | 0.54 | Ingen aktivitet |
| 27 | 0.468 | ||||
| 34 | 0.588 | ||||
| Kål | Icke-ekologisk | 44 | 0.757 | 0.66 | Ingen aktivitet |
| 34 | 0.585 | ||||
| 36 | 0.626 | ||||
| Apple | Ekologiska | 30 | 0.523 | 0.49 | Ingen aktivitet |
| 25 | 0.437 | ||||
| 30 | 0.509 | ||||
| Apple | Icke-ekologisk | 41 | 0.705 | 0.62 | Ingen aktivitet |
| 31 | 0.53 | ||||
| 37 | 0.63 | ||||
| Tomat | Ekologiska | 51 | 0.874 | 0.87 | Ingen aktivitet |
| 57 | 0.974 | ||||
| 44 | 0.76 | ||||
| Tomat | Icke-ekologisk | 61 | 1.056 | 1.19 | Ingen aktivitet |
| 81 | 1.386 | ||||
| 66 | 1.128 | ||||
| Morot | Ekologiska | 33 | 0.575 | 0.51 | Ingen aktivitet |
| 33 | 0.561 | ||||
| 22 | 0.382 | ||||
| Morot | Icke-ekologisk | 31 | 0.53 | 0.52 | Ingen aktivitet |
| 21 | 0.365 | ||||
| 38 | 0.657 | ||||
| Fig | Icke-ekologisk | 29 | 0.506 | 0.61 | Ingen aktivitet |
| 42 | 0.716 | ||||
| 36 | 0.619 | ||||
| Datum | Icke-ekologisk | 29 | 0.495 | 0.59 | Ingen aktivitet |
| 39 | 0.667 | ||||
| 35 | 0.602 |
Tabell 1. Representativa resultat av ERβ Reporter Assay System för screening av frukt- och grönsaksartiklar för fytoöstrogenaktivitet. Positiv aktivitet indikeras av Hög, Med, Låg eller Ingen Aktivitet.
Figur 1. Seriell utspädning av 17β-Estradiol-standard (standard 1 till 8 koncentrationer = 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 respektive 0 pM) med ERβ Reporter Assay System. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. ERβ Reporter Assay använder en seriell utspädning av sojabönsextrakt för att bestämma utspädningen som gav ett signal-till-bakgrundsförhållande som är 50% av den maximala signalen. Från standardextraktionsmetoden som upplöser växtextraktet i dimetylsulfoxid (DMSO) vid en koncentration av 0,1 g extrakt till 2 ml DMSO, måste sojabönor spädas ut 422 gånger för att framkalla en signal 50% av det maximala svaret. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ERβ-reporterns analys som utvecklats för att individuellt screena farmaceutiska medel är också lämplig för screening av vegetabiliska livsmedel för fytoöstrogener som är biologiskt aktiva genom ERβ. Viktiga överväganden i protokollet inkluderar behandling av växtproverna med försiktighet: färskt växtmaterial måste torkas snabbt för att förhindra gjutning eller annan biologisk nedbrytning, och det måste hållas borta från ljus för att förhindra fotolys avföreningarna 18. Det analysprotokoll12 som tillhandahålls av tillverkaren är tydligt och behöver mycket få ändringar för screeningändamål. Den standardkurva som tillverkaren föreslår har ändrats i detta protokoll för att öka antalet punkter som faller i kurvans exponentiella intervall (figur 1), samtidigt som de övre och nedre platåerna bevaras. Det är möjligt att använda denna analys för kvantitativ analys, men vårt syfte är att associera växter med hög aktivitet till biologiska effekter, matval och andra beteenden hos de djur som konsumerar dem.
För att ytterligare illustrera effektiviteten av extraktion och analys inkluderade vi en dosresponskurva med sojabönextrakt (figur 2) och bestämde att med tanke på styrkan i det normala extraktionsprotokollet måste soja spädas ut kraftigt innan signalen sjunker till 50% maximalt. Detta belyser det faktum att vid höga koncentrationer av fytoöstrogener signalplatåerna vid en stabil maximal signal. Vid mycket låga koncentrationer kanske signalen inte är tillräckligt stark för att särskiljas från bakgrunden. Det är viktigt att arbeta med höga koncentrationer av extrakt, för att upptäcka fytoöstrogener som finns i låga mängder i ett prov, vilket minimerar falska negativ. Inledningsvis använde laboratoriet en större volym DMSO i förhållande till växtresterna från metanolextraktionen (dvs. 10 ml DMSO till 0,1 g växtrester). Proverna var för utspädda för att inducera en stark luminiscens i positiva prover. På grund av en maximal DMSO-procentandel för cellens livskraft och volymbegränsningar i brunnarna på plattan bör provextraktkoncentrationen optimeras när DMSO tillsätts till växtresterna. En positiv kontroll som soja bör inkluderas på varje platta, för att bekräfta att cellerna är livskraftiga och kan luminescence, och att extraktkoncentrationen är tillräcklig för att framkalla ett svar.
Denna analys detekterar föreningar som binder till ERβ, men inte alla fytoöstrogener har samma verkningsmekanism. Detta analysprotokoll kan ändras genom att inkubera cellerna med en kombination av estradiol och växtföreningarna för att upptäcka om det finns antiestrogen aktivitet i ett prov9,12. Estradiol har stor affinitet till ER, så förekomsten av fytoöstrogener kan ha antiöstrogen biologisk aktivitet i närvaro av estradiol genom att blockera receptorerna, vilket minskar svaret på östrogener. Antiestrogen aktivitet skulle upptäckas genom en minskning av den totala aktiveringen med ökande koncentration av växtextrakt. Denna analys kommer inte att upptäcka andra handlingsmetoder, såsom bindning till membranbundna ERs19. Dessutom är vissa fytoöstrogener inte biologiskt aktiva förrän de har metaboliserats av tarmmikrober20. Det är möjligt att vissa växter som inte har någon eller låg östrogen aktivitet i sitt ometaboliserade tillstånd har högre östrogen aktivitet efter metabolisering som denna analys inte skulle upptäcka.
ERβ-reporterns analys har valts för att exemplifiera screeningen av fytoöstrogener för aktivitet i växter eftersom fytoöstrogener konkurrerar om att binda med estradiol starkare till ERβ än de gör med ERα21. Screening för ERα-aktivitet är möjlig genom en liknande analys, där cellerna transfekteras med ERα-genen snarare än ERβ.
Efter en positiv screening för aktiva fytoöstrogener kan de aktiva föreningarna identifieras med kromatografimetoder. Vid den tidpunkten kan de isolerade föreningarna testas med hjälp av denna analys och de halva maximala effektiva koncentrationerna (EG50)kan bestämmas med hjälp av en utspädningsserie som ett mått på föreningens styrka.
Denna analys är ett tillförlitligt och enkelt sätt att testa för biologisk östrogen aktivitet, med tanke på dess begränsningar i bredden av mekanismer för östrogen aktivitet. Det har flera förbättringar över övergående transfection analyser, särskilt användarvänlighet, cellernas stabilitet och känsligheten hos analysen.
Lite är känt om prevalensen av fytoöstrogener i vilda vegetabiliska livsmedel som konsumeras av människor eller vildadjur 22, men studier visar att exponering för östrogena PSM i kosten kan ha långvariga effekter23. Att ha en enkel robust analys som upptäcker dessa föreningar, i samband med studier som bedömer uppätna mängder och när de äts, är ett kraftfullt steg för att bestämma funktionen att inkludera östrogena livsmedel i kosten och effekterna av dessa föreningar på fysiologiska system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma mot Dale Leitman för inledande utbildning i användning av transienta transfection analyser för att bestämma östrogen aktivitet av primat vegetabiliska livsmedel. Tack till Bradford Westrich och C. Eric Johnson för att de hjälpte till att sätta upp laboratorieutrustning och utbilda studenter i extraktionsmetoder. Slutligen, tack till Indiana University för att ni finansierar denna forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ° water bath | |||
| 37 °, humidified 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analytical balance | |||
| cell culture-rated laminar flow hood | |||
| dimethyl sulfoxide | |||
| disposable media basin, sterile | |||
| drip filtration system | |||
| Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
| HPLC grade methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve |
| lyophilizer | |||
| multi-channel pipette | |||
| orbital shaker | |||
| plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotory evaporator | |||
| round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
| sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
| sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 paper | |||
| whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
References
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
- Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution. International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).
- DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal. Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).
- Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -L. Primate Diet & Nutrition. Lambert, J. E., Rothman, J. M. , University of Chicago Press. (2020).
- Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys. African Journal of Ecology. , (2019).
- Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).
- Tubbs, C. W., et al. Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility. General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).
- Shen, M., et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model. European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).
- Boué, S. M., et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Nishikawa, J. -i, et al. New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).
- Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , Indigo Biosciences. State College, PA. (2020).
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda. American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).
- Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3'-diindolylmethane. Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).
- Whitten, P. L., Patisaul, H. B. Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action. Environmental Health Perspectives. 109, suppl 1 5-20 (2001).
- Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. Advances in Food and Nutrition Research. , Academic Press Inc. (2019).
- Lutz, I., Kloas, W. Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding. Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).
- Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).
- Jeng, Y. -J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells. Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).
- Dixon, R. A.
- Kuiper, G. G. J. M., et al. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β. Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).
- Wasserman, M. D. Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , UC Berkeley. (2011).
- Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure. Reproduction. 143 (3), Cambridge, England. 247-260 (2012).
