Summary
Vi har optimalisert en kommersielt tilgjengelig østrogenreseptor β reporter analyse for screening menneskelige og ikke-menneskelige primat mat for østrogen aktivitet. Vi validerte denne analysen ved å vise at den kjente estrogenic menneskelig mat soy registrerer høy, mens andre matvarer viser ingen aktivitet.
Abstract
Planter er en kilde til mat for mange dyr, og de kan produsere tusenvis av kjemikalier. Noen av disse forbindelsene påvirker fysiologiske prosesser i virveldyr som forbruker dem, som endokrin funksjon. Fytoøstrogener, de mest studerte endokrine aktive fytokjemikalier, samhandler direkte med hypothalamo-hypofysen gonadalaksen i virveldyr endokrine systemet. Her presenterer vi den nye bruken av en cellebasert analyse for å screene planteekstrakter for tilstedeværelse av forbindelser som har estrogenic biologisk aktivitet. Denne analysen bruker pattedyrceller konstruert for å uttrykke østrogenreseptor beta (ERβ) og som har blitt trans infisert med et luciferase gen. Eksponering for forbindelser med estrogenic aktivitet resulterer i cellene som produserer lys. Denne analysen er en pålitelig og enkel måte å teste for biologisk estrogenic aktivitet. Den har flere forbedringer over forbigående transfeksjonsanalyser, spesielt brukervennlighet, cellenes stabilitet og følsomheten til analysen.
Introduction
Planter er en nødvendig kilde til mat for mange dyr, og gir kalorier og næringsstoffer som er kritiske til overlevelse, reproduksjon, vekst, utvikling og atferd1. Planter produserer tusenvis av kjemikalier, mange som tilpasninger for egen vekst, stomatisk vedlikehold og reproduksjon. Andre forbindelser, anses plante sekundære metabolitter (PSMs), har funksjoner som er mindre klare, selv om noen er giftige og sannsynligvis brukes som et forsvar mot planteetende og parasitisme (f.eks alkaloider, tanniner)2,3. Noen av disse kjemikaliene har evnen til å påvirke langsiktige fysiologiske prosesser hos dyr, som endokrine funksjoner, selv om hvorfor disse endokrine-aktive fytokjemikalier samhandler med virveldyr endokrine systemet er fortsattuklart 2,4.
Fytoøstrogener, de mest studerte endokrine aktive fytokjemikalier, er polyfenoliske PSMer som strukturelt og funksjonelt etterligner østrogener, direkte samhandler med hypothalomo-hypofysen gonadal aksen av virveldyr endokrine systemet5. Inntak av fytoøstrogener i det menneskelige kostholdet er forbundet med beskyttelse mot noen kreftformer, hjertesykdom, og menopausale symptomer, selv om andre effekter inkluderer fruktbarhet problemer. Faktisk ble de fysiologiske effektene av disse forbindelsene oppdaget på 1940-tallet da infertilitet hos sauer ble tilskrevet deres beite på fytoøstrogenrik kløver (Trifolium subterrareum)6. Når inntok, fytoøstrogener kan passere inn i celler og etterligne effekten av østrogen. Mens fytoøstrogener hadde negative effekter på sauefruktbarhet, forholdet mellom fytoøstrogener og fysiologi er ikke enkelt. Som sauer, sørlige hvite neshorn vise følsomhet for estrogenic forbindelser i fôr avledet fra store mengder soy og alfalfa. Døtre av kvinner matet denne dietten under graviditet er mindre sannsynlig å reprodusere7. Andre studier har imidlertid vist at fytoøstrogener også kan ha positive effekter, inkludert modning av eggstokkfollikler hos eldre mus8, forebygging av visse kreftformer, antioksidantaktivitet og antiproliferative effekter9.
Bredden av effektene av fytoøstrogener er ikke overraskende gitt at østrogener påvirker et bredt spekter av biologiske funksjoner, inkludert vekst, utvikling og regulering av reproduktive og sentralnervesystemet10. Selv om det er mange virkningsmekanismer, har fytoøstrogener ofte evnen til å modifisere, forbedre eller forstyrre østrogensignalering gjennom deres evne til å fungere som ligands for intranukleære østrogenreseptorer alfa og beta (ERα og ERβ). Mange fytoøstrogener har en fenolisk ringstruktur som ligner østrogener som gjør at de kan binde østrogenreseptorer. De med pinefull østrogen aktivitet fungerer som østrogen, danner et aktivert ER-ligand kompleks som kan dimme og binde seg til et østrogenresponselement (ERE) og utløse gentranskripsjon11. Dermed regulerer østrogener og fytoøstrogener celleaktivitet og systemfunksjoner gjennom sine handlinger som transkripsjonsfaktorer.
Her presenterer vi den nye bruken av en cellebasert analyse for å screene planteekstrakter for tilstedeværelse av forbindelser som har estrogenic biologisk aktivitet. Denne analysen bruker kinesisk hamster eggstokk CHO celler konstruert for å uttrykke svært uttrykke ERβ, som har blitt transifisert med firefly (Photinus pyralis) luciferase genet knyttet til en ERE promotor12. Når estrogenic forbindelser er til stede, binder de seg til ER, dimerize, og binder seg til ERE, noe som fører til transkripsjon av luciferase genet. Ved tilsetning av en substratløsning katalyserer luciferase en reaksjon som fører til fotonutslipp. Derfor produserer positive prøver lette og negative prøver ikke.
Denne kommersielt tilgjengelige analysen eliminerer behovet for laboratorier for å transfisere pattedyrcellene med reportergenet og østrogenreseptoren13,14, som var ustabil og variabel i effekt. Analysen gir en stabil transfection plattform som gjør det mulig for raskt og enkelt å avgjøre om en plante har estrogenic aktivitet via reseptor binding.
Vi tester hypotesen om at soyabønner har høyere estrogenic aktivitet enn alle andre matvarer gitt sine kjente konsentrasjoner av estrogenic isoflavoner15 ved hjelp av menneskelig mat fra lokale kjøpmenn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av plantematerialer
- Frys tørre planteelementer som ble samlet friske ved hjelp av en lyofilisator.
- For å beskytte prøver mot lys, dekk kamre med aluminiumsfolie under tørkeprosessen.
- For å sikre at prøvene er helt tørre, lyofilisere til kamre ikke lenger føler seg kalde å berøre og plantematerialer ikke lenger mister masse når de veies.
- Oppbevar tørkede planter i sterile lave rester poser i fravær av lys til sliping.
- Finslip prøver ved hjelp av en slipemølle med 0,85 mm nettingskjerm.
- Oppbevar bakkeprøvene i posene i fravær av lys til ekstraksjon.
2. Ekstraksjon av sekundære plantemetabolitter
- For å trekke ut de sekundære plantemetabolittene, bruk et forhold på 1 g tørket prøve til 10 ml HPLC-klasse metanol.
- Vei prøven på en analytisk balanse og legg den til en erlenmeyerkolbe i riktig størrelse (125 – 250 ml). Legg deretter til riktig volum metanol. Registrer massen av prøven ekstrahert.
- Dekk plantemetanolløsningen med aluminiumsfolie, og sett den deretter til å rotere ved 100 rpm hastighet ved romtemperatur (RT) i 3 dager på en orbital shaker, slik at de potensielt estrogenic forbindelser å oppløses i metanol.
- Dekanter overnatanten til et dryppfiltreringssystem ved hjelp av filterpapir (125 mm).
- Bruk en roterende fordamper til å tørke planteekstraktet til prøven er tykkere, men hellbar, i en 300 ml rundbunnskolbe. Hell prøven i en 50 ml rundbunnskolbe, skyll den store kolben med en liten mengde metanol. Fortsett å tørke prøven i den lille kolben til metanol er helt fordampet.
- Vei prøverester ved hjelp av en analytisk balanse. Ta opp restmasse.
- Oppløs planteekstraktet i dimetylsulfoksid (DMSO) med en konsentrasjon på 0,1 g ekstrakt til 2 ml DMSO. Vortex til homogenisert.
- Oppbevar planteekstrakt-DMSO oppløsningen ved 4 °C i hetteglass med gult glass til analysen.
FORSIKTIG: Planter kan produsere ukjente biologisk aktive kjemikalier, og DMSO er et kjøretøy som kan transportere dem over cellemembraner. Bruk egnet personlig verneutstyr og stell når du håndterer disse prøvene.
3. Human østrogenreseptor β transfeksjonsanalyse12
MERK: Aseptisk teknikk og en laminær strømningshette kreves for dag 1 i analyseprotokollen.
- Forbered fortynninger av 17β-Østradiol for standardkurven.
- Overfør Cell Recovery Medium og Compound Screening Medium (CSM) fra fryselageret og tin i et 37 °C vannbad.
- Merk mikrocentrifugerør mellom 1 og 2 (INT1, INT2) og 1-8.
- Fyll INT1 med 995 μL CSM, INT2 med 615 μL CSM, rør 1 med 900 μL CSM og rør 2-8 med 600 μL CSM. Sett røret 8 til side.
- Overfør 5 μL μM 17β-Østradiol Lager til INT1. Kast spissen. Vortex.
- Før hver overføring må du skylle pipetten 3 ganger, og overfør deretter 10 μL fra INT1 til INT2. Kast spissen.
- Skyll pipetten 3 ganger, og overfør deretter 100 μL fra INT2 til rør 1. Kast spissen. Overfør 300 μL fra rør 1 til rør 2. Gjenta for rør 3 til 7. Kast 300 μL fra rør 7 i avfallsbeholder. Tube 8 er en Null og mottar ikke østradiol. Endelige konsentrasjoner av belagte standarder er: 400, 133,3, 44,44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487, og 0 pM østradiol.
- Forbered prøveforbindelser.
- Vortex prøver.
- Ta 4 μL av hver planteprøve i DMSO og legg til 496 μL CSM for å gi en 0,8% DMSO-løsning.
- Raskt tine Reporter Celler.
- Hent røret til Cell Recovery Medium fra 37 °C vannbadet. Desinfiser utsiden med 70 % etanol.
- Hent reporterceller fra -80 °C lagring og tin ved å overføre 10 ml av den forhåndsoppvarmede CRM til røret av frosne celler.
- Lukk røret av Reporter Cells og overfør til et 37 ° C vannbad i 5-10 min.
- Hent røret til Reporter Cell Suspension fra vannbadet. Inverter cellerøret flere ganger forsiktig for å bryte opp aggregater av celler og produsere en homogen suspensjon. Rengjør overflaten av røret med 70% etanol.
- Analyse plating
- Dispenser 100 μL av Reporter Cell Suspension i hver brønn ved hjelp av en flerkanals pipette.
- Dispenser 100 μL prøver i triplicate i passende analysebrønner.
- Overfør platen til en 37 °C, fuktet 5 % CO2 inkubator i 22-24 timer.
- Tiningssubstrat og deteksjonsbuffer i et mørkt kjøleskap over natten for å forberede seg på dag 2.
- Like før slutten av plateinkubasjonen fjerner du deteksjonssubstrat og deteksjonsbuffer fra kjøleskapet og plassers i svakt lysområde til det er likevektig til RT. En gang ved RT, inverter hvert rør forsiktig flere ganger for å blande løsninger grundig.
- Umiddelbart før inkubasjonen er fullført, hell hele innholdet i deteksjonsbufferen i deteksjonssubstratet for å lage Luciferase Detection Reagens. Bland forsiktig for ikke å produsere skum.
- Når inkubasjonen er fullført, snu platen for å kaste innhold i en passende avfallsbeholder. Bank platen forsiktig på et rent absorberende papirhåndkle for å fjerne de siste dråpene fra brønnene.
- Tilsett 100 μL av Luciferase Detection Reagens til hver brønn. La analyseplaten hvile ved RT i 15 min. Ikke rist platen.
- Kvantifisere luminescence ved hjelp av en 96-brønns platelesing luminometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tjueto ekstrakter av frukt og grønnsaker som vanligvis finnes i menneskelige dietter ble screenet for tilstedeværelse av estrogenic forbindelser. En rekke matvarer ble analysert, inkludert belgfrukter, som soyabønner, snøerter og snap erter, da ertfamilien er en kjent kilde til fytoøstrogener16, samt fiken, datoer, mais, gulrøtter, epler, bananer, jordbær, tomat, grønnkål og kål. Endokrine forstyrrende forbindelser finnes i vanlige stoffer (f.eks. plast og plantevernmidler) og noen er biologisk aktive gjennom ERs17. Når det var mulig, ble både organiske og ikke-organisk dyrkede gjenstander analysert for å ta høyde for muligheten for at plantevernmidler med estrogenic aktivitet kunne ha påvirket resultatene.
Hver plantematvare ble belagt i triplikate og armometeret rapporterte hver brønns aktivitet i relative lysenheter (RLUer). Bakgrunnsnivåer av RLUer bestemmes i standardkurven med Standard 8, nullkonsentrasjonen og brukes til referanse. Den brettede aktiveringsverdien, som er multiplikatoren over RLU for Null-punktet på kurven, beregnes av ligningen:
Fold Aktivering = Ukjent (RLU) ÷ Standard 8 (RLU)
For tolkende formål presenteres estrogenic aktivitet på en ordinal, kvalitativ måte høy, med, lav eller ingen aktivitet. Høye aktivitetsnivåer registrere over Standard 4 fold aktiveringsverdien. Medium faller mellom Standard 5 og Standard 4, og Lave verdier er mellom Standard 6 og Standard 5. Eventuelle eksempler med foldaktiveringsverdier under Standard 7 anses som ingen aktivitet. Med henvisning til tabell 1, soyabønner, både organiske og ikke-organiske, screenet på høye aktivitetsnivåer, mens alle andre frukt- og grønnsaksartikler ikke registrerte noen aktivitet. Sammenligning av soyabønneresultater medstandardkurven( figur 1 ), viser at de, enten de dyrkes organisk eller ikke, scorer høyt utenfor kurven for østradiolaktivitetsnivå ved denne konsentrasjonen. Soyabønneekstrakt, en kjent potent kilde til isoflavonene daidzein og genistein9, ble videre brukt til å bestemme fortynningen som gir et 50% signal til maksimum (figur 2). Dette ekstraktet krever 422 ganger mer fortynning for å produsere halvparten av signalet til vår standard fortynningsprotokoll.
| Produsere element | Organisk/ Ikke-organisk | Relative lysenheter (Lum) | Fold aktivering | Fold aktivering (gjennomsnitt) | Fytoøstrogen aktivitet |
| Soyabønner | Organisk | 1687 | 29.016 | 31.06 | Høy |
| 2023 | 34.796 | ||||
| 1706 | 29.353 | ||||
| Soyabønner | Ikke-organisk | 2041 | 35.106 | 32.05 | Høy |
| 1956 | 33.647 | ||||
| 1593 | 27.399 | ||||
| Snø erter | Ikke-organisk | 53 | 0.919 | 0.92 | Ingen aktivitet |
| 59 | 1.015 | ||||
| 49 | 0.836 | ||||
| Snap erter | Ikke-organisk | 66 | 1.142 | 1.21 | Ingen aktivitet |
| 60 | 1.032 | ||||
| 85 | 1.462 | ||||
| Mais | Ikke-organisk | 29 | 0.502 | 0.53 | Ingen aktivitet |
| 30 | 0.513 | ||||
| 33 | 0.575 | ||||
| Jordbær | Ikke-organisk | 35 | 0.609 | 0.77 | Ingen aktivitet |
| 47 | 0.808 | ||||
| 51 | 0.884 | ||||
| Jordbær | Organisk | 56 | 0.956 | 0.88 | Ingen aktivitet |
| 59 | 1.015 | ||||
| 39 | 0.678 | ||||
| Banan | Organisk | 32 | 0.544 | 0.52 | Ingen aktivitet |
| 28 | 0.489 | ||||
| 31 | 0.533 | ||||
| Banan | Ikke-organisk | 33 | 0.564 | 0.60 | Ingen aktivitet |
| 41 | 0.712 | ||||
| 31 | 0.533 | ||||
| Plantain | Ikke-organisk | 37 | 0.64 | 0.70 | Ingen aktivitet |
| 39 | 0.667 | ||||
| 47 | 0.805 | ||||
| Kale | Organisk | 26 | 0.447 | 0.47 | Ingen aktivitet |
| 26 | 0.444 | ||||
| 30 | 0.519 | ||||
| Kale | Ikke-organisk | 40 | 0.685 | 0.63 | Ingen aktivitet |
| 28 | 0.485 | ||||
| 42 | 0.719 | ||||
| Kål | Organisk | 33 | 0.568 | 0.54 | Ingen aktivitet |
| 27 | 0.468 | ||||
| 34 | 0.588 | ||||
| Kål | Ikke-organisk | 44 | 0.757 | 0.66 | Ingen aktivitet |
| 34 | 0.585 | ||||
| 36 | 0.626 | ||||
| Apple | Organisk | 30 | 0.523 | 0.49 | Ingen aktivitet |
| 25 | 0.437 | ||||
| 30 | 0.509 | ||||
| Apple | Ikke-organisk | 41 | 0.705 | 0.62 | Ingen aktivitet |
| 31 | 0.53 | ||||
| 37 | 0.63 | ||||
| Tomat | Organisk | 51 | 0.874 | 0.87 | Ingen aktivitet |
| 57 | 0.974 | ||||
| 44 | 0.76 | ||||
| Tomat | Ikke-organisk | 61 | 1.056 | 1.19 | Ingen aktivitet |
| 81 | 1.386 | ||||
| 66 | 1.128 | ||||
| Gulrot | Organisk | 33 | 0.575 | 0.51 | Ingen aktivitet |
| 33 | 0.561 | ||||
| 22 | 0.382 | ||||
| Gulrot | Ikke-organisk | 31 | 0.53 | 0.52 | Ingen aktivitet |
| 21 | 0.365 | ||||
| 38 | 0.657 | ||||
| Fig | Ikke-organisk | 29 | 0.506 | 0.61 | Ingen aktivitet |
| 42 | 0.716 | ||||
| 36 | 0.619 | ||||
| Datoer | Ikke-organisk | 29 | 0.495 | 0.59 | Ingen aktivitet |
| 39 | 0.667 | ||||
| 35 | 0.602 |
Tabell 1. Representative resultater fra ERβ Reporter Assay System for screening av frukt og grønnsaker elementer for fytoøstrogen aktivitet. Positiv aktivitet indikeres av Høy, Med, Lav eller Ingen aktivitet.
Figur 1. Seriell fortynning av 17β-Østradiol standard (Standard 1 til 8 konsentrasjoner = 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487, og 0 pM, henholdsvis) ved hjelp av ERβ Reporter Assay System. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. ERβ Reporter Assay ved hjelp av en seriell fortynning av soyabønneekstrakt for å bestemme fortynningen som ga et signal-til-bakgrunn-forhold som er 50% av det maksimale signalet. Fra standard ekstraksjonsmetode oppløsning av planteekstraktet i dimetylsulfoksid (DMSO) med en konsentrasjon på 0,1 g ekstrakt til 2 ml DMSO, må soyabønner fortynnes 422 ganger for å fremkalle et signal 50% av maksimal respons. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ERβ reporter analyse utviklet for å individuelt screene farmasøytiske midler er også egnet for screening plantemat for fytoøstrogener biologisk aktive gjennom ERβ. Viktige hensyn i protokollen inkluderer behandling av planteprøvene med forsiktighet: ferskt plantemateriale må tørkes raskt for å forhindre støping eller annen biologisk nedbrytning, og det må holdes borte fra lys for å forhindre fotolyseav forbindelsene 18. Analyseprotokollen12 fra produsenten er klar og trenger svært få modifikasjoner for screeningformål. Standardkurven foreslått av produsenten har blitt endret i denne protokollen for å øke antall punkter som faller i det eksponentielle området av kurven (figur 1), samtidig som topp- og bunnplatåene bevares. Det er mulig å bruke denne analysen til kvantitativ analyse, men vårt formål er å knytte planter med høy aktivitet til biologiske effekter, matvalg og annen atferd hos dyrene som forbruker dem.
For ytterligere å illustrere effektiviteten av ekstraksjon og analyse inkluderte vi en doseresponskurve med soyabønneekstrakt (figur 2) og fastslått at gitt styrken av den normale ekstraksjonsprotokollen, må soya fortynnes mye før signalet faller til 50% maksimum. Dette understreker det faktum at ved høye konsentrasjoner av fytoøstrogener signalplatåene på et stabilt maksimumssignal. Ved svært lave konsentrasjoner kan signalet ikke være sterkt nok til å skilles fra bakgrunnen. Det er viktig å arbeide med høye konsentrasjoner av ekstrakter, for å oppdage fytoøstrogener tilstede i lave mengder i en prøve, minimere falske negativer. I utgangspunktet brukte laboratoriet et større volum DMSO i forhold til planterestene fra metanolekstraksjonen (det vil si 10 ml DMSO til 0,1 g planterester). Prøvene var for fortynnet til å indusere en sterk luminescence i positive prøver. På grunn av en maksimal DMSO-prosentandel for reportercelle levedyktighet og volumbegrensninger i brønnene på platen, bør prøveekstraktkonsentrasjonen optimaliseres når dmso tilsettes DMSO til planterestene. En positiv kontroll som soy bør inkluderes på hver plate, for å bekrefte at cellene er levedyktige og i stand til luminescence, og at ekstraktkonsentrasjonen er tilstrekkelig til å fremkalle et svar.
Denne analysen oppdager forbindelser som binder seg til ERβ, men ikke alle fytoøstrogener har samme virkningsmekanisme. Denne analyseprotokollen kan endres ved å inkubere cellene med en kombinasjon av østradiol og planteforbindelsene for å oppdage om det er antiestrogenaktivitet i en prøve9,12. Østradiol har stor affinitet til ER, så tilstedeværelsen av fytoøstrogener kan ha antiestrogen biologisk aktivitet i nærvær av østradiol ved å blokkere reseptorene, noe som reduserer responsen på østrogener. Antiestrogen aktivitet ville bli påvist ved en reduksjon i total aktivering med økende konsentrasjon av planteekstrakt. Denne analysen vil ikke oppdage andre virkningsmetoder, for eksempel binding til membranbundne ERs19. Videre er noen fytoøstrogener ikke biologisk aktive før de har blitt metabolisert av tarmmikrober20. Det er mulig at noen planter som ikke har noen eller lav estrogenic aktivitet i deres umetaboliserte tilstand har høyere estrogenic aktivitet etter metabolisering som denne analysen ikke ville oppdage.
ERβ reporter analyse har blitt valgt for å eksemplifisere screening av fytoøstrogener for aktivitet i planter fordi fytoøstrogener konkurrere om binding med østradiol sterkere til ERβ enn de gjør til ERα21. Screening for ERα aktivitet er mulig gjennom en lignende analyse, hvor cellene er transfected med ERα genet i stedet for ERβ.
Etter en positiv screening for aktive fytoøstrogener, kan de aktive forbindelsene identifiseres med kromatografimetoder. Faktisk, på det tidspunktet kan de isolerte forbindelsene testes ved hjelp av denne analysen, og de halv maksimale effektive konsentrasjonene (EC50) kan bestemmes ved hjelp av en fortynningsserie som et mål på styrken av forbindelsen.
Denne analysen er en pålitelig og enkel måte å teste for biologisk estrogenic aktivitet, med tanke på sine begrensninger i bredden av mekanismer for estrogenic aktivitet. Den har flere forbedringer over forbigående transfeksjonsanalyser, spesielt brukervennlighet, cellenes stabilitet og følsomheten til analysen.
Lite er kjent om forekomsten av fytoøstrogener i ville plantefôr som forbrukes av mennesker eller ville dyr22, men studier viser at eksponering for østrogene PSM-er i kostholdet kan ha langvarigeeffekter 23. Å ha en enkel robust analyse som oppdager disse forbindelsene, sammen med studier som vurderer mengder spist og når de spises, er et kraftig skritt for å bestemme funksjonen til å inkludere estrogenic matvarer i kostholdet og effekten av disse forbindelsene på fysiologiske systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfattere er takknemlige til Dale Leitman for innledende opplæring i bruk av forbigående transfection analyser for å bestemme estrogenic aktivitet av primat plante mat. Takk til Bradford Westrich og C. Eric Johnson for å ha bidratt til å sette opp laboratorieutstyr og trene studenter i utvinningsmetoder. Til slutt, takk til Indiana University for finansiering av denne forskningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ° water bath | |||
| 37 °, humidified 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analytical balance | |||
| cell culture-rated laminar flow hood | |||
| dimethyl sulfoxide | |||
| disposable media basin, sterile | |||
| drip filtration system | |||
| Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
| HPLC grade methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve |
| lyophilizer | |||
| multi-channel pipette | |||
| orbital shaker | |||
| plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotory evaporator | |||
| round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
| sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
| sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 paper | |||
| whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
References
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
- Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution. International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).
- DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal. Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).
- Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -L. Primate Diet & Nutrition. Lambert, J. E., Rothman, J. M. , University of Chicago Press. (2020).
- Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys. African Journal of Ecology. , (2019).
- Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).
- Tubbs, C. W., et al. Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility. General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).
- Shen, M., et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model. European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).
- Boué, S. M., et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Nishikawa, J. -i, et al. New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).
- Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , Indigo Biosciences. State College, PA. (2020).
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda. American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).
- Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3'-diindolylmethane. Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).
- Whitten, P. L., Patisaul, H. B. Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action. Environmental Health Perspectives. 109, suppl 1 5-20 (2001).
- Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. Advances in Food and Nutrition Research. , Academic Press Inc. (2019).
- Lutz, I., Kloas, W. Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding. Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).
- Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).
- Jeng, Y. -J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells. Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).
- Dixon, R. A. Phytoestrogens. Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).
- Kuiper, G. G. J. M., et al. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β. Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).
- Wasserman, M. D. Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , UC Berkeley. (2011).
- Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure. Reproduction. 143 (3), Cambridge, England. 247-260 (2012).
