Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

تيراهيرتز التصوير وبروتوكول التوصيف لأورام سرطان الثدي المكوس حديثا

Published: April 5, 2020 doi: 10.3791/61007
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Electrical Engineering, University of Arkansas, 2Oklahoma Animal Disease Diagnostic Laboratory, Oklahoma State University
* These authors contributed equally

Summary

تتميز أورام سرطان الثدي البشري المكوس حديثًا بالتحليل الطيفي والتصوير التياهيرتزي بعد بروتوكولات معالجة الأنسجة الطازجة. يؤخذ وضع الأنسجة في الاعتبار لتمكين التوصيف الفعال مع توفير التحليل في الوقت المناسب للتطبيقات المستقبلية داخل العملية.

Abstract

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولًا للتعامل مع أورام الثدي البشرية المكوس حديثًا وتوصيفها وتصويرها باستخدام تقنيات التصوير والتنظير الطيفي النبضية. يتضمن البروتوكول وضع انتقال تيراهيرتز عند الحدوث العادي ووضع انعكاس تيراهيرتز بزاوية مائلة قدرها 30 درجة. تمثل البيانات التجريبية التي تم جمعها نبضات المجال الزمني للحقل الكهربائي. تتم معالجة إشارة الحقل الكهربائي تيراهيرتز المرسلة من خلال نقطة ثابتة على الأنسجة المكوسة ، من خلال نموذج تحليلي ، لاستخراج مؤشر الانكسار ومعامل امتصاص الأنسجة. باستخدام ماسح ضوئي للسيارات السائر، وينعكس نبض تياهيرتز المنبعث من كل بكسل على الورم توفير صورة بلازار من مناطق الأنسجة المختلفة. يمكن تقديم الصورة في مجال الوقت أو التردد. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام البيانات المستخرجة من مؤشر الانكسار ومعامل الامتصاص في كل بكسل لتوفير صورة تاهيرتز توموغرافية للورم. يوضح البروتوكول وجود تمييز واضح بين الأنسجة السرطانية والسليمة. من ناحية أخرى ، لا يمكن أن يؤدي عدم الالتزام بالبروتوكول إلى صور صاخبة أو غير دقيقة بسبب وجود فقاعات هوائية وبقايا سوائل على سطح الورم. يوفر البروتوكول طريقة لتقييم الهوامش الجراحية لأورام الثدي.

Introduction

كان التصوير والتحليل الطيفي تيراهيرتز (THz) مجالًا سريع النمو للبحث في العقد الماضي. أدى التطوير المستمر لباعثات THz الأكثر كفاءة واتساق في نطاق 0.1-4 THz إلى زيادة تطبيقاتها بشكل كبير1. أحد المجالات التي أظهرت فيها THz وعدًا ونموًا كبيرًا هو المجال الطبي الحيوي2. وقد ثبت أن الإشعاع THz غير المؤين وآمن بيولوجيا على مستويات الطاقة المستخدمة عموما لتحليل الأنسجة الثابتة3. ونتيجة لذلك، تم استخدام التصوير THz والتحليل الطيفي لتصنيف وتمييز ميزات الأنسجة المختلفة مثل محتوى المياه للإشارة إلى تلف الحرق والشفاء4، تليف الكبد5، والسرطان في الأنسجة المكوسة6،7. يغطي تقييم السرطان على وجه الخصوص مجموعة واسعة من التطبيقات السريرية والجراحية المحتملة ، وتم التحقيق في سرطانات الدماغ8، الكبد9، المبيضين10، الجهاز الهضمي11، والثدي7،12،13،14،15،16،17،18،19.

تركز تطبيقات THz لسرطان الثدي في المقام الأول على دعم جراحة حفظ الثدي، أو استئصال الورم، من خلال تقييم الهامش. الهدف من استئصال الورم هو إزالة الورم وطبقة صغيرة من الأنسجة السليمة المحيطة ، على النقيض من استئصال الثدي الكامل ، والذي يزيل الثدي بأكمله. ثم يتم تقييم الهامش الجراحي للأنسجة المكوسة عن طريق علم الأمراض بمجرد إصلاح العينة في الفورماتين، مقطعة، مضمنة في البارافين، ومثبتة في 4 ميكرومتر-5 ميكرومتر شرائح على شرائح المجهر. يمكن أن تستغرق هذه العملية وقتًا طويلاً وتتطلب إجراءً جراحيًا ثانويًا في وقت لاحق إذا لوحظ وجود هامش إيجابي20. المبادئ التوجيهية الحالية من قبل الجمعية الأمريكية للأورام الإشعاعية تعريف هذا الهامش الإيجابي وجود الخلايا السرطانية الاتصال على مستوى سطح الحبر هامش21. يقتصر التصوير بتردد عالٍ للأنسجة المرطبة عالية الامتصاص في المقام الأول على التصوير السطحي مع بعض التغلغل المختلف استنادًا إلى نوع الأنسجة ، وهو ما يكفي لتلبية الاحتياجات الجراحية لتقييم الهامش السريع. ومن شأن إجراء تحليل سريع لظروف الهامش أثناء الإعداد الجراحي أن يقلل إلى حد كبير من التكاليف الجراحية ومعدل إجراءات المتابعة. حتى الآن، وقد أثبتت THz فعالة في التمييز بين السرطان والأنسجة السليمة في الأنسجة الرسمية الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) ، ولكن هناك حاجة إلى تحقيق إضافي لتوفير الكشف موثوق بها من السرطان في الأنسجة المكوس حديثا7.

ويفصّل هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لإجراء التصوير بتقنية THz والتنظير الطيفي على عينات الأنسجة البشرية المكوس حديثاً التي تم الحصول عليها من مصرف حيوي. THz التطبيقات المبنية على حديثا استئصال أنسجة سرطان الثدي البشري نادرا ما استخدمت في البحوث المنشورة7,18,22,23, وخاصة من قبل مجموعات بحثية غير متكاملة مع مستشفى. استخدام الأنسجة الطازجة هو أيضا نادرة لتطبيقات السرطان الأخرى, مع معظم الأمثلة سرطان الثدي غير الإنسان التي يتم الإبلاغ عنها لسرطان القولون24,,25. أحد أسباب ذلك هو أن كتل أنسجة FFPE أسهل بكثير للوصول إليها والتعامل معها من الأنسجة المكوسة الطازجة ما لم يكن نظام THz المستخدم للدراسة جزءًا من سير العمل الجراحي. وبالمثل، فإن معظم أنظمة THz المختبرية التجارية غير مستعدة للتعامل مع الأنسجة الطازجة، وتلك التي لا تزال في مراحل استخدام نمو خط الخلية أو أنها بدأت فقط في النظر إلى الأنسجة المكوسة من النماذج الحيوانية. لتطبيق THz على الإعداد داخل العملية يتطلب أن يتم تطوير خطوات التصوير والتوصيف للأنسجة الطازجة مقدما بحيث لا يتداخل التحليل مع القدرة على إجراء علم الأمراض القياسية. بالنسبة للتطبيقات التي لا يقصد بها بطبيعتها أن تكون داخل العملية ، لا يزال توصيف الأنسجة الطازجة خطوة صعبة يجب معالجتها للعمل من أجل تطبيقات الحي والتمايز.

والهدف من هذا العمل هو توفير مبادئ توجيهية لتطبيق THz للأنسجة المكوسة حديثاً باستخدام نظام THz تجاري. تم تطوير البروتوكول على نظام التصوير والتنظير الطيفي THz26 لأورام سرطان الثدي الماتورين13،17،19 وتم توسيعه إلى الأنسجة الجراحية البشرية التي تم الحصول عليها من البنوك الحيوية7،18. في حين تم إنشاء البروتوكول لسرطان الثدي ، يمكن تطبيق نفس المفاهيم على أنظمة التصوير THz المماثلة وأنواع أخرى من سرطانات الأورام الصلبة التي يتم علاجها مع الجراحة حيث يعتمد النجاح على تقييم الهامش27. بسبب كمية صغيرة إلى حد ما من نتائج THz المنشورة على الأنسجة المكوسة حديثا، وهذا هو أول عمل لمعرفة المؤلفين للتركيز على بروتوكول مناولة الأنسجة الطازجة للتصوير THz والتوصيف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول جميع المتطلبات التي حددها قسم الصحة والسلامة البيئية في جامعة أركنساس.

1. إعداد منطقة مناولة الأنسجة

  1. خذ صينية معدنية من الفولاذ المقاوم للصدأ وغطيها بكيس الخطر الحيوي كما هو موضح في الشكل 1. سيتم إجراء أي مناولة الأنسجة البيولوجية داخل منطقة الدرج (أي منطقة مناولة الأنسجة).
  2. إعداد ملاقط المختبر، مناديل الأنسجة، المناشف الورقية، حزمة ورقة تصفية، زجاجات صبغ الأنسجة، زجاجة التبييض، وزجاجة الإيثانول حول صينية لسهولة الوصول إليها عند الحاجة. احتفظ بأي أنسجة مستعملة ومناديل وقفازات على سطح مادة الخطر الحيوي للتخلص منها في نهاية البروتوكول.
  3. املأ أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل بسعة تصل إلى 45 مل من الفورمينين المحايد بنسبة 10% ووضعه في علبة تخزين الطرد المركزي بالقرب من صينية مناولة الأنسجة.

Figure 1
الشكل 1: إعداد منطقة مناولة الأنسجة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. التعامل مع سرطان الثدي الطازج ورم لTHz الطيفي انتقال

تنبيه: قبل التعامل مع أي أنسجة حية، وضعت على قفازات اليد النتريل، نظارات حماية العين، قناع الوجه، ومعطف المختبر. دائما استخدام ملاقط المختبر للتعامل مع الأنسجة وتجنب لمسها مباشرة مع اليدين. يجب إجراء جميع الأعمال مع الأنسجة الطازجة خارج حاوية مختومة أو مرحلة المسح الضوئي في منطقة مناولة الأنسجة المنشأة في الخطوة 1.1.

ملاحظة: تم شحن جميع الأنسجة التي تم التعامل معها في هذا العمل في وسيط جلالنسر المعدلة في دولبيككو (DMEM) وحل المضادات الحيوية من البنك الحيوي.

  1. إزالة الورم السائبة من محلول DMEM ووضعه في طبق بيتري على منطقة مناولة الأنسجة (انظر الشكل 2A).
  2. من التفتيش الإجمالي، حدد مناطق الورم المتميزة التي شريحة قطع صغيرة لتوصيف انتقال العدوى. قطع شريحة سميكة 0.5 مم من الورم من النقاط المحددة باستخدام شفرة الفولاذ المقاوم للصدأ منخفضة المنوال، كما هو مبين في الشكل 2B. ضع هذا القسم المقطع المقطع بين نافذتين كوارتز مع فاصل سمك 0.1 مم في حامل عينة سائلة ، كما هو موضح في الشكل 2C.

Figure 2
الشكل 2: أقسام الورم لقياسات التحليل الطيفي لناقل الحركة THz. (أ)صورة للورم السائب. (ب)صورة فوتوغرافية للأقسام الصغيرة (0.5 مم) من الورم المقطوع من الورم السائب. (ج)مقطع الورم المقطع الموضوع في حامل العينة السائلة بين نافذتي الكوارتز مع فاصل البولي ترافلوروإيثيلين عيار 0.1 مم لقياس الطيف. أعيد نشر الشكل من T. بومان وآخرون18 بإذن من SPIE. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. THz قياسات الطيف الإرسال

  1. تعيين وحدة التحليل الطيفي الإرسال داخل الغرفة الأساسية THz عن طريق محاذاة مقابض وحدة على المشاركات المتصاعدة في النظام الأساسي وانزلاق المرحلة إلى أسفل إلى النظام. تشديد مسامير تصاعد اثنين في الزوايا اليسرى اليمنى العليا والسفلى من وحدة كما هو مبين في الشكل 3A.
  2. تطهير النظام مع غاز النيتروجين الجاف في 5 لتر / دقيقة (LPM) خلال إجراء التحليل الطيفي بأكمله لإزالة بخار الماء من مساحة العينة.
  3. افتح برنامج قياس الطيف الإرسالي THz من سطح المكتب المتصل بنظام THz. ستفتح النافذة الرئيسية
  4. انقر على علامة التبويب المسح الضوئي في الجزء العلوي من النافذة. ستظهر نافذة إعداد مسح الأطياف. من القائمة المنسدلة لعلامة التبويب وضع القياس في أعلى يمين النافذة، حدد الإرسال لإعداد التحليل الطيفي للإرسال. إذا لم تكن الذروة مرئية تلقائيًا، فتحقق من خيار تمكين ضمن علامة التبويب "بحث الذروة اليدوية" وخطوة التأخير البصري يدويًا لعرض الذروة.
  5. بعد 30 دقيقة من التطهير، قم بتسجيل إشارة مرجعية جوية باتباع الخطوات التالية.
    1. ضمن علامة التبويب إعدادات المسح الضوئي في إطار إعداد مسح الأطياف، أدخل اسمًا مناسبًا للملف المرجعي، وحدّد مسح Num إلى 1800، وتعيين تأخير البدء (s)إلى 0. اترك الإعدادات الأخرى كقيم افتراضية لها.
    2. انقر على قياس المرجع في إطار إعداد المسح الضوئي لاتخاذ قياس مرجع الهواء. ثم انقر على قياس عينة لقياس إشارة الإرسال من خلال الهواء كعينة متوسط 1800 إشارة على مدى ~ 1 دقيقة.

Figure 3
الشكل 3: إعداد وحدة التحليل الطيفي لناقل الإرسال THz. (A)THz الغرفة الأساسية مع وحدة الإرسال التي شنت عليها. (ب)صورة لحامل العينة السائلة. (ج)حامل العينة الموضوع داخل الغرفة الأساسية للقياسات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. قياس نافذتي الكوارتز في حامل العينة السائلة كما هو موضح في الشكل 3B.
    1. ضع نافذتي الكوارتز في حامل العينة السائلة دون فاصل بينهما.
    2. افتح الغرفة الأساسية THz. قم بتركيب حامل العينة السائلة على وحدة التحليل الطيفي للإرسال، كما هو موضح في الشكل 3C. أغلق الغرفة
    3. انقر على علامة التبويب المسح الضوئي على النافذة الرئيسية. كرر الخطوات 3.5.1-3.5.2 لعينة الكوارتز، ولكن تحديث تأخير البدء (s)إلى 900. وهذا يسمح الوقت لتطهير أي بخار الماء قبل القياس.
    4. إذا كان الكوارتز مطلوبًا كمرجع لعينات إضافية، فانقر على علامة التبويب مسح المرجع تحت إعدادات المسح الضوئي. هذا يخلي مرجع الهواء. ثم انقر على علامة التبويب قياس مرجع لتسجيل قياسات الكوارتز كمرجع جديد.
  2. ضع قسم الورم المقطّع بين نافذتي الكوارتز داخل حامل العينة السائلة ووضع الحامل داخل الغرفة لقياس انتقال نقطة واحدة للأنسجة. لتسجيل القياس، كرر الخطوة 3.6.3.
  3. أخرج حامل العينة السائلة من الغرفة عند الانتهاء من القياسات وإحضارها إلى المنطقة المخصصة للتعامل مع الأنسجة. تفكيك حامل العينة السائلة، ومسح قسم الورم من نوافذ الكوارتز مع مناديل الأنسجة، ووضع مناديل الأنسجة المستخدمة في نفس الدرج للتخلص في كيس الخطر الحيوي جنبا إلى جنب مع النفايات الأخرى الخطرة بيولوجيا.
  4. كرر الخطوات 2.2 و 3.7 و 3.8 حسب الضرورة لتوصيف شرائح أورام إضافية. عند اكتمال القياسات، انتقل إلى النافذة الرئيسية وانقر على علامة التبويب "ملف" لحفظ بيانات القياس. أغلق نافذة البرنامج.

4. التعامل مع سرطان الثدي الطازج ورم لTHz وضع انعكاس التصوير

  1. قم بإزالة عينة الورم الطازج من محلول DMEM والمضادات الحيوية ووضعها على طبق بيتري. باستخدام الفحص الإجمالي، حدد جانبًا من الورم ليتم صورته بشكل مسطح بما فيه الكفاية ويحتوي على القليل من الدم والأوعية الدموية القليلة. تجنب تصوير الأنسجة بالدم أو الأوعية الدموية إذا كان ذلك ممكناً.
  2. وضع الورم مع الجانب ليتم تصورها على ورقة تصفية الصف 1 لتجفيف DMEM الزائدة ومسح أنسجة السوائل أو إفرازات من الورم، كما هو مبين في الشكل 4A. إعادة وضع الورم على ورقة التصفية إلى بقعة جافة كما تشبع الورق. تجفيف الورم لمدة ~ 5 دقيقة.

Figure 4
الشكل 4: إعداد عينة الورم الطازج للتصوير THz. (أ)ورم وضعت على ورقة مرشح لتجف. (ب)ورم يوضع على لوحة البوليسترين فوق نافذة التصوير مع منصات مسح الأنسجة لامتصاص السوائل الزائدة. (C)الورم ينظر إليه من أسفل لتتبع التوجه والتحقق من فقاعات الهواء. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. إلغاء تحميل وحدة التحليل الطيفي الإرسال وتعيين وحدة تصوير انعكاس (RIM) قاعدة مرآة على النظام الأساسي THz كما هو مبين في الشكل 5A. عند وضع المرايا، قم بتركيب مرحلة المسح الضوئي لـ RIM فوق قاعدة المرآة والمسمار في النظام الأساسي (انظر الشكل 5B).
  2. تطهير النظام مع غاز النيتروجين الجاف في 5 LPM لمدة 30 دقيقة قبل إجراء التصوير لإزالة بخار الماء من مقصورة العينة. بعد 30 دقيقة، تقليل كمية غاز النيتروجين الجاف إلى 3 LPM لبقية الوقت النظام هو في الاستخدام.
  3. ضع لوحة البوليسترين ذات السماكة ~ 1.2 مم على نافذة المسح الضوئي ذات القطر ~ 37 مم. مركز نافذة المسح الضوئي جنبا إلى جنب مع لوحة البوليسترين على مرحلة العينة.

Figure 5
الشكل 5: إعداد النظام لتصوير الانعكاس. (أ)انعكاس نموذج التصوير قاعدة المرآة. (ب)مرحلة المسح الضوئي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملاحظة: سمك أخرى ومواد لوحة مناسبة للخطوة 4.5 ولكن ينبغي أن يكون سمك موحدة وتكون منخفضة بما فيه الكفاية لاستيعاب لا تعوق إشارة THz.

  1. افتح برنامج قياس تصوير انعكاس THz من سطح المكتب المتصل بنظام THz. ستظهر نافذة تظهر العديد من رموز الحوار لوظائف محددة ونافذتين فرعيتين لمؤامرات حقل THz (وحدات عشوائية) مقابل الوقت والتردد، على التوالي.
  2. لتعيين المعلمات لإعداد RIM، انقر على رمز حوار معلمة الصورة في أعلى النافذة. ستظهر نافذة معلمات اكتساب الصور. حدد RIM من القائمة المنسدلة لعلامة التبويب القالب لإعداد تصوير الانعكاس. ضرب موافق والعودة إلى النافذة الرئيسية للبرنامج.
  3. في النافذة الرئيسية، انقر على رمز المسح الضوئي الثابت. وهذا سوف تنشيط هوائيات THz لبدء إرسال إشارة THz الحادث وتلقي إشارة THz المنعكسة من نقطة واحدة على لوحة البوليسترين.
  4. انقر على رمز حوار المرحلة الحركية في الجزء العلوي من النافذة الرئيسية. نافذة التحكم في المحرك ستفتح. ضبط محور التأخير البصري عن طريق النقر على الأسهم الاتجاه إلى الأمام / عكس مركز النبض المنعكس من البوليسترين في النافذة الرئيسية.
    ملاحظة: بعد ضبط محور التأخير البصري ، يجب أن تظهر نبضتان على النافذة ، كما هو موضح في الشكل 6: واحدة من الواجهة السفلية للوحة البوليسترين (الانعكاس الأساسي) ، وواحدة من الواجهة العليا للوحة البوليسترين (انعكاس ثانوي).
  5. نافذة من الانعكاس الأساسي من لوحة البوليسترين والحفاظ على الانعكاس الثانوي في النافذة ، مما سيساهم في الانعكاسات من الأنسجة أثناء إجراء التصوير. ويتم ذلك في خطوتين.
    1. أولاً، انقر على زر إعدادات DAQ في أعلى النافذة الرئيسية لفتح نافذة حوار إعدادات DAQ. تغيير قيمة التأخير البصري من 5 V (افتراضي) إلى 4 V.
    2. ثانياً، قم بضبط الوضع الرأسي لمرحلة المسح الضوئي بمقياس الميكرومتر على مرحلة المسح الضوئي حتى تكون المينيما للنبض الثانوي هي الأقوى. ضبط التأخير البصري للمحور في نافذة التحكم الحركي لوضع الانعكاس الأساسي خارج نطاق الإشارة المنعكسة التي يتم قياسها.
      ملاحظة: بالنسبة للوحة البوليسترين السميكة مقاس 1.2 مم، يتم وضع انعكاس أساسي عندما تكون ذروة الانعكاس الثانوي الدنيا -0.3 مم تقريبًا على محور التأخير البصري لإطار المجال الزمني.

Figure 6
الشكل 6: انعكاسات THz من الواجهات السفلية والعليا لصفيحة البوليسترين. (أ)THz إشارة الحادث إلى وينعكس من لوحة البوليسترين سميكة 1.2 مم. (B)قياس إشارات المجال الزمني THz الأولية والثانوية من البوليسترين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. مستوى مرحلة العينة وتسجيل الإشارة المرجعية.
    1. حدد نقطتين على كل محور (المحور A وB-المحور) التي تشير إلى المواقع على لوحة البوليسترين بالقرب من حافة إطار العينة. على سبيل المثال، بالنسبة للمحور A الذي يتراوح بين -15 مم-15 مم، يمكن أن تكون نقطتا الموضع -10 مم و10 مم. وبالنسبة للمحور B التي تتراوح بين -15 مم-15 ملم، يمكن أن تكون نقطتا الموضع -10 مم و10 مم.
    2. انقر على زر حوار التحكم في المحرك لفتح نافذة التحكم في المحرك. إعادة وضع إطار التحكم في المحرك ونافذة البرنامج الرئيسية بحيث تكون إشارة المجال الزمني مرئية أثناء ضبط مواضع المحرك. تعيين كل من المحور A و المحور B إلى 0 مم.
    3. تسوية المحور A باستخدام الخطوات التالية. يتم استخدام نطاق -10 مم-10 مم كمثال.
    4. في إطار التحكمفي المحرك ، قم بتغيير قيمة المحور A من 0 إلى -10 وضرب أدخل. المرحلة ينتقل إلى موقف -10 مم على المحور A ويلاحظ تحول في موقف الإشارة على النافذة الرئيسية.
    5. استخدم مقياس الميكرومتر القابل للتعديل في مرحلة المسح الضوئي الموضحة في الشكل 5B لنقل الحد الأدنى لذروة الإشارة مرة أخرى إلى الموضع المحدد في الخطوة 4.10.2.
    6. تغيير قيمة المحور A إلى +10 وضرب إدخال. ستتحرك المرحلة الآن من موضع -10 مم إلى موضع +10 مم على المحور A ويلاحظ حدوث تحول في الإشارة مرة أخرى. لاحظ الاتجاه والمسافة التي تحولت الإشارة من موضعها السابق وتغيير قيمة المحور A مرة أخرى إلى -10. ستعود الإشارة إلى الموضع المحدد في الخطوة 4.11.5.
    7. تدوير المسمار التسوية على المحور A من مرحلة المسح الضوئي، كما هو مبين في الشكل 5B وتحويل إشارة لمضاعفة المسافة في نفس الاتجاه الذي انتقلت من الموقف الأصلي. استخدم الميكرومتر على مرحلة المسح الضوئي لتحويل الإشارة مرة أخرى إلى الموضع الأصلي (-0.3 مم لـ 1.2 مم من البوليسترين).
    8. كرر الخطوات 4.11.6-4.11.7 حتى تكون الإشارة عند +10 و-10 متساوية وتركز الذروة لكلا الموضعين في الموضع الأصلي (-0.3 مم على المحور البصري).
  2. بمجرد تحقيق تسوية المحور A، قم بتغيير قيمة المحور A إلى 0 وكرر نفس الإجراء للمحور B. ابدأ بتغيير قيمة المحور B على إطار التحكم الحركي من 0 إلى القيمة الأكثر إيجابية (على سبيل المثال +10 مم). أيضا، أثناء التسوية، استخدم المسمار التسوية على المحور B من مرحلة المسح الضوئي، والذي يظهر في الشكل 5B.
  3. بمجرد تسوية كلا المحورين، أعد كل من المحور A والمحور B إلى 0 مم. أغلق نافذة التحكم في المحرك وتحقق من أن الإشارة في موضعها الأصلي في حالة تحولها قليلاً.
  4. سجل هذه الإشارة كمرجع.
    1. انتقل إلى إطار خصائص DAQ المحدد. تغيير قيمة المتوسط إلى 5 والاحتفاظ بكافة المعلمات الأخرى كافتراضي.
    2. انقر على المرجع الجديد. سيتم حساب عداد المتوسط في أعلى يمين النافذة من 0-20. بمجرد أن يصل العداد إلى 20 ، قم بتغيير قيمة المتوسط إلى 1 وانقر فوق موافق. سيتم حفظ الإشارة المنعكسة من البوليسترين كمرجع لأي فحوصات يتم التقاطها لاحقًا.
      ملاحظة: إذا كان فقط إجراء التصوير THz يجب أن يتم تنفيذها، فمن الأفضل لتنفيذ الخطوات 4.3-4.14 قبل إخراج أنسجة الورم من محلول DMEM.
  5. قم بتركيب الورم على لوحة البوليسترين التي تغطي نافذة مرحلة المسح الضوئي.
    1. قم بإزالة نافذة التصوير من مرحلة المسح الضوئي وأحضرها إلى منطقة مناولة الأنسجة. ضع الورم على لوحة البوليسترين، كما هو موضح في الشكل 4B.
    2. تأكد من عدم وجود فقاعات هوائية كبيرة بين اللوحة والورم. إذا لوحظت فقاعات الهواء، اضغط على الورم مع ملاقط أو رفع الورم ولفة بلطف على البوليسترين حتى يتم تقليل فجوات الهواء.
    3. وضع الفواصل الاستيعابية على فترات منتظمة حول عينة الاختبار كما هو موضح في الشكل 4B. ضع لوحة البوليسترين الأخرى فوق الورم واضغط بلطف من أجل جعل سطح الورم مسطحًا قدر الإمكان. الشريط أسفل هذا ترتيب البوليسترين ورم البوليسترين على نافذة العينة.
  6. قم بقلب نافذة العينة كما هو موضح في الشكل 4C، وخذ صورًا للورم للحفاظ على سجل لاتجاهه. أعد نافذة العينة مع الورم إلى مرحلة المسح الضوئي.
  7. انقر على زر حوار معلمة الصورة لفتح نافذة معلمات اكتساب الصور. تعيين قيم Axis1minو Axis1maxو Axis2minو Axis2max لأرفق بشكل كامل موضع الورم في نافذة التصوير
    ملاحظة: بشكل افتراضي، Axis1 هو المحور A وAxis2 هو المحور B.
  8. تعيين Axis1step وAxis2step إلى 0.2 ملم لمسح التصوير.
    ملاحظة: تعيين Axis1step و Axis2step سيتم تعيين حجم خطوة السائر المحركات 'إلى زيادات 200 ميكرون أثناء عملية المسح الضوئي. يمكن تقدير إجمالي وقت الفحص في إطار معلمات اكتساب الصور.
  9. انقر على علامة التبويب قياس على النافذة الرئيسية وحدد خيار المسح الضوئي 2D Flyback. في الإطار الذي ينبثق، قم بالإشارة إلى اسم الدليل والملف الذي يتم ضمنهما حفظ بيانات الفحص.

5. بعد المعالجة الأنسجة الطازجة استعدادا لإجراء علم الأمراض النسيجية

  1. عند الانتهاء من عملية المسح الضوئي، قم بإزالة نافذة العينة، وألواح البوليسترين، وعينة من نظام THz الأساسي ونقلها إلى المنطقة المخصصة للنفايات الخطرة. إزالة الورم من لوحة البوليسترين ووضعه على قطعة مسطحة من الورق المقوى من حجم مماثل لتلك التي من الورم. تأكد من أن اتجاه الورم هو نفسه كما كان على البوليسترين ، مع لمس وجه التصوير للورق المقوى.
  2. تراجع مسحة القطن في صبغة الأنسجة الحمراء ووصمة عار على الجانب الأيسر من الورم وصولا الى حيث حافة الورم يتصل الورق المقوى. وبالمثل، وصمة عار على الجانب الأيمن من الورم مع صبغة الأنسجة الزرقاء. قم بتلطيخ السطح المكشوف للورم بخط من صبغة الأنسجة الصفراء التي تربط البقعة الحمراء بالبقعة الزرقاء للدلالة على الجزء الخلفي من العينة ، كما هو موضح في الشكل 7A.
    ملاحظة: لمنع الحبر من تلطيخ محلول formalin، قم بتطبيق طبقة رقيقة فقط على الأنسجة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق مسحة القطن على سطح مختلف قبل تلطيخ الأنسجة أو استخدام مسحة القطن نظيفة لمسح أي صبغة الزائدة. تجنب السماح للصبغة الاتصال الجلد أو الملابس. تتم عملية تلطيخ الورم هذه كمرجع لتوفير معلومات حول جانب التصوير الخاص بالورم واتجاهه إلى أخصائي علم الأمراض.

Figure 7
الشكل 7: آخر معالجة على الورم بعد التصوير THz. (أ)وضع الورم وجهه لأسفل على حامل الورق المقوى ومصبوغ مع صبغة وسم الأنسجة. (ب)تصفية الورق الموضوع ة فوق الورم ومسجلة للحفاظ على الاتصال. (C)ورم ملطخ ة ثابتة على الورق المقوى مغمورة في 10٪ حل رسمي مؤقت محايد ومختومة مع parafilm. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. دع الحبر يجف لمدة 3-4 دقيقة تقريبًا. اقطع قطعة من ورق التصفية بنفس الأبعاد التقريبية مثل الورق المقوى. وضعه على الورم والتفاف قطعة من الشريط تماما حول ورقة التصفية والورق المقوى كما هو مبين في الشكل 7B. يجب أن الشريط وورقة التصفية تأمين الورم ضد الورق المقوى دون تطبيق أي ضغط كبير.
  2. تزج الأنسجة الملونة الملصقة على الورق المقوى في 10٪ حل رسمي محايد وختم أنبوب الطرد المركزي باستخدام فيلم البارافين، كما هو مبين في الشكل 7C. قم بتعيين رقم العينة والتاريخ ونوع الأنسجة ورقم الورم للعينة الموجودة على ملصق الأنبوب. إرسال الورم إلى أخصائي علم الأمراض لمزيد من المعالجة علم الأنسجة.

6 - التخلص من النفايات الخطرة

  1. جمع جميع النفايات من علبة مناولة الأنسجة جنبا إلى جنب مع كيس المخاطر البيولوجية المستخدمة لتغطية الدرج ووضعها في كيس جديد من المخاطر البيولوجية، كما هو مبين في الشكل 8. إحضار الحقيبة إلى منطقة النفايات المحددة الخطورة بيولوجياً في المبنى وتحديد موعد مع قسم الصحة والسلامة البيئية (EH&S) لالتقاط النفايات. تنظيف علبة مناولة الأنسجة والمنطقة المحيطة بها على الطاولة مع محلول التبييض 10٪ والإيثانول.

Figure 8
الشكل 8: صورة لحقيبة النفايات الخطيرة بيولوجيا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. خذ حامل العينة السائلة مع الفواصل ونوافذ الكوارتز ، ونافذة أخذ العينات التي تم تركيب الورم عليها ، ولوحات البوليسترين ، وملاقط المختبر إلى منطقة الغسيل. شطف جميع المواد بالماء ومن ثم 10٪ محلول التبييض، والمسح بالمناشف الورقية حسب الضرورة لإزالة حطام الأنسجة. شطف مرة أخرى بالماء، فرك مع محلول ألكونوكس، وشطف جيدا. للزجاج والبلاستيك، شطف في الكحول ايزوبروبيل 70٪ وتوضع جانبا لتجف.
    ملاحظة: بمجرد أن يكون الورم في formalin وتكون مساحة العينة نظيفة ، يمكن معالجة البيانات في نفس الوقت الذي يتم فيه التصوير أو في وقت لاحق.

7. معالجة البيانات لبناء صور THz

  1. تصدير ملفات بيانات .tvl المحفوظة من نظام THz. تتم كتابة ملفات البيانات الخام التي تم الحصول عليها من النظام في بيثون وأفضل قراءة في بيثون قبل الحفظ كملفات بيانات MATLAB.
  2. لبناء صورة THz للأنسجة الطازجة الممسوحة ضوئياً، قم بتحويل بيانات تصوير انعكاس المجال الزمني الخام إلى مجال التردد باستخدام تحويل فورييه على البعد الثالث لمصفوفة البيانات الخام (أي البعد الزمني). أيضا اتخاذ تحويل فورييه من البيانات المرجعية.
    ملاحظة: وينبغي أن يوفر طيف نطاق التردد النموذجي بيانات تتراوح بين 0.1 THz-4 THz.
  3. تطبيع بيانات العينة مع البيانات المرجعية وتنفيذ أطياف الطاقة على أساس تكامل البيانات العادية على نطاق التردد من f1 = 0.5 THz إلى f2 = 1.0 THz باستخدام المعادلة التالية19:
    Equation 1
    ملاحظة: هنا E عينة هو ضوء التردد انعكاس البيانات تصوير عينة الأنسجة وE مرجع هو مجال التردد من بيانات انعكاس نقطة واحدة من الإشارة المرجعية.
  4. قم بإنشاء الصورة ثنائية الأبعاد عن طريق رسم بيانات أطياف الطاقة المحسوبة عند كل نقطة في المصفوفة التي تم تعريفها بواسطة المحور A وB-axis. هذا ما يعرف باسم صورة المواصفات THz الأطياف الطاقة.
    ملاحظة: طريقة الحصول على صورة THz توموغرافية بدلاً من ذلك مفصلة في الخطوات 7.5-7.7.
  5. للتوصيف، احسب الانعكاس النظري المعتمد على التردد لمجموعة من خصائص الأنسجة المحتملة باستخدام المعادلةالتالية 18:
    Equation 2
    ملاحظة: هنا هو معامل انعكاس Fresnel المعقد بين المنطقة i وregion j; dj هو سمك المنطقة j؛ وοj هي زاوية الانتشار في المنطقة j المتعلقة بزاوية الإصابة بقانون Snell. Equation 3 هو معامل الانتشار المعقد في المنطقة j، حيث يكون الترددات الزاوي ، ج هي سرعة الضوء في الفراغ ، nj هو الجزء الحقيقي من مؤشر الانكسار ، وα ABS ،j هو معامل الامتصاص18. المنطقة 1 هي الهواء، المنطقة 2 هي لوحة البوليسترين، والمنطقة 3 هي الأنسجة.
  6. احسب الانعكاس في المعادلة (2) لمجموعة من الفهارس الانكسارية المعرفة من قبل المستخدم ومعاملات الامتصاص للمنطقة 3(n3 و αABS,3)وقارنها مع الإشارة المقاسة في كل نقطة لحساب الخطأ التربيعي المتوسط المجمع للحجم والمرحلة.
    ملاحظة: الحل للفهرس الانكساري معامل الامتصاص هو زوج القيم التي تعطي أدنى خطأ.
  7. بناء صورة THz توموغرافي من مؤشر الانكسار المستخرج وبيانات معامل الامتصاص(ن3 وαالقيمة المطلقة،3)في كل بكسل. تحليل مناطق الورم من خلال المقارنة مع صورة الشريحة المرضية التي تم الحصول عليها من الطبيب الشرعي. وترد النتائج التمثيلية في الشكل 9،مع أمثلة على عدم كفاية الالتزام بالبروتوكول في الشكل 10 والشكل 11.

8. استخراج الخصائص الكهربائية للأنسجة باستخدام بيانات التحليل الطيفي الإرسال

  1. على النافذة الرئيسية لبرنامج قياس الطيف الإرسال THz، انتقل إلى علامة التبويب الملفات وانقر على خيار التصدير. سيتم إنشاء نافذة لتحديد نوع البيانات والنموذج للتصدير. اختر أنواع بيانات مرحلة الإرسال والإرسال لقياسات عينات الكوارتز والأنسجة.
  2. حساب الإرسال النظري المعتمد على التردد لمجموعة من خصائص الأنسجة المحتملة باستخدام المعادلة التالية15:
    Equation 4
    ملاحظة: هنا Icon 3 هو النسبة بين معاملات انتقال Fresnel للعينة والاجهزة المرجعية; 11 و 3 هي ثوابت الانتشار المعقدة للهواء والأنسجة، على التوالي؛ وd هو سمك الأنسجة. يتم تعريف ثابت الانتشار بشكل Equation 5 عام على أنه . ñ هو مؤشر الانكسار المعقد الذي Equation 6 يعرف بأنه ، حيث n هو الجزء الحقيقي من مؤشر الانكسار ؛ ج هو سرعة الضوء؛ هو التردد الزاوي؛ وα القيمة المطلقة هو معامل الامتصاص15.
  3. حساب متوسط الخطأ التربيعي المشترك بين حجم ومرحلة الإرسال في المعادلة (3) وبيانات القياس من النظام لمجموعة من قيم n و αالقيمة المطلقة المعرفة من قبل المستخدم.
    ملاحظة: الحل للفهرس الانكساري معامل الامتصاص هو زوج القيم التي تعطي أدنى خطأ.
  4. رسم مؤشر الانكسار المستخرج وبيانات معامل الامتصاص مقابل نطاق التردد من 0.15-3.5 THz. تظهر النتائج التمثيلية في الشكل 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم عرض نتائج التصوير THz18 التي تم الحصول عليها بعد البروتوكول المذكور أعلاه من عينة ورم سرطان الثدي البشري #ND14139 وردت من البنك الحيوي في الشكل 9. وفقا لتقرير علم الأمراض، كان الورم #ND14139 هو درجة I/II تسلل سرطان القناة (IDC) التي تم الحصول عليها من امرأة تبلغ من العمر 49 عاما عن طريق عملية جراحية استئصال الورم في الثدي الأيسر. تظهر صورة الورم في الشكل 9A، تظهر صورة علم الأمراض في الشكل 9B، وتظهر صورة أطياف الطاقة THz التي تم الحصول عليها باستخدام المعادلة (1) في البروتوكول في الشكل 9C. تم تقييم صورة علم الأمراض من قبل أخصائي علم الأمراض الاستشاري لدينا في جامعة ولاية أوكلاهوما. عند ربط صورة THz مع صورة علم الأمراض ، كان من الواضح أن منطقة السرطان (أي منطقة اللون الأحمر في الشكل 9C)أظهرت انعكاسًا أعلى من منطقة الدهون (أي منطقة اللون الأزرق في الشكل 9C). كانت الدائرة الزرقاء القريبة من مركز منطقة السرطان في الشكل 9C بسبب وجود فقاعة هوائية تحت الورم أثناء عملية التصوير.

كما يتم عرض الصور التوموغرافية على أساس الخصائص الكهربائية للورم التي تم الحصول عليها باستخدام النموذج المذكور أعلاه لكل بكسل (2477 بكسل في المجموع). تظهر الصور التوموغرافية المستندة إلى معامل الامتصاص (سم-1)البيانات (α-images) ومؤشر الانكسار(n-صورة) بيانات الورم التي تم الحصول عليها بتردد 0.5 THz و 1.0 THz في الشكل 9D و 9Eو 9F و 9G، على التوالي. مع زيادة التردد، زادت قيم معامل الامتصاص المحسوب(سم-1)للسرطان وبكسل الدهون، مع ظهور قيم أعلى من قيم السرطان على كلا الترددين. وعلى النقيض من ذلك، انخفض مؤشر الانكسار لكلا الأنسجة مع زيادة التردد. وتجدر الإشارة إلى أن المرحلة المقاسة أصبحت خاضعة لاختلافات مقياس ميكرومتر في تسوية مرحلة التصوير، وسماكة لوحة البوليسترين، وتوتر المحرك السائر مع زيادة التردد. فعلى سبيل المثال، كانت الخطوط الأفقية التي لوحظت في الشكل 9E و9G ترجع إلى التحول في المرحلة الصغيرة الذي أدخلته محركات السائر أثناء عملية المسح الضوئي، والذي لم يُلاحظ بترددات أقل.

Figure 9
الشكل 9: تحليل ورم سرطان الثدي #ND14139 باستخدام تقنية التصوير THz. (أ)صورة للورم. (ب)انخفاض صورة أمراض الطاقة للورم. (C)THz صورة أطياف الطاقة على نطاق التردد 0.5 THz-1.0 THz.(D)THz صورة معامل امتصاص التصوير الموجات تم الحصول عليها في 0.5 THz. تم إنشاء هذه الصورة باستخدام بيانات معامل الامتصاص المستخرج في كل بكسل من بيانات تصوير الانعكاس الخام للورم. (E)صورة معامل الامتصاص التي تم الحصول عليها بسرعة 1.0 هرتز.(F)صورة مؤشر الانكسار(n- image) التي تم الحصول عليها بسرعة 0.5 ميغاهرتز. تم إنشاء هذه الصورة باستخدام بيانات فهرس الانكسار المستخرج في كل بكسل من بيانات تصوير الانعكاس الخام للورم. (G)صورة مؤشر الانكسار(ن- صورة) التي تم الحصول عليها في 1.0 THz. الرقم إعادة نشر من T. بومان وآخرون18 بإذن من SPIE. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وقد تم الحصول على نتائج THz التي نوقشت في الشكل 9 بنجاح باتباع البروتوكول الموصوف. يمكن أن يؤدي عدم كفاية التعامل مع الأنسجة إلى نتائج تصوير مضللة. على سبيل المثال، ينتج التصوير THz في الشكل 10 لورم سرطان الثدي البشري #ND10405 تظهر آثار التجفيف غير الكافي. سيطر محلول DMEM الزائد في الأنسجة على صورة أطياف الطاقة THz للورم في الشكل 10B28 مع انعكاس عال ٍ لم يرتبط بصورة علم الأمراض الموضحة في الشكل 10A28. وأدى ذلك إلى نتيجة إيجابية كاذبة، مما يشير إلى وجود أكبر من السرطان في الورم. DMEM أظهرت مؤشر الانكسار عالية مماثلة ومعامل امتصاص للمياه، كما رأينا في الشكل 10C19 و 10D19،لذلك فمن المستحسن بشدة لتجفيف الورم بشكل صحيح قبل التصوير.

Figure 10
الشكل 10: التأثير على تصوير الورم المأخوذ من محلول DMEM دون تجفيف باستخدام ورق التصفية. (أ)انخفاض صورة أمراض الطاقة للورم #ND10405. (B)THz صورة أطياف الطاقة من الورم #ND10405 على نطاق التردد 0.5 THz-1.0 THz.(C)مؤامرة مؤشر الانكسار انتقال لDMEM، PBS، والمياه التي تتراوح بين 0.15 THz-3.5 THz. (D)معامل امتصاص انتقال (سم-1)مؤامرة لDMEM، PBS، والمياه التي تتراوح بين 0.15 THz-3.5 THz. الشكل 10A، 10B يتم إعادة نشرها من T. بومان وآخرين28 بإذن من IEEE والشكل 10C، يتم إعادة نشر الشكل 10D من N. Vohra وآخرون19 بإذن من IOP النشر، المحدودة انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويظهر مثال آخر على عدم كفاية الالتزام بالبروتوكول #ND11713 الورم في الشكل 11. في هذه الحالة ، لم تتم إزالة فقاعات الهواء بين لوحة البوليسترين والورم عندما تم وضع الورم على اللوحة لإجراء التصوير. أدى ذلك إلى عدة بقع من انعكاس منخفض عبر صورة THz في الشكل 11B، مما حال دون مقارنة دقيقة بعلم الأمراض في الشكل 11A. وهكذا ، إذا لوحظت أي فقاعات الهواء بعد وضع الورم على لوحة ، اضغط عليه مع ملاقط أو رفع الورم ولفة بلطف على البوليسترين حتى يتم إزالة الفجوات في الهواء.

Figure 11
الشكل 11: القطع الأثرية في صورة THz الناجمة عن وجود فقاعات الهواء بين لوحة البوليسترين والورم. (أ)انخفاض صورة أمراض الطاقة من الورم #ND11713. (B)THz صورة أطياف الطاقة من الورم #ND11713 على نطاق التردد من 0.5-1.0 THz. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وترد نتائج التحليل الطيفي للإرسال18 لنفس العينة (# ND14139) في الشكل 12. تم أخذ أقسام الورم Icon 1 Icon 1 من النقاط وفي الشكل 12A وتم وصفها بعد البروتوكول. وقد اتخذت كل من النقاط المختارة من منطقة أنسجة السرطان في الورم وفقا لصورة علم الأمراض في الشكل 12B. يتم تقديم معامل الامتصاص المستخرج ومؤشر الانكسار لكلا أقسام الورم في الشكل 12C, D. وأظهرت كلتا النقطتين اتفاقا جيدا لنطاق التردد بأكمله. يمثل المنحنى الأسود من 0.15-2 THz في الشكل 12C والشكل 12D البيانات التي تم الحصول عليها من الأدب23 لمقارنة النتائج التي تم الحصول عليها في عملنا.

Figure 12
الشكل 12: توصيف ورم سرطان الثدي #ND14139 باستخدام التحليل الطيفي لناقل الحركة THz. (أ)صورة الورم مع نقطتين مختارتين Icon 1 Icon 1 ملحوظة ومن حيث تم قطع أقسام 0.5 مم سميكة من الورم لقياسات الطيف انتقال. (ب)انخفاض صورة أمراض الطاقة للورم. (C)معامل امتصاص الإرسال (سم-1)مؤامرة تتراوح بين 0.15-3.5 THz عند النقاط Icon 1 و Icon 1 . (D)مؤامرة مؤشر الانكسار الإرسال تتراوح بين 0.15-3.5 Icon 1 THz عند نقاط و Icon 1 . أعيد نشر الشكل من T. بومان وآخرون18 بإذن من SPIE. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويعتمد التصوير الفعال للأنسجة الطازجة في الأنسجة الطازجة في المقام الأول على جانبين حاسمين هما: 1) النظر السليم في مناولة الأنسجة (القسمان 2 و4.15)؛ (2) النظر السليم في مناولة الأنسجة (القسمان 2 و4.15)؛ (2) النظر السليم في مناولة الأنسجة (القسمان 2 و4.15)؛ (2) النظر السليم في مناولة الأنسجة (القسمان 2 و4.15)؛ (2) النظر السليم في و 2) إعداد المرحلة (القسم 4.11 في المقام الأول). يمكن أن يؤدي التجفيف غير الكافي للأنسجة إلى زيادة الانعكاس وعدم القدرة على تصور المناطق بسبب الانعكاسات العالية لـ DMEM والسوائل الأخرى. وفي الوقت نفسه، يؤدي ضعف اتصال الأنسجة مع نافذة التصوير إلى إنشاء حلقات أو بقع من انعكاس منخفض في صورة انعكاس THz التي تحجب النتائج. وينبغي بذل جهود إضافية لضمان اتصال جيد للأنسجة مع نافذة التصوير، بما في ذلك إعادة وضع الأنسجة للحصول على واجهة أفضل. بالنسبة لتوصيف الأنسجة، يجب تنفيذ اعتبارات إضافية لإعداد المرحلة بعناية. التوازن غير السليم للمرحلة من قبل حتى عدد قليل من ميكرون يمكن أن يسبب تحولات كبيرة في مؤشر الانكسار المحسوب ومعامل امتصاص الأنسجة. هذا يمكن أيضا أن يكون نتيجة لتطبيق الكثير من الضغط على الأنسجة عند تركيبها على نافذة التصوير، والتي يمكن أن تسبب الانحناء من لوحة البوليسترين. ولإجراء حسابات دقيقة، يجب أيضا الحصول على الإشارة المرجعية المختارة للتوصيف من نفس مستوى المرحلة من الصورة لتجنب التحول الاصطناعي في المرحلة.

المنطقة الرئيسية التي يمكن فيها تعديل البروتوكول هي في المواد العازلة المستخدمة لتركيب الأنسجة، مثل الكوارتز (الأقسام 3.6-3.7) والبوليسترين (بدءًا من القسم 4.5). طالما أن مواد النافذة المختارة سميكة بشكل موحد ومنخفضة الامتصاص بما يكفي للتفاعل إشارة جيدة مع الورم، يمكن استبدال مواد أخرى. وينبغي تقييم المواد في وقت متقدم لتحديد ما إذا كانت توفر مستوى مرحلة كافية. بدلاً من ذلك، بالنسبة للأنظمة التي سيتم فيها إصلاح نافذة التصوير، يمكن معالجة سمك نافذة غير موحد من خلال توصيف تحول المرحلة المحسوب من مسح نافذة فارغة. هناك أيضا بعض المجال للتعديل في كيفية تركيب الأنسجة للشحن إلى الطبيب الشرعي. في حين يتم استخدام الأصباغ وسم الأنسجة هنا من الاتفاقية ، فإن الجانب المهم هو أن يكون هناك طريقة في المكان الذي يتيح المقارنة بين التصوير THz وعلم الأمراض. تتضمن المخاوف الرئيسية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للبروتوكول الحصول على إشارة THz جيدة وإنشاء نافذة مناسبة ، والتي ستعتمد على النظام المحدد المستخدم.

القيد الأساسي لأي تقنية من اول معالجة الأنسجة الطازجة هو الوقت الذي يتعرض فيه الأنسجة للهواء. تم تصميم هذا البروتوكول بحيث يمكن أن تظل الأنسجة مكشوفة لمدة لا تزيد عن 1 ساعة لتجنب التحلل قبل تقييم علم الأمراض. وينعكس هذا أيضا في اختيار حجم الخطوة من الصورة. ويمكن لنظام THz في هذا البروتوكول أن يصل إلى أي حجم خطوة من 50-500 ميكرومتر في زيادات 50 ميكرومتر، على الرغم من أن الحد الأقصى للاستبانة المكانية للنظام هو حوالي 80 ميكرومتر بسبب المحتوى الطيفي لإشارة THz. قدمت خطوة 200 ميكرون في البروتوكول تفاصيل كافية مع الحفاظ على وقت مسح معقول يبلغ حوالي 30 دقيقة. تقييم عينات الورم من قبل أخصائي علم الأمراض الاستشاري لدينا قرر أن هذه الكمية من التعرض للهواء لا تسبب تلفًا للأنسجة بطريقة يمكن ملاحظتها على المستوى الخلوي. ومع ذلك، يمكن استخدام مواد مثل الجيلاتين لتوفير تصوير THz واضح دون تجفيف مفرط، ويمكن التحقيق في التحديثات المستقبلية للبروتوكول29. للاستخدام الفعال للوقت، يمكن إجراء خطوات مثل تطهير النظام بالنيتروجين الجاف وإعداد التصوير أو التحليل الطيفي قبل إزالة الأنسجة من DMEM. وهذا مهم أيضاً للتطبيقات المستقبلية أثناء العمليات الجراحية حيث الوقت الذي استغرقه التصوير هو عامل رئيسي في تنفيذ التصوير THz في سير العمل الجراحي.

استخدام هذا البروتوكول داخل العمليات يمثل انخفاض كبير محتمل في الوقت لتقييم الهوامش الجراحية للورم من عدة أيام أو أسابيع إلى بضع دقائق. وسيتم تحقيق ذلك عندما يتم تحسين أجهزة نظام THz لاستخدام كاميرات THz بدلاً من الماسحات الضوئية الحركية السائر ة في المستقبل. في الوقت الحاضر الطريقة الأكثر مماثلة المستخدمة داخل العملية هو التصوير الشعاعي العينة، الذي يأخذ صور الأشعة السينية انتقال الأورام المكوس للتفسير من قبل أخصائي الأشعة لتحديد ما إذا كان هناك سرطان على سطح الأنسجة. يوفر بروتوكول التصوير الموصوف وسيلة للتصوير المباشر لسطح الأنسجة. ويمكن أيضا أن تستخدم بروتوكول لأورام سرطان الثدي المكوس حديثا لتوصيف وتصوير أي نوع آخر من الورم الصلب المكوس حديثا8,9,10,11. في حين أن هذه المخطوطة تركز على التصوير أورام الثدي المكوس حديثا بعد البروتوكول الموصوف، THz التصوير من البارافين المرتبطة ثابتة البارافين كتل الأنسجة جزءا لا يتجزأ كما تم التحقق بنجاح مع علم الأمراض14،15،16،17،19. يمكن تطوير بروتوكولات التصوير المشابهة لتلك المقترحة هنا لدعم علم الأمراض في تحليل الأنسجة المضمنة أيضًا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل جائزة المعاهد الوطنية للصحة (NIH) # R15CA208798 وجزئيا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) جائزة # 1408007. تم الحصول على تمويل لنظام THz النابض من خلال جائزة NSF/MRI # 1228958. نحن نعترف باستخدام الأنسجة التي تم شراؤها من قبل التبادل الوطني لبحوث الأمراض (NDRI) بدعم من منحة المعاهد القومية للصحة U42OD11158. كما نعترف بالتعاون مع مختبر أوكلاهوما لتشخيص الأمراض الحيوانية في جامعة ولاية أوكلاهوما لإجراء إجراء علم الأمراض الأنسجة على جميع الأنسجة التي تم التعامل معها في هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% isopropyl alcohol VWR 89108-162 Contains 70% USP grade isopropanol and 30% USP grade deionized water
Alconox powder detergent VWR 21835-032 Concentrated detergent to remove organic contaminants from glass, metal, stainless steel, porcelain, ceramic, plastic, rubber, and fiberglass
Bio Hazard Bags Fisher Scientific 19-033-712 Justrite FM-Approved Biohazard Waste Container Replacement Bags
Cardboard holder N/A N/A Scrap cardboard to keep tissue imaging face intact when immersed in formalin
Centrifuge Tubes VWR 10026-078 Centrifuge Tubes with Flat Caps, Conical-Bottom, Polypropylene, Sterile, Standard Line
Cotton Swabs Walmart 551398298 Q-tips Original Cotton Swabs used to dye the tissue
Ethyl Alcohol VWR 71002-426 KOPTECH Pure (undenatured) anhydrous (200 proof/100%) ethyl alcohol
Eye protection goggles VWR 89130-918 Kimberly-clark professional safety glasses
Face Mask VWR 95041-774 DUKAL Corporation surgical masks
Filter paper Sigma Aldrich Z240087 Whatman grade 1 cellulose filters
Formalin solution Sigma Aldrich HT501128-4L 10% neutral buffered formalin
Human freshly excised tumors (Infilterating Ductal Carcinoma (IDC)) National Disease Research Interchange (NDRI biobank N/A A protocol is signed with the NDRI for the type of tumors required
IRADECON Bleach solution VWR 89234-816 Pre-diluted Sodium Hypochlorite Bleach solution
KIMTECH SCIENCE wipes VWR 21905-026 Kimberly-clark professional Kim wipes
Laboratory Coat VWR 10141-342 This catalog number is for medium size coat
Laboratory tweezers/Forceps VWR 82027-388 Any laboratory tweezers can be used as long as it does not damage the tissue
Liquid sample holder (two quartz windows with a 0.1 mm teflon spacer) TeraView, Ltd N/A 1" diameter, and 0.1452" thick quartz windows
Nitrile hand gloves VWR 82026-426 This catalog number is for medium size gloves
Nitrogen cylinder Airgas NI UHP300 NITROGEN UHP GR 5.0 SIZE 300
Paper towel VWR 14222-321 11" x 8.78" Sheets, 1 Ply
Parafilm VWR 52858-076 Flexible thermoplastic. Rolled, waterproof sheet interwound with paper to prevent self-adhesion.
Petri Dish VWR 470210-568 VWR Petri Dish, Slippable, Mono Plate (undivided bottom)
Polystyrene Plate Home Depot 1S11143A ~ 10 cm x 10 cm square piece cut from a 11" x 14" x 0.05" Non-glare styrene sheet
ScanAcquire Software TeraView, Ltd N/A System Software for THz reflection imaging measurements
Stainless steel low-profile blade (#4689) VWR 25608-964 Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades
Stainless steel metal tray Quick Medical 10F Polar Ware Stainless Steel Medical Instrument Trays
Tissue Marking Dyes Ted Pella, Inc Yellow Dye #27213-1
Red Dye #27213-2
Blue Dye #27213-4		 Used to orient excised tissue samples
sent to the histopathology laboratory
TPS Spectra 3000 TeraView, Ltd N/A THz imaging and spectroscopy system
TPS Spectra Software TeraView, Ltd N/A System Software for THz transmission spectroscopy measurements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burford, N. M., El-Shenawee, M. O. Review of terahertz photoconductive antenna technology. Optical Engineering. 56 (1), 010901 (2017).
  2. Sun, Q., et al. Recent advances in terahertz technology for biomedical applications. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 7 (3), 345-355 (2017).
  3. Wilmink, G. J., et al. In vitro investigation of the biological effects associated with human dermal fibroblasts exposed to 2.52 THz radiation. Lasers in Surgery and Medicine. 43 (2), 152-163 (2011).
  4. Arbab, M. H., et al. Terahertz spectroscopy for the assessment of burn injuries in vivo. Journal of Biomedical Optics. 18 (7), 077004 (2013).
  5. Sy, S., et al. Terahertz spectroscopy of liver cirrhosis: investigating the origin of contrast. Physics in Medicine and Biology. 55 (24), 7587-7596 (2010).
  6. Yu, C., Fan, S., Sun, Y., Pickwell-Macpherson, E. The potential of terahertz imaging for cancer diagnosis: A review of investigations to date. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 2 (1), 33-45 (2012).
  7. El-Shenawee, M., Vohra, N., Bowman, T., Bailey, K. Cancer detection in excised breast tumors using terahertz imaging and spectroscopy. Biomedical Spectroscopy and Imaging. 8 (1-2), 1-9 (2019).
  8. Yamaguchi, S., et al. Brain tumor imaging of rat fresh tissue using terahertz spectroscopy. Scientific Reports. 6 (30124), 1-6 (2016).
  9. Rong, L., et al. Terahertz in-line digital holography of human hepatocellular carcinoma tissue. Scientific Reports. 5 (8445), 1-6 (2015).
  10. Park, J. Y., Choi, H. J., Nam, G., Cho, K., Son, J. In Vivo Dual-Modality Terahertz / Magnetic Resonance Imaging Using Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles as a Dual Contrast Agent. IEEE Transactions on Terahertz Science and Technology. 2 (1), 93-98 (2012).
  11. Ji, Y. B., et al. Feasibility of terahertz reflectometry for discrimination of human early gastric cancers. Biomedical Optics Express. 6 (4), 1413-1421 (2015).
  12. Bowman, T., et al. A Phantom Study of Terahertz Spectroscopy and Imaging of Micro- and Nano-diamonds and Nano-onions as Contrast Agents for Breast Cancer. Biomedical Physics and Engineering Express. 3 (5), 055001 (2017).
  13. Chavez, T., Bowman, T., Wu, J., Bailey, K., El-Shenawee, M. Assessment of Terahertz Imaging for Excised Breast Cancer Tumors with Image Morphing. Journal of Infrared, Millimeter, and Terahertz Waves. 39 (12), 1283-1302 (2018).
  14. Bowman, T. C., El-Shenawee, M., Campbell, L. K. Terahertz Imaging of Excised Breast Tumor Tissue on Paraffin Sections. IEEE Transactions on Antennas and Propagation. 63 (5), 2088-2097 (2015).
  15. Bowman, T., El-Shenawee, M., Campbell, L. K. Terahertz transmission vs reflection imaging and model-based characterization for excised breast carcinomas. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3756-3783 (2016).
  16. Bowman, T., Wu, Y., Gauch, J., Campbell, L. K., El-Shenawee, M. Terahertz Imaging of Three-Dimensional Dehydrated Breast Cancer Tumors. Journal of Infrared, Millimeter, and Terahertz Waves. 38 (6), 766-786 (2017).
  17. Bowman, T., et al. Pulsed terahertz imaging of breast cancer in freshly excised murine tumors. Journal of Biomedical Optics. 23 (2), 026004 (2018).
  18. Bowman, T., Vohra, N., Bailey, K., El-Shenawee, M. Terahertz tomographic imaging of freshly excised human breast tissues. Journal of Medical Imaging. 6 (2), 023501 (2019).
  19. Vohra, N., et al. Pulsed Terahertz Reflection Imaging of Tumors in a Spontaneous Model of Breast Cancer. Biomedical Physics and Engineering Express. 4 (6), 065025 (2018).
  20. Jacobs, L. Positive margins: the challenge continues for breast surgeons. Annals of Surgical Oncology. 15 (5), 1271-1272 (2008).
  21. Moran, M. S., et al. Society of Surgical Oncology--American Society for Radiation Oncology Consensus Guideline on Margins for Breast-Conserving Surgery With Whole-Breast Irradiation in Stages I and II Invasive Breast Cancer. International Journal of Radiation Oncology. 88 (3), 553-564 (2014).
  22. Fitzgerald, A. J., et al. Terahertz Pulsed Imaging of human breast tumors. Radiology. 239 (2), 533-540 (2006).
  23. Ashworth, P. C., et al. Terahertz pulsed spectroscopy of freshly excised human breast cancer. Optics Express. 17 (15), 12444-12454 (2009).
  24. Doradla, P., Alavi, K., Joseph, C., Giles, R. Detection of colon cancer by continuous-wave terahertz polarization imaging technique. Journal of Biomedical Optics. 18 (9), 090504 (2013).
  25. Reid, C. B., et al. Terahertz pulsed imaging of freshly excised human colonic tissues. Physics in Medicine and Biology. 56 (1), 4333-4353 (2011).
  26. Teraview. Teraview.com. , Available from: https://teraview.com (2019).
  27. Orosco, R. K., et al. Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers. Scientific Reports. 8 (1), 1-9 (2018).
  28. Bowman, T., et al. Statistical signal processing for quantitative assessment of pulsed terahertz imaging of human breast tumors. 2017 42nd International Conference on Infrared, Millimeter, and Terahertz Waves (IRMMW-THz). , Cancun 1-2 (2017).
  29. Gavdush, A. A., et al. Terahertz spectroscopy of gelatin-embedded human brain gliomas of different grades: a road toward intraoperative THz diagnosis. Journal of Biomedical Optics. 24 (2), 027001 (2019).

Tags

الهندسة، العدد 158، أبحاث السرطان، تصوير انعكاس تيراهيرتز، التحليل الطيفي لانتقال تيراهيرتز، أورام سرطان الثدي البشري، مؤشر الانكسار، معامل الامتصاص
تيراهيرتز التصوير وبروتوكول التوصيف لأورام سرطان الثدي المكوس حديثا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vohra, N., Bowman, T., Bailey, K.,… More

Vohra, N., Bowman, T., Bailey, K., El-Shenawee, M. Terahertz Imaging and Characterization Protocol for Freshly Excised Breast Cancer Tumors. J. Vis. Exp. (158), e61007, doi:10.3791/61007 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter