Summary
新しく切除されたヒト乳癌腫瘍は、新鮮な組織処理プロトコルに従ってテラヘルツ分光法およびイメージングを特徴とする。組織位置決めは、効果的な特性評価を可能にする一方、将来の術中アプリケーションに適時に分析を提供することを考慮する。
Abstract
この原稿は、パルステラヘルツイメージングと分光法を用いて、新たに切除されたヒト乳房腫瘍を処理、特徴付け、画像化するためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、通常の入射率でテラヘルツ伝送モードを使用し、30°の斜めの角度でテラヘルツ反射モードを使用します。収集された実験データは、電界の時間領域パルスを表す。切除された組織上の固定点を透過するテラヘルツ電界信号を処理し、解析モデルを介して、組織の屈折率および吸収係数を抽出する。ステッパーモータスキャナを利用して、テラヘルツ放射パルスは、異なる組織領域の平面画像を提供する腫瘍上の各ピクセルから反射される。画像は、時間または周波数領域で表示することができます。さらに、各画素における屈折率および吸収係数の抽出データは、腫瘍の断層テラヘルツ画像を提供するために利用される。このプロトコルは、癌性組織と健康組織の明確な分化を示す。一方、プロトコルに付着しないと、気泡が存在し、流体が腫瘍表面に残ることによる騒がしい画像または不正確な画像が生じる可能性があります。このプロトコルは、乳房腫瘍の外科的マージン評価のための方法を提供する。
Introduction
テラヘルツ(THz)イメージングと分光法は、過去10年間で急速に成長している研究分野です。0.1~4 THzの範囲で、より効率的で一貫性のあるTHzエミッタの開発が続く中、アプリケーションは1.THzが約束と著しい成長を示している分野の1つは、生物医学分野2である。THz放射は、固定組織3の分析に一般的に使用される電力レベルにおいて非イオン化および生物学的に安全であることが示されている。その結果、THzイメージングおよび分光法は、水分量などの様々な組織特徴を分類・分化して、火傷の損傷および治癒4、肝硬変5、および切除組織6,77における癌を示すために用いられてきた。,特に癌評価は、臨床的および外科的応用の可能性の広い範囲をカバーし、脳8、肝臓9、卵巣10、胃腸管11、および乳房7、12、13、14、15、16、17、18、1912,13,14,15,16の癌について調査されている。17,18,197
乳癌のTHzアプリケーションは、主にマージン評価を介して乳房温存手術、または乳房切除術をサポートすることに焦点を当てています。乳房全体を除去する完全乳房切除術とは対照的に、乳房切除術の目的は、腫瘍および周囲の健康な組織の小層を除去することである。切除された組織の外科的マージンは、サンプルがホルマリンに固定され、切り離され、パラフィンに埋め込まれ、顕微鏡上の4μm-5 μmのスライスに取り付けられると、病理学を介して評価されます。このプロセスは時間がかかることがあり、正のマージンが観察された場合は後で二次外科的処置が必要です。米国放射線腫瘍学会の現在のガイドラインは、この正のマージンを、表面レベルのマージンインク21に接触する癌細胞を有すると定義している。高吸収水和組織のTHzイメージングは、主に、迅速なマージン評価の外科的ニーズを満たすのに十分な組織タイプに基づいて、いくつかの様々な浸透を有する表面イメージングに限定される。外科的設定中のマージン状態の迅速な分析は、外科的費用とフォローアップ処置率を大幅に減少させるであろう。現在までに、THzはホルマリン固定、パラフィン埋め込み(FFPE)組織における癌と健康組織の区別に有効であることが証明されているが、新たに切除された組織における癌の確実な検出を提供するために追加の調査が必要である7。
このプロトコルは、バイオバンクから得られた新しい切除されたヒト組織サンプルに対してTHzイメージングおよび分光分析を行うためのステップを詳述する。切除されたばかりのヒト乳癌組織に基づいて構築されたTHzアプリケーションは、特に病院と統合されていない研究グループによって、公表された研究7,187、18、22、23ではほとんど使用されていません。,22,23切除された新しい組織の使用は、他の癌の適用にも同様にまれであり、ほとんどの非乳癌癌例は大腸癌24,25,25について報告されている。その理由の1つは、研究に使用されているTHzシステムが外科的ワークフローの一部でない限り、FFPE組織ブロックは、新たに切除された組織よりもはるかに簡単にアクセスして取り扱いやすいということです。同様に、ほとんどの市販の実験室THzシステムは、新鮮な組織を処理する準備ができておらず、細胞株の成長を使用する段階にあるか、動物モデルからの切除された組織を見始めただけです。THzを術中の設定に適用するには、分析が標準的な病理を行う能力を妨げないように、新鮮な組織のためにイメージングと特性評価のステップを事前に開発する必要があります。本来は術中を意図していないアプリケーションでは、新しい組織の特性評価は、生体内のアプリケーションと分化に向けて取り組むために取り組まなければならない困難なステップです。
この研究の目的は、商用THzシステムを使用して新しく切り出した組織のためのTHzアプリケーションのガイドラインを提供することです。このプロトコルは、マウス乳癌腫瘍13、17、19に対する19THzイメージングおよび分光法システム26上17で開発され、バイオ,バンク7、1818から得られたヒト外科7組織に拡張された。このプロトコルは乳癌に対して生成されたが、同じ概念を同様のTHz画像化システムおよび成功がマージン評価27に依存する手術で治療される他のタイプの固形腫瘍癌にも適用することができる。切除された組織に関してかなり少量のTHz結果が公表されているため、これはTHzイメージングおよび特性評価のための新鮮な組織処理のプロトコルに焦点を当てた著者の知識にとって初めての研究です。
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Protocol
このプロトコルは、アーカンソー大学の環境安全衛生部門が設定したすべての要件に従います。
1. 組織の取り扱い領域を設定する
- ステンレス製の金属トレイを取り、図1に示すようにバイオハザードバッグで覆います。生物学的組織の任意の処理は、トレイ領域内で行われます(すなわち、組織処理領域)。
- 実験室用ピンセット、ティッシュワイプ、ペーパータオル、フィルターペーパーパック、ティッシュ染料ボトル、漂白剤ボトル、エタノールボトルをトレイの周りに用意し、必要に応じて簡単にアクセスできるようにします。使用済みの組織、ワイプ、手袋をバイオハザード材料表面に保管し、プロトコルの最後に廃棄します。
- 50 mL 遠心分離管に最大45 mLの10%中性緩衝ホルマリンを充填し、ティッシュハンドリングトレイ近くの遠心分離機収納トレイに入れます。
図1:組織取り扱い領域の設定この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
2. THz透過分光のための新乳がん腫瘍の取り扱い
注意:生きた組織を扱う前に、ニトリルの手の手袋、目の保護ゴーグル、フェイスマスク、およびラボコートを着用してください。常に組織を処理し、手で直接それらに触れないように実験室のピンセットを使用してください。密閉容器の外側の新鮮な組織またはスキャン段階ですべての作業は、ステップ1.1で確立された組織の取り扱い領域で行われるべきである。
注:この研究で取り扱われたすべての組織は、Dulbeccoの修正イーグルの培地(DMEM)とバイオバンクからの抗生物質溶液に出荷されました。
- DMEM溶液からバルク腫瘍を取り除き、ティッシュハンドリング領域のペトリ皿に入れます(図2Aを参照)。
- グロス検査から、小片を切り分けて伝達特性を調べるための別個の腫瘍領域を特定します。図 2Bに示すように、ステンレス鋼のロープロファイルブレードを使用して、特定されたポイントから腫瘍の厚さ 0.5 mm のセグメントを切断します。図 2Cに示すように、このスライスされたセクションを、液体サンプル ホルダーに 0.1 mm の厚さのスペーサーを持つ 2 つの石英窓の間に配置します。
図2:THz透過分光測定のための腫瘍断面化。(A)バルク腫瘍の写真。(B)バルク腫瘍から切り取られた腫瘍の小切片(0.5mm)の写真。(C)分光測定用に0.1mmのポリテトラフルオロエチレンスペーサーを用いて、2つの石英窓の間の液体サンプルホルダーに置かれたスライスされた腫瘍セクション。図は、Spieの許可を得てT.ボウマンら18から再公開されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
3. THz透過分光測定
- モジュールハンドルをコアシステムの取り付けポストの上に位置合わせし、ステージをシステムにスライドさせて、THzコアチャンバー内にトランスミッション分光モジュールをセットします。図 3Aに示すように、モジュールの右上隅と左下隅にある 2 つの取り付けネジを締めます。
- サンプル空間から水蒸気を除去するために、分光法の全段階で5 L/min(LPM)で乾燥窒素ガスでシステムをパージします。
- THzシステムに接続されたデスクトップからTHz透過分光測定ソフトウェアを開きます。メインウィンドウが開きます。
- ウィンドウの上部にある [スキャン] タブをクリックします。[スペクトル スキャンの設定]ウィンドウが表示されます。ウィンドウ右上の[計測モード]タブのドロップダウンメニューから、[送信]を選択して透過分光法を設定します。ピークが自動的に表示されない場合は、[手動ピーク検索]タブの[有効]オプションをオンにし、手動で光遅延をステップ実行してピークを表示します。
-
30 分のパージの後、以下の手順に従って、航空参照信号を記録します。
- スペクトル スキャンのセットアップ ウィンドウの[スキャンの設定] タブで、参照ファイルの適切な名前を入力し、Num Scansを 1,800 に設定し、[開始遅延(s)]を 0 に設定します。その他の設定は既定値のままにします。
- スキャン設定ウィンドウで[基準を測定]をクリックして、空気リファレンスの測定を行います。次に[サンプルを測定]をクリックして、約1分で1,800信号のサンプル平均として、空気を介して伝送信号を測定します。
図3:THz透過分光モジュールのセットアップ(A)伝送モジュールが搭載されたTHzコアチャンバー。(B)液体サンプルホルダーの写真。(C)測定のためにコアチャンバーの内部に置かれるサンプルホルダー。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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図 3Bに示すように、液体サンプルホルダーの 2 つの石英窓を測定します。
- 2つの石英窓を間にスペーサーを入れずに液体サンプルホルダーに置きます。
- THzコアチャンバーを開きます。液体サンプルホルダーを透過分光モジュールに取り付けます(図3Cを参照)。チャンバーを閉じます。
- メイン ウィンドウの [スキャン] タブをクリックします。クォーツサンプルに対して手順 3.5.1 ~ 3.5.2 を繰り返しますが、開始遅延(s)を 900 に更新します。これにより、測定前に水蒸気をパージする時間が可能になります。
- 追加サンプルのリファレンスとしてクォーツを使用する場合は、[スキャン設定]の下にある[参照をクリア]タブをクリックします。これにより、空気参照がクリアされます。次に、[基準を測定]タブをクリックして、新しい基準としてクォーツ測定値を記録します。
- 2つの石英窓の間にスライスされた腫瘍セクションを液体サンプルホルダーの内側に置き、チャンバー内にホルダーを配置して、組織の単一ポイント伝送測定を行います。測定を記録するには、ステップ3.6.3を繰り返します。
- 測定が完了したら、液体サンプルホルダーをチャンバーから取り出し、ティッシュ処理用に指定された領域に持って行きます。液体サンプルホルダーを分解し、組織拭き取りでクォーツの窓から腫瘍セクションを拭き取り、使用済み組織ワイプを同じトレイに入れて、他のバイオハザード廃棄物と一緒にバイオハザードバッグに処分します。
- 必要に応じてステップ 2.2、3.7、および 3.8 を繰り返して、追加の腫瘍スライスを特徴付けます。測定が完了したら、メインウィンドウに移動し、[ファイル]タブをクリックして測定データを保存します。ソフトウェア ウィンドウを閉じます。
4. THz反射モードイメージングのための新鮮な乳癌腫瘍の取り扱い
- DMEMと抗生物質溶液から新鮮な腫瘍サンプルを取り除き、ペトリ皿の上に置きます。総検査を使用して、十分に平坦で、血液がほとんどなく、血管が少ない、画像化される腫瘍の側面を選択する。可能であれば、血液や血管を持つ画像組織を避けてください。
- 図4Aに示すように、グレード1の濾紙に画像化される側に腫瘍を置き、過剰なDMEMを乾燥させ、腫瘍から体液または分泌物の組織をクリアする。紙が飽和するにつれて、濾紙の腫瘍を乾燥した場所に再配置します。腫瘍を約5分間乾燥させます。
図4:THzイメージング用の新鮮な腫瘍サンプル調製物。(A)濾紙に腫瘍を置いて乾燥させる。(B)過剰な液体を吸収するために、組織ワイプパッドを用いて、ポリスチレンプレート上に配置された腫瘍。(C)腫瘍は、方向を追跡し、気泡をチェックするために下から見た。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- トランスミッション分光モジュールをアンマウントし、図5Aに示すように、THzコアシステムに反射イメージングモジュール(RIM)ミラーベースを設定します。ミラーを設定した後、RIM スキャンステージをミラーベースの上に取り付け、それをコアシステムにねじ込みます(図 5Bを参照)。
- サンプルコンパートメントから水蒸気を除去するイメージング手順の前に、5 LPMで乾燥窒素ガスでシステムを30分間パージします。30分後、システムが使用されている残りの時間は、乾燥窒素ガスの量を3 LPMに減らします。
- 直径37mmの走査窓に、約1.2mmのポリスチレンプレートを置き、スキャン窓をポリスチレンプレートとともにサンプルステージに中央に配置します。
図 5: リフレクション イメージング用のシステム セットアップ(A)反射イメージングモジュールミラーベース。(B) スキャン段階。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
注:他の厚さやプレート材料はステップ4.5に適していますが、均一な厚さとTHz信号を妨げないように十分な吸収量が低い必要があります。
- THzシステムに接続されたデスクトップからTHz反射イメージング測定ソフトウェアを開きます。ウィンドウがポップアップ表示され、特定の機能に対していくつかのダイアログ・アイコンが表示され、THz フィールド・プロット用の 2 つのサブウィンドウ (任意の単位 a.u.) がそれぞれ時間と頻度に対して表示されます。
- RIM セットアップのパラメータを設定するには、ウィンドウ上部にある[イメージ パラメータ]ダイアログアイコンをクリックします。画像取得パラメータウィンドウがポップアップ表示されます。リフレクションイメージングを設定するには、[テンプレート]タブのドロップダウンメニューからRIMを選択します。OKを押して、ソフトウェアのメインウィンドウに戻ります。
- メイン ウィンドウで、[固定小数点スキャン] アイコンをクリックします。これにより、THzアンテナがアクティブになり、ポリスチレンプレート上の単一ポイントから、インシデントTHz信号の送信と反射THz信号の受信が開始されます。
- メインウィンドウの上部にあるモーターステージダイアログアイコンをクリックします。モーターコントロールウィンドウが開きます。前方/逆方向矢印をクリックして、メインウィンドウのポリスチレンからの反射パルスを中央に移動して、光遅延軸を調整します。
注:光遅延軸を調整した後、図6に示すように、2つのパルスがウィンドウに現れるはずです:ポリスチレンプレートの下側の界面から1つ(一次反射)、およびポリスチレンプレートの上部インターフェイスからの1つ(二次反射)。。 -
ポリスチレンプレートからの一次反射を窓出し、二次反射を窓に入れ、イメージング手順中に組織からの反射に寄与する。これは 2 つの手順で行います。
- まず、メインウィンドウの上部にある[DAQ設定]ボタンをクリックして、[DAQ設定]ダイアログウィンドウを開きます。光遅延値を 5 V (デフォルト) から 4 V に変更します。
- 次に、2次パルスのミニマが最も強くなるまで、走査段階のマイクロメータスケールで走査ステージの垂直位置を調整します。モータコントロールウィンドウで軸の光遅延を調整し、測定対象の反射信号の範囲外に一次反射を配置します。
注:厚さ1.2mmのポリスチレンプレートの場合、タイムドメインウィンドウの光遅延軸上で二次反射最小ピークが約-0.3mmの場合、一次反射が窓出されます。
図6:ポリスチレンプレートの下側および上面からのTHz反射。(A)THz信号が1.2mmの厚いポリスチレン板に入り、反射した。(B)ポリスチレンからの一次および二次的なTHz時間領域信号を測定した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- サンプルステージを平準化し、参照信号を記録します。
- 各軸(A軸とB軸)上で、サンプルウィンドウのエッジ近くのポリスチレンプレート上の位置を示す2つの点を選択します。たとえば、-15 mm ~15 mm の A 軸の場合、2 つの位置ポイントは -10 mm と 10 mm です。-15 mm から 15 mm までの B 軸の場合、2 つの位置ポイントは -10 mm および 10 mm です。
- モーターコントロールダイアログボタンをクリックして、モーターコントロールウィンドウを開きます。モーターの位置を調整しながらタイムドメイン信号が表示されるように、モーター制御ウィンドウとメインソフトウェアウィンドウを再配置します。A 軸と B 軸の両方を 0 mm に設定します。
- 次の手順を使用して、A 軸をレベル設定します。例として、-10 mm ~10 mm の範囲を使用します。
- モーターコントロールウィンドウで、A軸の値を0から-10に変更し、Enterキーを押します。ステージはA軸上の-10 mmの位置に移動し、メインウィンドウ上の信号位置のシフトが観察されます。
- 図5Bに示すスキャン段階で調整可能なマイクロメータスケールを使用して、信号の最小ピークをステップ4.10.2で設定した位置に戻します。
- A軸の値を+10に変更し、ヒット入力します。ステージは-10 mmの位置からA軸上の+10 mmの位置に移動し、信号のシフトが再び観測されます。信号が前の位置から移動した方向と距離をメモし、A 軸の値をもう一度 -10 に変更します。信号はステップ 4.11.5 で設定された位置に戻ります。
- 図 5Bに示すように、スキャン段階の A 軸上でレベリングねじを回転させ、信号をシフトして、元の位置から移動したのと同じ方向に 2 倍の距離にします。スキャンステージのマイクロメーターを使用して、信号を元の位置(-0.3 mm(ポリスチレン1.2mm)に戻します。
- +10 と -10 の信号が等しく、両方の位置のピークが元の位置(光軸の-0.3 mm)に焦点が合うまで、ステップ 4.11.6 ~ 4.11.7 を繰り返します。
- A 軸の平準化が完了したら、A 軸の値を 0 に変更し、B 軸についても同じ手順を繰り返します。モータ制御ウィンドウの B 軸の値を 0 から最も正の値 (たとえば +10 mm) に変更します。また、レベリング中に、図5Bに示す走査ステージのB軸にレベリングスクリューを使用します。
- 両方の軸が平準化されたら、A軸とB軸の両方を0 mmに戻します。 Motor Control Window
- この信号を参照として記録します。
- 設定された[DAQプロパティ]ウィンドウに移動します。平均値を 5 に変更し、その他のすべてのパラメーターをデフォルトのままにします。
- [新しい参照] をクリックします。ウィンドウの右上にある平均カウンタは、0 ~ 20 の間でカウントされます。カウンタが 20 に達したら、平均値を 1 に変更し、[OK]をクリックします。ポリスチレンからの反射信号は、後で撮影したスキャンの基準として保存されます。
注:THzイメージング手順のみを実行する必要がある場合は、DMEM溶液から腫瘍組織を取り出す前に、ステップ4.3〜4.14を実行することをお勧めします。
- 走査段階の窓を覆うポリスチレンの版に腫瘍を取付ける。
- スキャン段階から撮像窓を取り外し、組織の取り扱い領域に持って行きます。図4Bに示すように、ポリスチレンプレートに腫瘍を置きます。
- プレートと腫瘍の間に有意な気泡がないことを確認します。気泡が観察された場合は、ピンセットで腫瘍を押すか、腫瘍を持ち上げ、空気の隙間が最小限になるまでゆっくりとポリスチレンに転がします。
- 図 4Bに示すように、テスト サンプルの周りに一定の間隔で吸収スペーサーを配置します。腫瘍の上に別のポリスチレンプレートを置き、腫瘍表面をできるだけ平らにするために穏やかに押します。サンプルウィンドウ上のこのポリスチレン腫瘍 -ポリスチレン配置をテープダウンします。
- 図 4Cに示すようにサンプル ウィンドウを反転し、腫瘍の写真を撮って、その向きを記録します。腫瘍を含むサンプルウィンドウをスキャン段階に戻します。
- [イメージ パラメータ ダイアログ]ボタンをクリックして、[画像取得パラメータ]ウィンドウを開きます。撮像ウィンドウで腫瘍の位置を完全に囲むには、Axis1min、Axis1max、Axis2min、およびAxis2maxの値を設定します。 Axis1min Axis1max Axis2min
注: 既定では、軸 1 は A 軸、軸 2 は B 軸です。 - 撮像スキャンの場合、Axis1stepとAxis2stepを 0.2 mm に設定します。
注:Axis1stepとAxis2stepを設定すると、スキャンプロセス中にステッパーモーターのステップサイズが200μm単位に設定されます。[画像取得パラメーター ] ウィンドウで、スキャン時間の合計を見積もることができます。 - メイン ウィンドウの [計測] タブをクリックし、[フライバック 2D スキャン] オプションを選択します。ポップアップ表示されるウィンドウで、スキャン データを保存するディレクトリとファイル名を指定します。
5. 組織病理学の手順の準備として、新鮮な組織の後処理
- スキャンプロセスが完了したら、サンプルウィンドウ、ポリスチレンプレート、およびサンプルをコアTHzシステムから取り外し、有害廃棄物用に指定された領域に移動します。ポリスチレンプレートから腫瘍を取り除き、腫瘍に匹敵する大きさの平らな段ボールの上に置きます。腫瘍の向きがポリスチレンと同じで、イメージング面が段ボールに触れていることを確認してください。
- 綿棒を赤い組織染料に浸し、腫瘍の左端が段ボールに接触する場所まで腫瘍の左側を染色する。同様に、腫瘍の右側を青い組織染料で染色する。図7Aに示すように、赤い汚れと青色の汚れを結ぶ黄色の組織色素のラインで腫瘍の露出面を染色する。
注:インクがホルマリン溶液を染色するのを防ぐために、組織に薄い層のみを塗布する。これは、ティッシュを染色する前に別の表面に綿棒を手を出すか、または余分な染料を拭き取るためにきれいな綿棒を使用することによって達成することができる。染料が皮膚や衣服に接触しないようにしてください。この腫瘍染色プロセスは、腫瘍の画像化側およびその向きに関する情報を病理学者に提供するための参考として行われる。
図7:THzイメージング後の腫瘍の後処理。(A)腫瘍は、段ボールホルダーに下向きに置かれ、組織マーキング染料で染める。(B)フィルターペーパーは、腫瘍の上に置かれ、接触を維持するためにテーピング。(C)10%中性緩衝ホルマリン溶液に浸漬し、パラフィルムで密封されたダンボールに固定された染色された腫瘍。Cこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- インクを3~4分ほど乾かします。腫瘍の上に置き、図7Bに示すように、フィルター用紙と段ボールの周りにテープを完全に巻き付けます。テープとフィルターペーパーは、重大な圧力を加えることなく、段ボールに対して腫瘍を固定する必要があります。
- 図7Cに示すように、10%中性緩衝ホルマリン溶液に貼り付けた染色組織を10%中性緩衝ホルマリン溶液に浸し、パラフィンフィルムを用いて遠心管を密封する。チューブラベルのサンプルのサンプル数、日付、組織タイプ、腫瘍番号を指定します。さらに病理処理のために腫瘍を病理学者に送る。
6. 有害廃棄物処理
- 図 8に示すように、トレイを覆うために使用されるバイオハザード バッグと共に、組織ハンドリング トレイからすべての廃棄物を収集し、新しいバイオハザード バッグに入れます。建物内の指定された生物危険廃棄物領域にバッグを持参し、廃棄物の集荷のための環境安全衛生(EH&S)部門との約束を設定します。10%漂白剤溶液とエタノールでテーブル上のティッシュハンドリングトレイとその周辺領域をきれいにしてください。
図8:生物危険廃棄物袋の写真。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- スペーサーとクォーツ窓、腫瘍が取り付けられたサンプリングウィンドウ、ポリスチレンプレート、および実験室用ピンセットを洗浄領域に持って行きます。すべての材料を水ですすい、次に10%漂白液を流し、必要に応じてペーパータオルで拭いて組織の破片を取り除きます。水で再び洗い流し、アルコノックス溶液でスクラブし、十分に洗い流します。ガラスおよびプラスチック製品の場合は、70%イソプロピルアルコールですすいで乾燥させます。
注:腫瘍がホルマリンに入り、サンプル空間がクリーンになると、データ処理は画像化または後の時間と同時に処理できます。
7. THz画像を構築するためのデータ処理
- 保存した .tvl データ ファイルを THz システムからエクスポートします。システムから取得した生データファイルはPythonで書かれ、MATLABデータファイルとして保存する前にPythonで読み取るのが最善です。
- スキャンした新鮮な組織のTHz画像を構築するために、生データマトリックスの第3次元(すなわち、時間次元)のフーリエ変換を使用して、生の時間領域反射画像データを周波数領域に変換する。また、参照データのフーリエ変換も実行します。
注:一般的な周波数領域スペクトルは、0.1 THz~4 THzの範囲のデータを提供する必要があります。 - サンプルデータを参照データで正規化し、次の式19を使用して、f1 = 0.5 THzからf2 = 1.0 THzまでの周波数範囲で正規化されたデータの統合に基づいて電力スペクトルを実行します。
注:ここでE試料は、組織試料及びE参照の周波数領域反射撮像データが、参照信号の単一点反射データの周波数領域である。 - A軸とB軸で定義されたマトリックスの各点で計算されたパワースペクトルデータをプロットして、2次元画像を構築します。これは、パワースペクトルTHz画像と呼ばれます。
注:代わりに断層表示 THz 画像を取得する方法については、手順 7.5 ~ 7.7 で詳しく説明します。 - 特性評価の場合、次の式18を使用して、潜在的な組織特性の範囲に対する理論周波数依存反射を計算します。
注: ここでρT,ijは領域iと領域j;djの間の複雑なフレネル反射係数であり、領域jの厚さであり、θjはスネルの法則による発生角に関連する領域jにおける伝搬角度です。
は領域jの複素伝搬係数であり、ここで、ωは角周波数、cは真空中の光の速度、njjは屈折率の実部、αabs、jは吸収係数18である。領域1は空気、領域2はポリスチレンプレート、領域3は組織である。 - 領域3(n33およびαabs,3)に対するユーザ定義屈折率と吸収係数の範囲に対して、式(2)の反射を計算し、各点で測定された信号と比較して、マグニチュードと位相の平均二乗誤差を計算します。
注:屈折率と吸収係数の解決策は、誤差が最も低い値のペアです。 - 各画素で抽出された屈折率と吸収係数データ(n33およびαabs,3)から断層表示THz画像を構築します。病理医から得られた病理スライド画像と比較して腫瘍領域を解析する。代表的な結果を図 9に示し、図 10 および図 11のプロトコルへの準拠が不十分な例を示します。
は領域jの複素伝搬係数であり、ここで、ωは角周波数、cは真空中の光の速度、njjは屈折率の実部、αabs、jは吸収係数18である。領域1は空気、領域2はポリスチレンプレート、領域3は組織である。透過分光データを用いた組織の電気的性質の抽出
- THz透過分光測定ソフトウェアのメインウィンドウで、[ファイル]タブに移動し、[エクスポート]オプションをクリックします。ウィンドウがポップアップして、エクスポートするデータタイプとサンプルを選択します。クォーツおよび組織サンプルの測定に対して、透過率および透過相のデータタイプを選択します。
- 次の式15を使用して、潜在的な組織特性の範囲に対する理論周波数依存の伝達を計算します。
注:サンプル
とリファレンスの設定に対するフレネル透過係数の比率を次に示します。γ1とγ3は、それぞれ空気と組織の複雑な伝播定数です。そしてdは組織の厚さである。一般に、伝播定数は
.ñは、 として
定義される複素屈折率であり、nは屈折率の実部分です。cは光の速度です。ωは角周波数です。αabsabsは吸収係数15である。 - 方程式(3)における伝送の大きさと位相と、ユーザ定義のnおよびαabs値の範囲に対するシステムからの測定データとの間の、結合された平均平方誤差を計算する。
注:屈折率と吸収係数の解決策は、誤差が最も低い値のペアです。 - 抽出された屈折率と吸収係数データを0.15~3.5 THzの周波数範囲に対してプロットします。
とリファレンスの設定に対するフレネル透過係数の比率を次に示します。γ1とγ3は、それぞれ空気と組織の複雑な伝播定数です。そしてdは組織の厚さである。一般に、伝播定数は
.ñは、 として
定義される複素屈折率であり、nは屈折率の実部分です。cは光の速度です。ωは角周波数です。αabsabsは吸収係数15である。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
バイオバンクから受け取ったヒト乳癌腫瘍検体の上記プロトコルに#ND14139したTHz画像化結果18を図9に示す。病理報告によると、#ND14139腫瘍は、左乳房乳房乳房乳房乳房切除手術を介して49歳の女性から得られたI/IIグレードの浸潤性乳管癌(IDC)であった。腫瘍の写真を図9Aに示し、図9Bの病理画像、およびプロトコルで(1)式を用いて得られたTHzパワースペクトル画像を図9Cに示す。病理画像の評価は、オクラホマ州立大学のコンサルティング病理学者によって行われました。THz画像を病理画像と相関させると、癌領域(すなわち、図9Cの赤色領域)が脂肪領域よりも高い反射を示していることは明らかであった(すなわち、図9Cの青色領域)。図9Cの癌領域の中心に近い青色の円は、イメージングプロセス中に腫瘍の下に気泡が存在したためであった。
上記の論示されたモデルを用いて得られた腫瘍の電気的特性に基づく断層画像も、各画素(合計で2,477ピクセル)に対して提示される。吸収係数(cm-1)データ(α-画像)と屈折率(n-image)の周波数0.5 THz及び1.0THzで得られた腫瘍の断層画像をそれぞれ図9D、9E、9F、9Gに示す。 9G周波数が増加するにつれて、癌と脂肪ピクセルの計算された吸収係数(cm-1)値が増加し、癌ピクセルは両方の周波数で脂肪よりも高い値を示した。これに対し、両組織の屈折率は、周波数が増加するにつれて減少した。なお、測定された位相は、撮像段階のレベリング、ポリスチレン板厚、ステッパーモータジッタのマイクロメートルスケール変動の影響を受け、周波数が増加することに留意すべきである。例えば、図9Eおよび9Gで観測された水平線は、走査プロセス中にステッパーモータによって導入された小位相シフトによるもので、低周波数では観測されなかった。
図9:THzイメージング技術を用いた乳がん腫瘍#ND14139の解析(A)腫瘍の写真。(B)腫瘍の低電力病理画像。(C)周波数範囲を超える THz 電力スペクトル画像 0.5 THz – 1.0 THz(D) THz 断層線吸収係数画像を 0.5 THz で取得した。Dこの画像は、腫瘍の生反射画像データから各画素で抽出された吸収係数データを用いて構築した。(E)1.0THzで得られる吸収係数画像(F)屈折率画像E(n-画像)0.5THzで得た。この画像は、腫瘍の生反射画像データから各画素で抽出された屈折率データを用いて構築した。(G)屈折率画像(n- 画像) 1.0 THzで得られた図。18この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9で説明したTHzの結果は、記載されたプロトコルに従って正常に得られた。組織の取り扱いが不十分な場合、誤解を招く画像化結果を招く可能性があります。例えば、ヒト乳癌腫瘍に対する図10のTHz画像化結果は、不十分な乾燥の効果を示す#ND10405。組織における過剰なDMEM溶液は、図10B28における腫瘍のTHzパワースペクトル画像を支配し、図10A2828に示す病理画像と相関しなかった高反射を有する。28これは偽陽性の結果をもたらし、腫瘍における癌のより大きな存在を示唆した。図10C19、10D19に見られるように、DMEMは同様に高い屈折率10D19と水への吸収係数を示したので、イメージングの前に腫瘍を適切に乾燥させることが強く推奨されています。19
図10:フィルターペーパーを用いた乾燥を行わずにDMEM溶液から取り出した腫瘍イメージングに対する効果。(A)腫瘍#ND10405の低電力病理画像。(B) 周波数範囲を超える腫瘍#ND10405のTHzパワースペクトル画像 0.5 THz–1.0 THz(C) DMEM、PBS、および水の透過屈折率プロット 0.15 THz~3.5 THz(D) DMEMの伝送吸収係数(cm-1)プロット PBS、および0.15 THz~3.5 THzのC水と、図10A、10Bは、IEEEと図10Cの許可を得てT.ボウマンら28から再公開され、図10DはIOP出版の許可を得てN.Vohraら19から再公開されています。 Figure 10C
プロトコルへの不十分な付着の別の例は、図11に腫瘍#ND11713について示されている。この場合、発像手順のために腫瘍をプレートに配置した際に、ポリスチレンプレートと腫瘍の間の気泡は除去されなかった。この結果、図11BのTHz画像全体の低反射のスポットがいくつか得られ、図11Aの病理との正確な比較が妨げられた。したがって、プレートに腫瘍を置いた後に気泡が観察された場合は、ピンセットで押すか、腫瘍を持ち上げて、空気の隙間が取り除かれるまでゆっくりとポリスチレンに転がします。
図11:ポリスチレンプレートと腫瘍の間に気泡が存在することによって起こされるTHz画像のアーチファクト。(A)腫瘍#ND11713の低電力病理画像。(B) 0.5 ~1.0 THz の周波数範囲を超える腫瘍#ND11713の THz パワースペクトル画像。
同じサンプルに対する18透過分光結果18(#ND14139)を図12に示します。腫瘍切片は、ポイント
から
取り出し、図12Aで、プロトコルに従って特徴付けた。いずれも、図12Bの病理画像に従って腫瘍中の癌組織領域から採取した。両方の腫瘍切片の抽出吸収係数と屈折率を図12C,Dに示す。両方の点は、全体の周波数範囲のための良好な一致を示しました。図12Cおよび図12Dの0.15~2THzFigure 12Dの黒色の曲線は、文献23から得られたデータを表し、我々の研究で得られた結果を比較する。
図12:THz透過分光法を用いた乳がん腫瘍#ND14139の特徴付け。(A)腫瘍の2つの選択された点がマークされ、腫瘍の厚さ0.5mmの部分が透過分光測定のために切断されたところから、腫瘍の写真。(B)腫瘍の低電力病理画像。(C) 伝送吸収係数 (cm–1)プロットは、0.15 ~ 3.5 THz の点と.(D) 0.15 ~3.5 THz の点と . 図は、Spieの許可を得てT.ボウマンら18から再公開されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
新鮮な組織の効果的なTHz反射イメージングは、主に2つの重要な側面に依存する:1)組織処理の適切な考慮(セクション2および4.15);;2)ステージ設定(主にセクション4.11)。組織の乾燥が不十分な場合、DMEMおよび他の流体の高い反射による領域の反射および可視化ができなくなる。一方、イメージングウィンドウとの組織接触が悪いと、THz反射画像に低反射のリングまたはスポットが作成され、結果があいまいになります。より良いインターフェースを得るために組織を再配置するなど、イメージングウィンドウとの良好な組織接触を確実にするために余分な努力を払う必要があります。組織の特性評価のために、ステージのセットアップに関する追加の考慮事項は慎重に実装する必要があります。数ミクロンであってもステージの不適切なバランスは、計算された屈折率および組織の吸収係数に有意な変化を引き起こす可能性がある。これはまた、イメージングウィンドウに取り付けるときに組織に圧力をかけ過ぎた結果であり、ポリスチレンプレートの屈下を引き起こす可能性があります。正確な計算を行うためには、特性評価のために選択された基準信号も、人工的な位相シフトを避けるために、画像の同じ位相面から取得する必要があります。
プロトコルを変更できる主な領域は、石英(セクション3.6-3.7)やポリスチレン(セクション4.5から開始)などの組織を取り付けるために使用される誘電体材料にあります。選択された窓材料が均一に厚く、腫瘍との良好なシグナル相互作用を有するのに十分な吸収量が低い限り、他の材料を置換することができる。材料は、適切な位相平面を提供するかどうかを判断するために、事前に評価する必要があります。あるいは、イメージングウィンドウが固定されるシステムでは、空のウィンドウスキャンから計算された位相シフトを特徴付けて、不均一な窓の厚さに対処することができます。病理学者への出荷のために組織がどのように取り付けられるかも、修正の余地があります。組織マーキング染料は慣例的に使用されますが、重要な側面はTHzイメージングと病理の比較を可能にする方法を用意することです。プロトコルのトラブルシューティングの主な問題は、適切なTHz信号を取得し、使用している特定のシステムに依存する適切なウィンドウを確立することです。
任意の新鮮な組織の取り扱い技術の主な制限は、組織が空気にさらされる時間です。このプロトコルは、組織が病理評価の前に分解を避けるために1時間以下の露出を保つことができるよう設計された。これは、画像のステップサイズの選択にも反映されます。このプロトコルのTHzシステムは、50 μm単位で50~500 μmの任意のステップサイズに到達できますが、THz信号のスペクトル含有量により、システムの最大空間分解能は約80μmです。プロトコルの200 μmステップは、約30分の合理的なスキャン時間を維持しながら十分な詳細を提供し、当社のコンサルティング病理学者による腫瘍サンプルの評価は、この量の空気暴露が細胞レベルで観察可能な方法で組織に損傷を与えないと判断した。しかし、ゼラチンなどの材料は、過度の乾燥を伴わない明確なTHzイメージングを提供するために使用することができ、プロトコル29への将来の更新のために調査され得る。時間の効率的な使用のために、乾燥窒素でシステムをパージし、イメージングまたは分光分析を設定するようなステップは、組織がDMEMから除去される前に行うことができます。これは、イメージングに要する時間が、THzイメージングを外科ワークフローに実装する上で重要な要素となる将来の術中アプリケーションにとっても重要です。
このプロトコルを術中に使用することは、腫瘍の外科的マージンを数日または数週間から数分に評価する時間の著しい減少の可能性を表す。これは、THzシステムのハードウェアが将来ステッパーモータースキャナの代わりにTHzカメラを使用するように改良されたときに達成されます。現在、術中に採用されている最も類似した方法は、検体X線撮影であり、放射線科医による解釈のために切除された腫瘍の透過X線画像を撮影し、組織表面に癌があるかどうかを判断する。記載された撮像プロトコルは、組織表面の直接撮像手段を提供する。新しく切除された乳癌腫瘍のプロトコルは、他の種類の新しい切除固形腫瘍8、9、10、119,の特性評価および画像化にも8使用することができる。10,11本稿は、記載されたプロトコルに従って新たに切除された乳房腫瘍をイメージングすることに焦点を当てているが、関連するホルマリン固定パラフィン埋め込み組織ブロックのTHzイメージングも、病理14、15、16、17、1915,16,17,19で検証に成功している。14ここで提案されたものと同様のイメージングプロトコルは、組み込み組織の解析における病理学支援のために開発することができる。
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Disclosures
著者らは、利益相反はないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(NIH)賞#R15CA208798によって資金提供され、一部は国立科学財団(NSF)賞#1408007によって資金提供されました。パルスTHzシステムの資金調達は、NSF/MRIアワード#1228958を通じて得られました。我々は、NIH補助金U42OD11158の支援を受けて、国立疾病研究インターチェンジ(NDRI)によって調達された組織の使用を認める。我々はまた、この研究で取り扱われるすべての組織に対する組織病理学的処置を行ったオクラホマ州立大学のオクラホマ動物疾患診断研究所との共同研究を認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% isopropyl alcohol | VWR | 89108-162 | Contains 70% USP grade isopropanol and 30% USP grade deionized water |
| Alconox powder detergent | VWR | 21835-032 | Concentrated detergent to remove organic contaminants from glass, metal, stainless steel, porcelain, ceramic, plastic, rubber, and fiberglass |
| Bio Hazard Bags | Fisher Scientific | 19-033-712 | Justrite FM-Approved Biohazard Waste Container Replacement Bags |
| Cardboard holder | N/A | N/A | Scrap cardboard to keep tissue imaging face intact when immersed in formalin |
| Centrifuge Tubes | VWR | 10026-078 | Centrifuge Tubes with Flat Caps, Conical-Bottom, Polypropylene, Sterile, Standard Line |
| Cotton Swabs | Walmart | 551398298 | Q-tips Original Cotton Swabs used to dye the tissue |
| Ethyl Alcohol | VWR | 71002-426 | KOPTECH Pure (undenatured) anhydrous (200 proof/100%) ethyl alcohol |
| Eye protection goggles | VWR | 89130-918 | Kimberly-clark professional safety glasses |
| Face Mask | VWR | 95041-774 | DUKAL Corporation surgical masks |
| Filter paper | Sigma Aldrich | Z240087 | Whatman grade 1 cellulose filters |
| Formalin solution | Sigma Aldrich | HT501128-4L | 10% neutral buffered formalin |
| Human freshly excised tumors (Infilterating Ductal Carcinoma (IDC)) | National Disease Research Interchange (NDRI biobank | N/A | A protocol is signed with the NDRI for the type of tumors required |
| IRADECON Bleach solution | VWR | 89234-816 | Pre-diluted Sodium Hypochlorite Bleach solution |
| KIMTECH SCIENCE wipes | VWR | 21905-026 | Kimberly-clark professional Kim wipes |
| Laboratory Coat | VWR | 10141-342 | This catalog number is for medium size coat |
| Laboratory tweezers/Forceps | VWR | 82027-388 | Any laboratory tweezers can be used as long as it does not damage the tissue |
| Liquid sample holder (two quartz windows with a 0.1 mm teflon spacer) | TeraView, Ltd | N/A | 1" diameter, and 0.1452" thick quartz windows |
| Nitrile hand gloves | VWR | 82026-426 | This catalog number is for medium size gloves |
| Nitrogen cylinder | Airgas | NI UHP300 | NITROGEN UHP GR 5.0 SIZE 300 |
| Paper towel | VWR | 14222-321 | 11" x 8.78" Sheets, 1 Ply |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | Flexible thermoplastic. Rolled, waterproof sheet interwound with paper to prevent self-adhesion. |
| Petri Dish | VWR | 470210-568 | VWR Petri Dish, Slippable, Mono Plate (undivided bottom) |
| Polystyrene Plate | Home Depot | 1S11143A | ~ 10 cm x 10 cm square piece cut from a 11" x 14" x 0.05" Non-glare styrene sheet |
| ScanAcquire Software | TeraView, Ltd | N/A | System Software for THz reflection imaging measurements |
| Stainless steel low-profile blade (#4689) | VWR | 25608-964 | Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades |
| Stainless steel metal tray | Quick Medical | 10F | Polar Ware Stainless Steel Medical Instrument Trays |
| Tissue Marking Dyes | Ted Pella, Inc | Yellow Dye #27213-1 Red Dye #27213-2 Blue Dye #27213-4 |
Used to orient excised tissue samples sent to the histopathology laboratory |
| TPS Spectra 3000 | TeraView, Ltd | N/A | THz imaging and spectroscopy system |
| TPS Spectra Software | TeraView, Ltd | N/A | System Software for THz transmission spectroscopy measurements |
References
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