Frisk punkterede menneskelige brystkræft tumorer er karakteriseret med terahertz spektroskopi og billeddannelse efter frisk væv håndtering protokoller. Væv positionering er taget i betragtning for at muliggøre en effektiv karakterisering og samtidig give analyse i tide til fremtidige intraoperative applikationer.
Dette manuskript præsenterer en protokol til at håndtere, karakterisere, og billede frisk punkterede menneskelige bryst tumorer ved hjælp af pulserende terahertz billeddannelse og spektroskopi teknikker. Protokollen omfatter terahertz-transmissionstilstand ved normal incidens- og terahertz-refleksionstilstand i en skrå vinkel på 30°. De indsamlede eksperimentelle data repræsenterer tid domæne pulser af det elektriske felt. Det elektriske feltsignal terahertz, der sendes gennem et fast punkt på det udsondrede væv, behandles ved hjælp af en analysemodel for at udtrække det brydningsindeks og absorptionskoefficienten for vævet. Ved hjælp af en stepper motor scanner, den terahertz udsendte puls afspejles fra hver pixel på tumoren giver en planar billede af forskellige væv regioner. Billedet kan præsenteres i tid eller frekvens domæne. Desuden er de udtrukne data fra brydningsindekset og absorptionskoefficienten ved hver pixel udnyttet til at give et tomografisk terahertz billede af tumoren. Protokollen viser en klar differentiering mellem kræft og sundt væv. På den anden side, ikke overholder protokollen kan resultere i støjende eller unøjagtige billeder på grund af tilstedeværelsen af luftbobler og væske forbliver på tumoroverfladen. Protokollen giver en metode til kirurgisk margener vurdering af bryst tumorer.
Terahertz (THz) billeddannelse og spektroskopi har været et hastigt voksende forskningsområde i det seneste årti. Den fortsatte udvikling af mere effektive og konsekvente THz-udledere inden for intervallet 0,1-4 THz har fået deres applikationer til at vokse betydeligt1. Et område, hvor THz har vist lovende og betydelig vækst er det biomedicinske felt2. THz stråling har vist sig at være nonionizing og biologisk sikker på de effektniveauer, der generelt anvendes til at analysere fast væv3. Som et resultat, THz billeddannelse og spektroskopi er blevet brugt til at klassificere og differentiere forskellige væv funktioner såsom vandindhold til at angive brænde skader og healing4, skrumpelever5, og kræft i punkterede væv6,7. Kræft vurdering især dækker en bred vifte af potentielle kliniske og kirurgiske anvendelser, og er blevet undersøgt for kræft i hjernen8, leveren 9, æggestokkene10, mave-tarmkanalen11, og bryst7,12,13,14,15,16,17,18,19.13
THz ansøgninger om brystkræft er primært fokuseret på at støtte bryst bevare kirurgi, eller lumpectomy, via margin vurdering. Formålet med en lumpectomy er at fjerne tumor og et lille lag af omgivende sundt væv, i modsætning til fuld mastektomi, som fjerner hele brystet. Det punkterede vævs kirurgiske margen vurderes derefter via patologi, når prøven er blevet fastsat i formalin, sektionsopdelt, indlejret i paraffin og monteret i 4 μm-5 μm skiver på mikroskopobjektglas. Denne proces kan være tidskrævende og kræver en sekundær kirurgisk procedure på et senere tidspunkt, hvis en positiv margen er observeret20. De nuværende retningslinjer fra American Society of Radiation Oncology definerer denne positive margen som havende kræftceller, der kommer i kontakt med margenblæk på overfladeniveau21. THz-billeddannelse for hydreret væv med høj absorption er primært begrænset til overfladebilleddannelse med en varierende penetration baseret på vævstype, hvilket er tilstrækkeligt til at opfylde de kirurgiske behov for hurtig marginvurdering. En hurtig analyse af margin betingelser under den kirurgiske indstilling ville i høj grad mindske kirurgiske omkostninger og opfølgning procedure sats. Til dato har THz vist sig effektiv til at skelne mellem kræft og sundt væv i formalin-fast, paraffin-indlejret (FFPE) væv, men yderligere undersøgelse er nødvendig for at give pålidelig påvisning af kræft i frisk udskilles væv7.
Denne protokol beskriver trinene til at udføre THz-billeddannelse og spektroskopi på nyudsondrede humane vævsprøver fra en biobank. THz applikationer bygget på frisk punktafgifter humant brystkræft væv har sjældent været anvendt i offentliggjort forskning7,18,22,23, især af forskningsgrupper ikke integreret med et hospital. Brugen af frisk sondret væv er ligeledes sjældent for andre kræftansøgninger, med de fleste ikke-brystkræft eksempler, der indberettes for tyktarmskræft24,25. En af grundene til dette er, at FFPE væv blokke er langt lettere at få adgang til og håndtere end frisk punkteret væv, medmindre THz-systemet, der anvendes til undersøgelsen er en del af den kirurgiske arbejdsgang. Tilsvarende er de fleste kommercielle laboratorie-THz-systemer ikke parate til at håndtere fersk væv, og dem, der gør, er stadig i færd med at bruge cellelinjevækst eller er først begyndt at se på udsondet væv fra dyremodeller. For at anvende THz på en intraoperativ indstilling kræver, at billeddannelse og karakterisering trin udvikles for frisk væv på forhånd, således at analysen ikke forstyrrer evnen til at udføre standard patologi. For applikationer, der ikke i sig selv er beregnet til at være intraoperativ, karakterisering af frisk væv er stadig et udfordrende skridt, der skal rettes til at arbejde hen imod in vivo applikationer og differentiering.
Formålet med dette arbejde er at give en retningslinje for THz-anvendelse for frisksonderet væv ved hjælp af et kommercielt THz-system. Protokollen blev udviklet på en THz billeddannelse og spektroskopi system26 for murine brystkræft tumorer13,17,19 og blev udvidet til humant kirurgisk væv fremstillet af biobanks7,18. Mens protokollen blev genereret for brystkræft, de samme begreber kan anvendes til lignende THz billeddannelse systemer og andre typer af solid-tumor kræft, der behandles med kirurgi, hvor succes afhænger af margin vurdering27. På grund af en forholdsvis lille mængde af offentliggjorte THz resultater på frisk punktafgifter væv, dette er det første arbejde til forfatternes viden til at fokusere på protokollen for frisk væv håndtering for THz billeddannelse og karakterisering.
Effektiv THz-refleksionsbilleddannelse af friskvæv afhænger primært af to kritiske aspekter: 1) korrekt overvejelse af vævshåndtering (punkt 2 og 4.15); og 2) faseopsætningen (primært afsnit 4.11). Utilstrækkelig tørring af vævet kan resultere i øget refleksion og manglende evne til at visualisere regioner på grund af høje refleksioner af DMEM og andre væsker. I mellemtiden skaber dårlig vævskontakt med billeddannende vindue ringe eller pletter med lav refleksion i THz refleksionsbilledet, der tilslører …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health (NIH) Award # R15CA208798 og delvist af National Science Foundation (NSF) Award # 1408007. Finansiering af det pulserende THz-system blev opnået gennem NSF/MRI Award # 1228958. Vi anerkender brugen af væv indkøbt af National Disease Research Interchange (NDRI) med støtte fra NIH tilskud U42OD11158. Vi anerkender også samarbejdet med Oklahoma Animal Disease Diagnostic Laboratory på Oklahoma State University for at gennemføre histopatologisk procedure på alle de væv, der håndteres i dette arbejde.
70% isopropyl alcohol | VWR | 89108-162 | Contains 70% USP grade isopropanol and 30% USP grade deionized water |
Alconox powder detergent | VWR | 21835-032 | Concentrated detergent to remove organic contaminants from glass, metal, stainless steel, porcelain, ceramic, plastic, rubber, and fiberglass |
Bio Hazard Bags | Fisher Scientific | 19-033-712 | Justrite FM-Approved Biohazard Waste Container Replacement Bags |
Cardboard holder | N/A | N/A | Scrap cardboard to keep tissue imaging face intact when immersed in formalin |
Centrifuge Tubes | VWR | 10026-078 | Centrifuge Tubes with Flat Caps, Conical-Bottom, Polypropylene, Sterile, Standard Line |
Cotton Swabs | Walmart | 551398298 | Q-tips Original Cotton Swabs used to dye the tissue |
Ethyl Alcohol | VWR | 71002-426 | KOPTECH Pure (undenatured) anhydrous (200 proof/100%) ethyl alcohol |
Eye protection goggles | VWR | 89130-918 | Kimberly-clark professional safety glasses |
Face Mask | VWR | 95041-774 | DUKAL Corporation surgical masks |
Filter paper | Sigma Aldrich | Z240087 | Whatman grade 1 cellulose filters |
Formalin solution | Sigma Aldrich | HT501128-4L | 10% neutral buffered formalin |
Human freshly excised tumors (Infilterating Ductal Carcinoma (IDC)) | National Disease Research Interchange (NDRI biobank | N/A | A protocol is signed with the NDRI for the type of tumors required |
IRADECON Bleach solution | VWR | 89234-816 | Pre-diluted Sodium Hypochlorite Bleach solution |
KIMTECH SCIENCE wipes | VWR | 21905-026 | Kimberly-clark professional Kim wipes |
Laboratory Coat | VWR | 10141-342 | This catalog number is for medium size coat |
Laboratory tweezers/Forceps | VWR | 82027-388 | Any laboratory tweezers can be used as long as it does not damage the tissue |
Liquid sample holder (two quartz windows with a 0.1 mm teflon spacer) | TeraView, Ltd | N/A | 1" diameter, and 0.1452" thick quartz windows |
Nitrile hand gloves | VWR | 82026-426 | This catalog number is for medium size gloves |
Nitrogen cylinder | Airgas | NI UHP300 | NITROGEN UHP GR 5.0 SIZE 300 |
Paper towel | VWR | 14222-321 | 11 x 8.78" Sheets, 1 Ply |
Parafilm | VWR | 52858-076 | Flexible thermoplastic. Rolled, waterproof sheet interwound with paper to prevent self-adhesion. |
Petri Dish | VWR | 470210-568 | VWR Petri Dish, Slippable, Mono Plate (undivided bottom) |
Polystyrene Plate | Home Depot | 1S11143A | ~ 10 x 10 cm square piece cut from a 11" x 14" x 0.05" Non-glare styrene sheet |
ScanAcquire Software | TeraView, Ltd | N/A | System Software for THz reflection imaging measurements |
Stainless steel low-profile blade (#4689) | VWR | 25608-964 | Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades |
Stainless steel metal tray | Quick Medical | 10F | Polar Ware Stainless Steel Medical Instrument Trays |
Tissue Marking Dyes | Ted Pella, Inc | Yellow Dye #27213-1 Red Dye #27213-2 Blue Dye #27213-4 |
Used to orient excised tissue samples sent to the histopathology laboratory |
TPS Spectra 3000 | TeraView, Ltd | N/A | THz imaging and spectroscopy system |
TPS Spectra Software | TeraView, Ltd | N/A | System Software for THz transmission spectroscopy measurements |